ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

要約

貪食細胞はそのファゴソーム内侵入する微生物を除去して除去することにより、自然免疫系において主要な役割を果たしている。ファゴソームの成熟は、新生ファゴソームが細胞質内の種々の細胞小器官とコンパートメントよく編成の相互作用を介して抜本的な転換を受けている間、複雑で厳密に調節されたプロセスである。その溶解性と殺菌性とファゴソームを持たせることにより、食細胞の生理機能に必須であるこのプロセスは、リソソームとファゴソームのための成熟の最後と重要な段階であると考えられているファゴリソソームの生合成とファゴソームの融合で絶頂に達する。本稿では、ファゴリソソーム生合成の特徴であるコンテンツ配信を、ファゴソームするリソソームの動的な過程の定性的および定量的分析のための生細胞イメージングベースの方法を説明します。このアプローチは、phagocyのモデルとしてのIgGでコーティングされたマイクロビーズを使用しています管腔リソソーム貨物プローブとしてtosisと蛍光団結合デキストラン分子、タイムラプスイメージング、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用してライブマクロファージにおけるリアルタイムにファゴソームにlysosmalコンテンツの動的配信を追跡するために。ここでは、準備手順や他のラボで、この方法の簡単で正確な展開を可能にするためのステップバイステップの実験、詳細に背景を説明します。我々の記載された方法は、単純な堅牢な、そして最も重要なことは、容易に異なるシステムや様々な食細胞タイプ、機能喪失実験を、異なるプローブの使用などの様々な実験設定でファゴソームの相互作用および成熟を研究するために適合させることができるであり、そして貪食粒子。

概要

マクロファージを含む専門的な食細胞は、免疫系で重要なを果たしている。先天性免疫系における最初の防衛線であることに加えて、それらはまた、それらのシグナル伝達およびロール^1-3抗原^提示を介して適応免疫の活性化において重要な役割を果たす。専門的な食細胞の機能は多面的ですが、ファゴソームの成熟は、プロの食細胞^4,5の殺菌及び抗原処理機能の重要なバックボーンです。受容体を介した貪食や細菌などの貪食ターゲットの取り込み時には、発生期のファゴソームは、相互作用し、エンドサイトーシスネットワークのコンパートメントおよび他のいくつかの細胞小器官⁶の交流の複雑でよく編成シーケンスを通過します。化合物の性質は、これらの細胞の実体だけでなく、規制と交換し、融合事象のタイミングは、管腔ファゴソーム環境とphagosを決定OMALの膜組成と、このように^7、成熟ファゴソーム⁸の運命。

ファゴソーム成熟の生理的関連性は、から逃げる停止またはファゴソーム成熟^9を破壊するために、様々な細胞内病原体によって使用される多様な戦略によって例示される。これらの戦略の最も直接的または間接的にファゴソームの成熟過程の最終的かつ重要な段階を防ぐ：加水分解酵素と成熟ファゴソーム⁷の抗菌要因の大部分とそれらを賦与後期エンドソーム/リソソームコンパートメント....

プロトコル

動物のケアと、このプロトコルのすべての手順は、制度や国のガイドラインに従ってください。

「Π-」あらかじめにより示されている調製物を調製。

1。 BMMSの調製

1. 頚椎脱臼によりマウスのカリングを実行します。
2. 組織から大腿骨と脛骨の骨、無料の骨を削除し、骨髄のアクセシビリティを両端をトリミングします。
3. 次の段階まで氷上で、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを補充し（氷冷PBSまたは氷のように冷たいDMEM培地で骨を保つ。
   注意 ：汚染のリスクを最小限にするために、クラスIIバイオセーフティキャビネットの下に、以下の手順を実施します。
4. 1ミリリットルの注射器に取り付け26（0.45 mm）の針を使用して冷PBS +ペニシリン/ストレプトマイシンを骨髄腔をフラッシュします。
5. 10分間350×gで穏やかな遠心分離によってペレット細胞は、BMM MEDでペレットを再懸濁無菌微生物学イウムとプレートはペトリ皿を被覆されていない。
   1. BMM媒体の準備
      • ダルベッコ改変イーグル培地、DMEM
      • 10％の不活化FCS
      • 20％のマウス線維芽細胞L929細胞株培養上清（マ....

結果

イメージングのための細胞やビーズの正しい準備が非常に重要です。 図1に、BMMSための私達の最適化されたプロトコルに基づいて播種、プローブのロードと、この方法では、最初の画像化手順の概要を示している。これは、プロトコル·パラメータが使用される細胞およびプローブの種類に応じてテストし、最適化することが不可欠である。

プリロードされた細胞に対するIgG被覆ビーズの添加後に、事前定義された倍率設定を維持しつつ、視野が可能な細胞の最大数の潜在的な取り込みイベントの最大数を提供するように選択することが重要であるプロトコルの。 図2に示すように、このアプローチは、各タイムラプスビデオにおける分析可能なファゴソームより多数を提供することができる。各実験セットのビデオ収量当たりのデータポイントを増加させることに加えて、これは、様々なperipheによって導入された変動を減少させるRAL条件とデータの堅牢性を向上させます。

それが可能ならば、信号関連測定手順（ .......

ディスカッション

次のセクションでは、提示された方法とその限界の重要なステップを説明します。さらに、我々は、その解決策の一般的な問題のいくつかを接続可能な修飾を導入し、本手法の利点だけでなく、このアプローチに適し補完的な方法を検討していきます。

ビーズ表面へのIgGの結合を含むビーズの調製は、重要であり、unfresh製剤の使用は避けるべきである。それへの追加では、デキストランが新鮮にあらゆる実験の前に凍結ストック（希釈し、滅菌した）から製造されていることも重要である。それはデキストランの負荷が細胞取り込みおよびコンパートメント分布及び蓄積の一貫性を達成するための正確なスケジュールに従うことが重要である。また、のみならず、同じ顕微鏡のセットアップおよびソフトウェア設定を使用するだけでなく、可能な限り一定の周辺条件を維持することが重要である（ 例えば、テmperature、CO _​​2、湿度、ビード付加技術、 等 ）。別の重要な点は、視野や関心のある細胞の選択である、サンプルは代表的なものである細胞を選択するために撮影開始前に未べきである。 <.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコの改変イーグルスミディアム(D-MEM)	PAA、オーストリア	E15-009
ダルベッコの改変イーグルスミディアムフェノールレッド(D-MEM)	PAA、オーストリア	E15-047
シ胎児血清(FBS)	PAA、オーストリア	A15-151
L-グルタミン	PAA、オーストリア	M11-004
PBS	PAA、オーストリア	H15-002
ペニシリン/ストレプトマイシン	PAA, Austria	P11-010
WillCo-dish®ガラス底皿(35 mm∅、#1.5)	WillCo Wells、オランダ	GWSt-3522
CELLviewTMガラス底皿、35 mm	Greiner Bio one、ドイツ	627871	代替:セグメント化された
カルボキシル化ラテックス微球	Polysciences、USA#	09850	さまざまな直径で利用可能で、3 μm
ポリスチレン微粒子	Kisker Biotech, ドイツ	PPs-3.0COOH
Triton-X 100	ROTH, ドイツ	305.1.3
マウス全体	IgG Rockland, USA	010-0102
EDAC 架橋剤	Sigma-Aldrich, USA	E6383-1g
10 mM Tris	Sigma-Aldrich,USA	T1503
1-ml syringeOmnifix -F	B.Braun、ドイツ	9161406V
26 G針 (0.45*25 mm)	B.Baun, Germany	4657683
RPMI 1640	PAA, Austria	E15-039
Horse Serum	Gibco, USA	16050-122
MES hydrate	Sigma-Aldrich, USA	M2933
0.2 μMシリンジマウントフィルター	ザルトリウス、ドイツ	83.1826.001

ウとして利用可能