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方法論記事

ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

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DOI:

10.3791/51201

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2014年3月10日

 ,  , 
1Research Group Phagosome Biology, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Division of Mycobacterial Research, National Institute for Medical Research

この記事について

要約

貪食細胞はそのファゴソーム内侵入する微生物を除去して除去することにより、自然免疫系において主要な役割を果たしている。ファゴソームの成熟は、新生ファゴソームが細胞質内の種々の細胞小器官とコンパートメントよく編成の相互作用を介して抜本的な転換を受けている間、複雑で厳密に調節されたプロセスである。その溶解性と殺菌性とファゴソームを持たせることにより、食細胞の生理機能に必須であるこのプロセスは、リソソームとファゴソームのための成熟の最後と重要な段階であると考えられているファゴリソソームの生合成とファゴソームの融合で絶頂に達する。本稿では、ファゴリソソーム生合成の特徴であるコンテンツ配信を、ファゴソームするリソソームの動的な過程の定性的および定量的分析のための生細胞イメージングベースの方法を説明します。このアプローチは、phagocyのモデルとしてのIgGでコーティングされたマイクロビーズを使用しています管腔リソソーム貨物プローブとしてtosisと蛍光団結合デキストラン分子、タイムラプスイメージング、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用してライブマクロファージにおけるリアルタイムにファゴソームにlysosmalコンテンツの動的配信を追跡するために。ここでは、準備手順や他のラボで、この方法の簡単で正確な展開を可能にするためのステップバイステップの実験、詳細に背景を説明します。我々の記載された方法は、単純な堅牢な、そして最も重要なことは、容易に異なるシステムや様々な食細胞タイプ、機能喪失実験を、異なるプローブの使用などの様々な実験設定でファゴソームの相互作用および成熟を研究するために適合させることができるであり、そして貪食粒子。

概要

マクロファージを含む専門的な食細胞は、免疫系で重要なを果たしている。先天性免疫系における最初の防衛線であることに加えて、それらはまた、それらのシグナル伝達およびロール1-3抗原提示を介して適応免疫の活性化において重要な役割を果たす。専門的な食細胞の機能は多面的ですが、ファゴソームの成熟は、プロの食細胞4,5の殺菌及び抗原処理機能の重要なバックボーンです。受容体を介した貪食や細菌などの貪食ターゲットの取り込み時には、発生期のファゴソームは、相互作用し、エンドサイトーシスネットワークのコンパートメントおよび他のいくつかの細胞小器官6の交流の複雑でよく編成シーケンスを通過します。化合物の性質は、これらの細胞の実体だけでなく、規制と交換し、融合事象のタイミングは、管腔ファゴソーム環境とphagosを決定OMALの膜組成と、このように7、成熟ファゴソーム8の運命。

ファゴソーム成熟の生理的関連性は、から逃げる停止またはファゴソーム成熟9を破壊するために、様々な細胞内病原体によって使用される多様な戦略によって例示される。これらの戦略の最も直接的または間接的にファゴソームの成熟過程の最終的かつ重要な段階を防ぐ：加水分解酵素と成熟ファゴソーム7の抗菌要因の大部分とそれらを賦与後期エンドソーム/リソソームコンパートメントファゴソームの融合、 、8,10。この最終的な重要なステップの分析は、したがって、ファゴソームの成熟の状態について、自然な生理的な状態は、正または負に利用されている特定の実験設定で影響を受けているかの強力な指標を提供してくれることができます。

後期エンドソーム/リソソーム区画sが、一般に種々のステージ特異的マーカー分子の存在により早期エンドサイトーシス区画から、エンドサイトーシス経路の末端区画とみなす定義され、区別される。例えばこのような他の人の間で11リソソーム関連膜タンパク質（ランプ）などの加水分解酵素や膜成分のため。ターミナルエンドサイトーシスは、区画-今後リソソームは、また、食細胞/エンドサイトーシス経路12の最後に消化の最終段階のための主要な場所として機能し、単にと呼ばれる。このように、難消化性プローブは、細胞外環境からのエンドサイトーシスおよびマクロピノによってロードすることができ、それを取り込み、チェイスの定義されたサイクルに従った後13,14を蓄積リソソームへのエンドサイトーシス経路を通って輸送される。 15-17 endocyticprobesなどの有機難消化性高分子デキストランのような蛍光顕微鏡用の蛍光団結合プローブは、一般的に使用されている。

、我々は、ファゴソーム、リソソーム内腔にコンテンツの配信を分析することによって、ファゴソーム成熟を研究する貪食カーゴとしてIgGをコーティングしたマイクロビーズの使用を記載している。ライブ骨髄由来マクロファージ（BMM）、共焦点レーザー走査顕微鏡でタイムラプスビデオ画像内のリソソームの容易に検出可能なマーカーとして蛍光団結合デキストランプローブを用いて、我々は高とファゴソームへの貨物輸送の動的なプロセスに従う時間分解能。次に、フィジー（又はImageJの）収集タイムラプス撮影データは、オープンソース、無料利用可能な画像解析ソフトウェアを用いて評価することができる方法を説明し、統計的にMicrosoft Excelを用いて解析し、グラフパッドプリズムソフトウェア14,18を用いて提示した。

我々の方法の説明に続いて、類似の実験は、ファゴソーム成熟に対するそれらの影響を調査するために変更された設定および因子を使用して設計することができ、実質的に任意のオト付着性の一次または細胞ラインの貪食細胞の彼女のタイプ、遺伝子ノックアウトやノックダウンを、変異体または融合タンパク質の発現、食細胞 - ターゲット、マイクロビーズコーティング化合物、エンドソーム/リソソームプローブや要因などAを含む機能実験の遺伝的損失とりわけ、サイトカイン、化学阻害剤、またはsiRNAは、この方法の基本的なアプローチを適用することができるすべての変数である。

私たちは、このメソッドは次のようにするという目標や基本的な要件を定義します。

  • この方法の目標：食細胞を生きた高い時間分解能でファゴソームの成熟の、直接的な定量的および定性的観察と分析を可能にする。
  • 貪食貨物：適切にコーティングされた微粒子または生物学的標的。ここでは、容易に食作用を媒介するのFc-γ受容体を介して内在化さIgGをコーティングした3μmの球状のポリスチレン微粒子を使用しています。代わりに、任意の微生物またはコーティングされたMIC貪食受容体が細胞上に存在するためにroparticleを使用することができる。
  • 食細胞：適切な貪食受容体を発現する接着食細胞。ここでは、豊富のFc-γ受容体を発現するマウス初代BMMSを使用しています。あるいは、樹状細胞（DC）、単球または食作用上皮細胞またはそれらの遺伝的変異体またはノックアウト変異体を使用することができる。
  • リソソーム貨物：蛍光標識したリソソームプローブ。ここで、テキサスレッドコンジュゲート7万キロダルトンのデキストラン（Dex70kD）はリソソームの管カーゴとして使用される。あるいは、そのような酸味や、分解能力などのファゴソームプロパティの細胞区画または細胞小器官、または適切なプローブのいずれかの蛍光検出可能なマーカーは、ファゴソーム成熟の進行を研究するために使用することができた。
  • 例えば分子、化学化合物、遺伝子ノックダウン、または変異タンパク質の一過性発現を可能性があり、シグナリング：要因に影響を与える。ここでは、FORGを持っている簡単のためにこのような因子の1使用していますが、変異型タンパク質の発現およびKasmapour ら 18ファゴソームの貪食や状況と移動性に影響を与えると/できるあらゆる要因を参照してくださいノックダウンに影響を与える要因との最近の例または成熟ファゴソームと対話コンパートメントは、潜在的に使用することができる。

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プロトコル

動物のケアと、このプロトコルのすべての手順は、制度や国のガイドラインに従ってください。

「Π-」あらかじめにより示されている調製物を調製。

1。 BMMSの調製

  1. 頚椎脱臼によりマウスのカリングを実行します。
  2. 組織から大腿骨と脛骨の骨、無料の骨を削除し、骨髄のアクセシビリティを両端をトリミングします。
  3. 次の段階まで氷上で、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを補充し（氷冷PBSまたは氷のように冷たいDMEM培地で骨を保つ。
    注意 ：汚染のリスクを最小限にするために、クラスIIバイオセーフティキャビネットの下に、以下の手順を実施します。
  4. 1ミリリットルの注射器に取り付け26（0.45 mm）の針を使用して冷PBS +ペニシリン/ストレプトマイシンを骨髄腔をフラッシュします。
  5. 10分間350×gで穏やかな遠心分離によってペレット細胞は、BMM MEDでペレットを再懸濁無菌微生物学イウムとプレートはペトリ皿を被覆されていない。
    1. BMM媒体の準備
      • ダルベッコ改変イーグル培地、DMEM
      • 10％の不活化FCS
      • 20％のマウス線維芽細胞L929細胞株培養上清（マクロファージコロニー刺激因子、M-CSFの供給源）
      • 5％ウマ血清
      • 2mMグルタミン
    2. L929細胞株の培養培地の調製;
      • 、RPMI（ロズウェルパーク記念研究所）1640培地
      • 10％の不活化FCS
      • 2mMグルタミン
    3. マウス線維芽細胞L929細胞株の培養上清の調製;
      • L929細胞をコンフルエント175センチメートル培養、1:4に分けた20ミリリットルL929培地および培養上清を用いて2日間2フラスコを48時間後に回収し、濾過し、BMM培地に添加
  6. からフラッシュ細胞をインキュベート5％のCO 2雰囲気下で37℃のインキュベーター内で大腿骨。
  7. インキュベーションの48時間毎（最大72時間）後、培地を吸引し、最大10日間、新鮮なBMM媒体によって交換してください。フローサイトメトリーによって試験した細胞の95％以上がCD14陽性であった。 CD14はマクロファージによって主に表されるパターン認識受容体である。この受容体の陽性細胞の割合を決定することによって、付着BMMSの純粋培養が生成されている。

注 ：他の細胞型が使用される場合、それに応じて細胞を調製し、培養物。

2。貪食貨物としてマイクロビーズのコーティング

  1. 1ミリリットルビーズ懸濁液の調製のために、2.5％の400μL3μmのカルボキシル化ポリスチレン微粒子、または代替微粒子を使用しています。
  2. 1.5 mlのマイクロ遠心チューブにビーズ懸濁液を移し、PBSで3回洗浄し、500 mMの2100μlを加える - （N-モルホリノ）エタンulfonic酸ナトリウム塩、ビーズペレットにpHが6.7で、MES緩衝液。
  3. 無菌のddH 2 O50μl中に50μgのマウスのIgG（ポリクローナルIgG抗体）を溶解し、ビーズ懸濁液に加える。
  4. 無菌のddH 2 O（450μL）を1ミリリットルに懸濁物を埋める。
  5. RTで回転ホイール上15分間溶液をインキュベートする。
  6. mlの10ミリグラム/の濃度でのEDAC架橋剤、N-（3 - ジメチルアミノプロピル）-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩を準備し、ビーズ懸濁液に14μlを加える。
    注 ：EDACクロスリンクは、ビーズ表面のカルボキシル基とIgGのアミノ基とビーズ表面上のIgGの固定化を容易にする。これは、ビーズの取り込みのために重要であるため、解決策を新たに準備する必要があります。
  7. 室温で1時間回転ホイールサスペンションをインキュベートする。
  8. EDAC架橋剤の14μlを加え、室温で1時間、回転ホイールサスペンションインキュベート。
  9. 微量での2分間万×gで懸濁物を遠心分離する。
  10. ビーズは、停止緩衝液にペレットを再懸濁し、2分間、10,000×gで溶液を紡糸することにより、架橋反応を停止するために停止緩衝液（10mMトリス、pH9.4の中の1％のTriton-X 100）中で3倍洗う。
  11. PBSに3Xビーズを洗浄し、1mlのPBSでペレットを再懸濁します。
    オプション：30〜50μLの作業分量を準備します。
  12. もはや4週間以上、4℃でのIgGでコーティングされたビーズ懸濁液を保存しないとサスペンションが凍結することを可能にすることはありません。

注 ：0.02％の最終濃度で、例えばアジ化ナトリウムのような防腐剤は、（w / v）の細菌の増殖及び汚染を防止するために、懸濁液に添加することができる。この場合、使用前に、ビーズの洗浄は、防腐剤の細胞毒性効果を回避するために行わなければならない。 2分間万×gで懸濁液の一部を遠心分離し、再でビーズを洗浄PBS中でペレットを懸濁する。洗濯3回繰り返します。

3。デキストランプローブストック溶液の調製

  1. テキサスレッド7万キロダルトンを溶解20mgを、PBS中のデキストラン（Dex70kD）メーカーの指示に従って、-20℃/ mlおよび店。
    注 ：メーカーのマニュアルを参照して、数週間、数ヶ月まで、または4℃で-20℃で在庫を保管してください。
  2. （に希釈される濃縮液を数倍、およそ1 mg / mlとなるように（DMEM、10％FCS、2mMのL-グルタミン）完全なDMEM細胞培養培地中で希釈してストックから実験のデキストラン溶液を調製細胞に添加する前に20μg/ mlの最終的な作業濃度）。
  3. 解決策を均質化し、後で画像形成中に人工物の発生につながる可能性凝集体を溶解するために5分間デキストラン分量を超音波処理するために、超音波水浴を使用してください。
  4. 最大Gで遠心溶液から未溶解塊や汚染物質を除去するマイクロ遠心中で5分間。
  5. 慎重にチューブの底にペレットを回避しながら、上清を新しいチューブに移動し、完全DMEM細胞培養培地中で20μg/ mlの最終的な作業濃度に溶液を希釈する。
  6. 0.2μmシリンジマウントフィルターを使用して、フィルタ - 滅菌溶液。

4。デキストランプリロード

  1. 生細胞イメージング用ガラスボトムディッシュでの種細胞と接着と順応性を確保するために（37℃、5％CO 2雰囲気下で）少なくとも12時間インキュベートする。
    注 ：お皿ごとに（4つの区画まで）、複数の実験を行うことができ利用可能なセグメント化されたガラスボトムディッシュがあります。
  2. プロトコル3で説明したようにDMEM溶液中にデキストランを準備します。 37℃の水浴を用いて、DMEM溶液中で調製したデキストランを温める
  3. 吸引培地AND慎重に細胞にデキストラン溶液を追加し、取り込みのための2-8時間、5％CO 2雰囲気下、37℃でインキュベートする。
    注 ：計画と使用され、実験を繰り返した場合に厳密にこの期間に維持されているプローブと細胞のタイプに基づいたプロトコルを最適化します。これはエンドサイトーシス経路におけるデキストランの蓄積のプロファイルと実験の再現性したがってために不可欠である。
  4. 細胞は予め温め完全DMEM培地で3回洗って、吸引メディアと新しい培地で丁寧に細胞をすすいでください。
  5. 5％CO 2雰囲気中で37℃で4-12時間、完全DMEM培地で細胞をインキュベートする。
  6. 温めておいた完全なフィルタリングをフェノールレッドを含まないDMEM培地で細胞を1回洗浄します。
  7. 最適な撮像結果を得るためには、撮影開始前に予め温め完全なフィルタリングをフェノールレッドを含まないDMEM培地に少なくとも30分に変更します。フェノールレッドは、バックグラウンドノイズを増加させる、蛍光シグナルの消光を引き起こすこととこのように、画像のコントラストや明瞭さを軽減します。

注 ：使用されたプローブと、細胞の種類に基づいて、予め計画され、最適化されたプロトコルに従って、顕微鏡と事前に画像化設定をセットアップします。

5。 IgGをコーティングしたビーズの追加

  1. RTに予め調製1％ビーズ懸濁液のアリコートを平衡化し、2〜3分間超音波水浴中で超音波処理する。
  2. 汚染（良い出発濃度は1μL/ 2cm 2の皿の表面である）のリスクを最小限にするために、クラスIIバイオセーフティキャビネットの下の完全なフィルタリングフェノールレッドを含まないDMEM培地に1％ビーズ懸濁液の1-6を添加する。
    注 ：ここではBMMSが25,000細胞/ウェルで播種し、1％ストックビーズ懸濁液6μlの皿を培地に添加した。これはおよそ15:1ビーズ/細胞比に等しい。比が使用される細胞の種類およびビーズ材料に調整しなければならないは、i。E。ラテックスビーズは、低密度を有し、ポリスチレンビーズは沈む一方で、急速に底に沈むとはるかに高速付着細胞と接触するため、より大きな数のしないでください。
    注：実験に応じて、事前に観察される領域を選択することが有利であり得る。ビーズ懸濁液を、したがって良好な取り込み事象を観測する確率を増加させるだけで、ガラスボトムディッシュの特定の領域に加えることができる。
  3. ビーズの密な雲は穏やかにガラスボトムディッシュで懸濁液をピペッティングすることによって拡散することができる。
  4. ビーズ、ガラスボトムディッシュの底に沈む、付着食細胞と同一平面上に約になるまで待ちます。
  5. 関心領域（ROI）に焦点を当て、タイムラプスイメージングを開始します。

注 ：撮影が進行中の間には、フォーカスを微調整することが必要であり得る、使 ​​用される撮像システムに依存して、その安定ビリティと観測された細胞の移動性。しかし、これは不可能になる可能性があることを強く再フォーカスした結果、焦点面から外れファゴソームの適切な分析に注意してください。

6。イメージング

最適な画像品質のために、以下の一般的なガイドラインに従ってください。

  1. このようなレーザ走査又はスピニングディスクシステムとして共焦点画像化システムを使用する。
    注 ：ライカLAS AFソフトウェアによって制御された環境制御室を備えたLeica TCS SP5 AOBSレーザー走査型共焦点顕微鏡は、タイムラプスビデオイメージングのために、ここで使用された。
  2. このような等走査速度、倍率、解像度などの画像設定を最適化。使用されるシステムに応じて、すべての7月20日秒単位のフレームの速度を可能にするように。
    注 ：ここでは、200Hzの走査速度、2倍ズームとスキャナ512×512ピクセルの解像度でRESU 2〜3倍のライン平均3-5秒/ RAME間の録画時間にlted。 10秒毎のフレームレートは、少​​なくとも120分の持続時間とタイムラプスムービーを記録するために使用した。
  3. 使用される撮像システムとプローブ（S）に基づいて、適切な励起/発光の設定を使用してください。
    1. 過剰な光漂白を防ぐために設定を最適化します。
      注 ：ここでは、テキサスレッドデキストラン70kDは、DPSS（561 nm）のレーザー照射光は610 nmでの発光ピークと600〜650 nmでライカハイブリッド検出器（HYD）によって検出された使用して興奮していた。レーザ強度​​は​​、信号強度に適合し、フルオロフォア（単数または複数）の光退色および細胞上のレーザ光の光毒性効果を最小限に抑えるためにできるだけ低く維持されなければならない。一般に、適切かつ安定した信号強度を取得し、ビーズの取り込みおよびファゴソーム成熟proの完全な持続時間を捕捉するイメージングの走査速度、ライン平均、スキャン解像度、フレーム間隔および持続時間のバランスをとることが重要であるCESS。
  4. これらは、フルオロフォアとコンジュゲートされていない場合は、ビーズを観察するための明視野（BF）のチャンネルが含まれる。
    注 ：テキサスレッドチャンネルの他に、BFチャネルは、ビーズを可視化するために使用された、同一のDPSSレーザーを光源と信号が光電子増倍管（PMT）検出器を用いて検出したとして用いた。
    注意 ：照合することで、データを取得する際、同一の記録設定を適用してください。最も重要なパラメータは、以下のとおりです。励起レーザ強度​​は​​、検出器の設定、取得設定、倍率とフレーム間隔。観測データ点が（すべての12秒でフレームを持つ別のセットで、すべての7秒で取得されたフレームとの観測を照合するなど）が重ならないように、同一のフレーム間隔を使用しないと、曲線の平均化工程を必要とします。これは「データの評価のために必要な手順を増加させ、このようなOriginLabのような曲線の平均化機能を備えた追加のソフトウェアを必要とするだろうS原産地プロ統計ソフトウェア（ http://www.originlab.com/ ）。
  5. 好ましくは、使用される撮像システムのネイティブファイル形式のタイムラプスビデオを保存し、圧縮された形式でエクスポートすることは避けてください。

注 ：（。LIF）ここで、タイムラプスムービーは直接フィジーで開くように輸入されたネイティブライカLAS AF形式のファイルで保存されていました。フィジーは含まれバイオフォーマットインポータープラグインを使用して、ほとんどの顕微鏡メーカーからネイティブファイル形式を読み取ることができる。 JPGまたはTIFFまたはAVIコンテナフォーマットでビデオファイルとして画像シリーズでタイムラプスムービーファイルをエクスポートすると、必要または推奨されません。ネイティブ顕微鏡ファイル形式を使用して、非可逆圧縮アルゴリズム（例えば、JPEG）を回避することによって、元の観察から、可能な限り最高の画像品質を維持することに加えて保証し、そのファイルのメタデータ（タイムスタンプ、倍率、レーザ及び捕捉強度、検出器の設定など）が保存され、フィジーで使用できます。何らかの理由で、タイムラプスビデオファイルは、分析のために別の形式でエクスポートする必要がある場合は、このようなTIFF画像シリーズと独立したRGBカラー（赤、緑、青）は、この時すでにチャネルなどの非圧縮ファイル形式を使用してくださいフィジーは、多くの場合、正常にエクスポートファイル内の他のカラーチャネルからBFチャネルを分離することはできませんように、ステップ。また、基準となる元顕微鏡ファイルを保存するようにしてください。

7。タイムラプスビデオの分析

  1. ImageJの、フィジーや類縁信号関連解析機能を提供する他のソフトウェアを使用してください。
    注 ：ここで、フィジーはタイムラプス映画の分析に使用した。フィジーは無料でダウンロードでき、再編成ツールのメニューや追加のネイティブプラグインで画像処理パッケージを含むImageJの分布であるhttp://fiji.sc 。この節で説明したプロセスイオンは、図2に示されている。
  2. 「ファイル」をクリック「開く」で、ファイルを選択することで、フィジーでファイルを開くか、フィジーにファイルをドラッグ＆ドロップで。
  3. 次のオプションを選択してください。
    1. 閲覧をスタック：ビューHyperstackとスタック、
    2. カラーオプション：カラーモードがカラー化、
    3. 別々のウィンドウに分割チャンネル：スプリットチャネル（記録されたすべてのRGBカラーチャンネルのために別のウィンドウが開きます）。
  4. 場合の画像のシリーズが使用される、 "ファイル"に移動して、フィジーのシリーズをロードし、「インポート」、「イメージシーケンス」とターゲット画像シリーズが含まれているフォルダ内の画像ファイルを選択します。
    1. ロードするためのフィルタを設定し、条件には、例えば、一連の画像を選択した。
      1. 画像の数：ロードされるフレーム数。
      2. イメージの開始：シリーズの開始フレームである画像。
      3. 増分：間の増分ロードするフレーム（フレームごとに、毎秒のフレームなど ）。
      4. ファイル名が含まれています（「チャンネル1」からの画像は、マルチチャンネルタイムラプス映像の色分解後に標識する方法を通常は「C001」を設定することで、例えば）ファイル名を使用して特定のチャネルのフィルタリング。
  5. 「···スケールの設定」、「分析」するつもりはボックス「グローバル」をチェックし、「スケールを除去するためにクリックする "をクリックして拡大縮小を削除します。
    注 ：異なる倍率で評価される種々の実験的なセットのために使用されている場合には、このステップは、画像のピクセルベースの分析を可能にする。倍率設定が常に一定に保たれており、ネイティブの顕微鏡ファイルを直接フィジーにインポートされた場合、フィジー、顕微鏡、ファイルのメタデータから、倍率とスケールデータを理解し、使用することができますように、このステップをスキップすることができます。
  6. 測定パラメータを設定「エリア」、「標準偏差」、「統合密度」、「表示ラベル」と「グレー平均値 "："測定の設定」、「分析」に行くと、次のボックスをチェックしてS。
  7. 測定され、「OK」で確定されるプローブからの信号が含まれているカラーチャンネルにリダイレクト。
  8. 測定が開始されると、ウィンドウの上縁をクリックすることで、BFチャネルウィンドウを選択したフレームに移動します。
  9. 内部化ビーズ上の円形のROI、つまり 、関心領域（ROI）を選択するために「楕円形選択ツール」を使用してください。選択は、BFチャネルのように見えるのビーズの外側の縁にしっかりと装着されていることを確認してください。
    注 ：PCを使用する場合は、円形のROIを確実にするために選択ツールを使用している間、Shiftキーを押しながらキーを押したままにします。
  10. 最適ビーズの完全な飲み込み前に数フレームが完了した測定を開始し、注意してください完全に形成された新生ビーズファゴソームを形成し、食作用カップが閉じたフレーム。これは、BFチャネルでは比較的はっきりと識別可能でなければなりません。
  11. 「分析」し、測定を実行するための「測定」をクリックしてに移動します。結果が「結果」というタイトルの別のウィンドウに表示されます。
  12. 、次のフレームに移動し、ビーズが移動した場合に、ROIの位置を調整し、測定を繰り返す。結果は、結果ウィンドウにリストに追加され、各フレームが分析され、「ラベル」列の値に基づいて同定することができる。
    注 ：（対策用など、「M」）のショートカットキーを使用して、大幅に評価プロセスをスピードアップすることができます。ショートカットのリストを表示し、メニューの「プラグイン」の衣装のものを割り当てます。
  13. 全ての関連するフレームの測定を完了した後、結果は、MS Excelなどのスプレッドシートアプリケーションにコピーすることができる。コラム「IntDenは「intensitieを描いている測定はにリダイレクトされたことを、チャネル内の選択した領域のS。

8。漂白修正

使用したプローブと撮像設定に応じて、光退色が発生する場合があります。その程度に応じて、これは強く評価の結果に影響を与える可能性がある。しかしながら、この効果は、部分的に、測定値に変化の等しいが反対の速度を適用することにより補正することができる。存在する場合、光漂白係数は、各ファゴソームの分析に関連する時間スパン中に、フレーム全体における時間依存性の信号強度の減少、またはフレームのトリミングされた領域を特異的に測定することによって算出することができる。この処理は、 図3および図4に示されている。

  1. フィジーの「プラグイン」メニューの下に、全体のフレームの一般的な減少、または時間をかけて、ROIの特定のプローブ信号強度（ 図3を決定するために、「時系列分析装置「プラグインを使用する）。
    注 ：時系列アナライザ·プラグインは、からダウンロードできますhttp://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.htmlプラグインメニューにまだ存在していない場合は、。
  2. のみを分析ファゴソームのフレームに対応したフレームのために、MS Excelでの時間（秒）に対する測定をプロットします。
  3. プロットに線形トレンド·ライン（ 図4A）を適用し、減少信号に対して負の傾きは、光漂白効果の存在を示している。
  4. 補正された信号強度（SI）=生のSI +（秒単位の時間*逆スロープ）：分析さファゴソーム（ 図4Bおよび4C）からの値を反転の傾斜を適用する

注 ：それぞれの単一分析さファゴソームは、記録された時間早送り動画中に（完全な取り込みフレームから始まる）特定のタイムスパンを持つことになります。フォトbleac興は、その特定のスパンのために再計算する必要があり、その特定のファゴソームから測定値を補正するためにのみ有効となります。

9。データ評価

  1. データを照合し、適切なソフトウェアで漂白補正された値の平均と統計誤差を計算します。
  2. 適切な形で評価されたデータをプロットします。

注 ：ここでは、科学的な統計情報とソフトウェアグラフパッドプリズム（プロットhttp://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）を用いた。 Prismソフトウェア限り、すべてのデータが同じフレームレート（すなわち、すべてのそのような一つのフレーム毎に10秒と同じ間隔で用いて取得した）を有するように、対応するエラーインジケータを平均曲線を生成し、プロットすることができる。

注 ：同じexperimの繰り返し内での絶対のSI値の広いバリエーションENTセットは、非常に大きな統計誤差を導入し、データが使用できなくなるでしょう。プロトコルは、 例えば、撮像設定は、照合されるべき異なる実験を繰り返すうち、厳密に同一に保持されていない場合、これは場合であってもよい。

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結果

イメージングのための細胞やビーズの正しい準備が非常に重要です。 図1に、BMMSための私達の最適化されたプロトコルに基づいて播種、プローブのロードと、この方法では、最初の画像化手順の概要を示している。これは、プロトコル·パラメータが使用される細胞およびプローブの種類に応じてテストし、最適化することが不可欠である。

プリロードされた細胞に対するIgG被覆ビーズの添加後に、事前定義された倍率設定を維持しつつ、視野が可能な細胞の最大数の潜在的な取り込みイベントの最大数を提供するように選択することが重要であるプロトコルの。 図2に示すように、このアプローチは、各タイムラプスビデオにおける分析可能なファゴソームより多数を提供することができる。各実験セットのビデオ収量当たりのデータポイントを増加させることに加えて、これは、様々なperipheによって導入された変動を減少させるRAL条件とデータの堅牢性を向上させます。

それが可能ならば、信号関連測定手順（ ...

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ディスカッション

次のセクションでは、提示された方法とその限界の重要なステップを説明します。さらに、我々は、その解決策の一般的な問題のいくつかを接続可能な修飾を導入し、本手法の利点だけでなく、このアプローチに適し補完的な方法を検討していきます。

ビーズ表面へのIgGの結合を含むビーズの調製は、重要であり、unfresh製剤の使用は避けるべきである。それへの追加では、デキストランが新鮮にあらゆる実験の前に凍結ストック（希釈し、滅菌した）から製造されていることも重要である。それはデキストランの負荷が細胞取り込みおよびコンパートメント分布及び蓄積の一貫性を達成するための正確なスケジュールに従うことが重要である。また、のみならず、同じ顕微鏡のセットアップおよびソフトウェア設定を使用するだけでなく、可能な限り一定の周辺条件を維持することが重要である（ 例えば、テmperature、CO ​​2、湿度、ビード付加技術、 等 ）。別の重要な点は、視野や関心のある細胞の選択である、サンプルは代表的なものである細胞を選択するために撮影開始前に未べきである。 <...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

私たちは、原稿の重要な読書のためのファゴソームの生物学研究室のメンバーに感謝。この作品は、ヘルムホルツ若手研究助成（イニシアティブやヘルムホルツ協会のネットワーク化ファンド） と優先プログラムドイツ研究協会（ドイツ学術振興、DFG）のSPP1580グラントによってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ダルベッコの改変イーグルスミディアム(D-MEM)PAA、オーストリアE15-009
ダルベッコの改変イーグルスミディアムフェノールレッド(D-MEM)PAA、オーストリアE15-047
シ胎児血清(FBS)PAA、オーストリアA15-151
L-グルタミンPAA、オーストリアM11-004
PBSPAA、オーストリアH15-002
ペニシリン/ストレプトマイシンPAA, AustriaP11-010
WillCo-dish®ガラス底皿(35 mm∅、#1.5)WillCo Wells、オランダGWSt-3522
CELLviewTMガラス底皿、35 mmGreiner Bio one、ドイツ627871代替:セグメント化された
カルボキシル化ラテックス微球Polysciences、USA#09850さまざまな直径で利用可能で、3 μm
ポリスチレン微粒子Kisker Biotech, ドイツPPs-3.0COOH
Triton-X 100ROTH, ドイツ305.1.3
マウス全体IgG Rockland, USA010-0102
EDAC 架橋剤Sigma-Aldrich, USAE6383-1g
10 mM TrisSigma-Aldrich,USAT1503
1-ml syringeOmnifix -FB.Braun、ドイツ9161406V
26 G針 (0.45*25 mm)B.Baun, Germany4657683
RPMI 1640PAA, AustriaE15-039
Horse SerumGibco, USA16050-122
MES hydrateSigma-Aldrich, USAM2933
0.2 μMシリンジマウントフィルターザルトリウス、ドイツ83.1826.001
ウとして利用可能

参考文献

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