電子フォンフレイ装置を用いたマウス後肢の触覚感度の変化の測定

サマリー

Electronic von Frey測定は、炎症イベントの前後に連続的に加えられる圧力刺激に対するげっ歯類の機械的離脱閾値の変化を迅速かつ正確に測定できるため、従来のフォンフレイフィラメントに代わる効果的で改良された方法です。

要約

炎症による後足の機械的圧力からの離脱閾値の変化を測定することは、げっ歯類の痛み知覚の変化を評価するための有用な手法です。離脱閾値は、最初にベースラインで測定でき、次に薬物、毒、損傷、アレルゲン、またはその他の誘発された炎症の後に、皮膚の非常に特定の領域に正確な力を加えることで測定できます。電子フォンフレイ装置は、従来のフォンフレイ測定とは対照的に、利用可能なフィラメントサイズに制限されないマウス後肢の離脱閾値を正確に評価することができます。測定の容易さと迅速さにより、短期間で複数の測定を行うことができるため、急速に発症する炎症性および神経因性疼痛の多様なモデルに触覚感度の結果の評価を組み込むことができます。個々のげっ歯類の被験者の実験測定値は、個々のベースライン反応に対して内部的に制御でき、実験グループ内および実験グループ間でベースライン応答を標準化するために簡単に確立できる除外基準。したがって、電子フォン・フレイ装置を用いた測定は、齧歯類の機械的異痛症に対する確立された古典的なフォン・フレイ・フィラメント・ベースのアッセイの有用な修正を表しており、これは他の非ヒト哺乳類モデルにも適用できる可能性がある。

概要

慢性非感染性疾患は、死亡率と罹^患率1の人間の負担の不均衡な割合を占めています。慢性疼痛は、世界的な疾病負担の重要な要素としてますます認識されています²。これは、痛みの予防、管理、治療におけるイノベーションに大きな推進力をもたらしました。同時に、痛みの根底にある生物学が複雑であるという豊富な証拠があります³。防御的疼痛、不適応疼痛、慢性疼痛の根底にあるメカニズムは、免疫系と神経系の間の複雑な相互作用を指し示しています^3,4。これらのメカニズムの解明には、分子解剖から行動解析まで、厳密で定量的で再現性のある実験的アプローチが必要です。

げっ歯類モデルは、炎症^性疼痛および神経障害性疼痛の分子プレーヤーの特性評価において非常に貴重です5。有害な刺激に対する以前に指定された反応の時間と強度の減少は、げっ歯類の被験者が他の方法では痛みの感覚を報告することができないため、これらの動物の痛みの状態を測定するために使用されます⁶。感染^{7,8、化学物質}曝露^6、9,10、外科的切開¹¹、神経結紮¹²によって引き起こされる神経障害性疼痛によって引き起こされる炎症性侵害受容のげっ歯類モデルでは、温度と圧力に対する反応の変化が組織感受性の指標として一般的に使用されています。

機械的感度、または圧力刺激に対する反応は、しばしば古典的なフォン・フレイ・フィラメント(CvF)を使用して測定されます - 一連の(例:0.4-15 g¹³)加重チップを試験組織に手動で適用し、対照群と実験被験者で痛みの行動が誘発されるまで連続的に行います。これらのヒントまたは髪の毛を使用して機械的感度を評価するためのさまざまな方法があります^6,13。最も頻繁に使用される方法は次のとおりです。一定の圧力を持つチップ(シリーズ内;例えば、^2g13)を出発点として選択し、ラットまたはマウスの50%の離脱閾値(先端が組織に適用される回数の50%の応答を生じさせるのに必要な刺激強度)は、以前に指定された応答挙動¹³の表示に基づいて先端重量を上下に移動することによって決定される。次に、治療群の絶対 50% 離脱閾値を、ベースライン時点と治療後の時点間で比較します。この手動の手法は、非常に時間がかかります。これにより、各被験者がフォン・フレイ室に閉じ込められる時間が長くなるだけでなく、さまざまな重量の試験チップが炎症組織に適用される回数も増加し、研究対象のげっ歯類に大きな不快感を与えることになります。さらに、50%の引き出し閾値が計算され、げっ歯類のグループ間で比較されます。実験被験者の個々の反応は、通常、私たちの知る限り、1^{つの例外を除いて}、未治療の個々のベースライン反応に正規化されていません6。結果として、げっ歯類の被験者は通常、以前に決定された範囲内の一貫したベースライン反応に基づいて治療群に割り当てられたと報告されず、個々の被験者は、ベースライン反応を特定の研究およびアッセイのセットに対して標準化することを可能にする一貫して適用された一連の除外基準に基づいて評価されません。

ここでは、電子フォン・フレイ装置(EvF)を使用して、Bothrops jararaca毒への曝露後のマウス後足の触覚感度を測定するための代替方法を紹介します。Cunhaら⁶は、げっ歯類におけるEvF技術の使用を開拓し、CvFとEvFの有効性を系統的に比較して、EvFが炎症性疼痛のげっ歯類モデルにおける触覚感度の「より感度が高く、客観的で、定量的な」尺度を提供することを実証した。簡単に言うと、EvF測定では、試験対象の組織に適した剛性の均一な直径(0.8 mm)の非吸湿性ポリプロピレンフォンフレイチップを電子プローブに取り付けて、げっ歯類がチップから引っ込む力/重量を表示する読み出しを行います。CvF測定とEvF測定には、いくつかの重要な違いがあります。まず、EvFを使用してベースライン反応と実験的反応の両方を測定するプロセスは、後足への圧力を増加させる力を加えることができ、反応があり、CvFのように先端を変更する必要がないため、大幅に合理化されます。動物はアッセイチャンバーに閉じ込められる時間が短いため、実験中のストレスが少なく、より快適です。第二に、EvFは、許容可能なベースライン閾値の範囲という形で、研究対象者に対する合理的な除外基準を比較的容易に実施することを可能にします。これにより、治療群内および治療群間でのベースライン反応の標準化が可能になります。第三に、実験的治療後の被験者の反応は、常に被験者自身の個々のベースライン反応と比較され、測定のための重要な内部コントロールが作成されます。第四に、引き出し閾値の精度は、手動フィラメントのウェイトの形で利用可能な増分ではなく、圧力を連続的に加えることができるため、より高いレベルの分解能で記録されます。適切に設計されたCvFアッセイと同様に、EvFベースの実験も、同じ研究者(治療を受けていない)が力を加え、応答行動を記録することで実施されます。この手法では、測定の内部一貫性を確立するために研究者の側で時間と労力が必要であり、一貫性のないベースライン反応のために除外しなければならない可能性のあるマウスに対して適切な考慮がなされるように実験を計画する必要があることに注意することが重要です。

実装が簡単で、効果的で、適切に制御された機械的感度の評価は、毒物などの炎症イベントのモデルに行動評価を追加することを容易にします - 触覚感度の変化の測定におけるEvF測定の容量とパワーを説明するためにここで使用した例です。その結果、ND4 Swissマウスの雄は、南米のマムシBothrops jararaca由来の毒液を後足に注入した後、機械的感度が向上したことを発見しました。行動反応は、罹患組織における浮腫、好中球の流入、および肥満細胞の脱顆粒を伴いました。

プロトコル

マカレスター大学の動物施設管理および使用委員会(IACUC)は、すべてのプロトコルを承認しました。これらの実験には、8〜12週齢の男性のND4スイスマウスが使用されました。

1. Bothrops jararaca 毒の調製と注射

1. 注意:B.jararaca毒は有毒です。粉末の取り扱いや溶液の調製時には、手袋、マスク、目の保護具を着用してください。
2. 45 μg/kg B. jararaca 毒 (以前の用量反応実験で決定されたレジメン) または 0.9% 生理食塩水ビヒクル (10 μl) を、29 G x 1/2 の針が入った 3/10 ml インスリン注射器を使用して、両後足に足底内注射で投与します。注:実験デザインに応じて、治療液と制御液を各後肢に別々に注入して、各被験者の内部制御を提供することができます。

2. 電子フォンフレイ装置のセットアップと操作

1. 電子フォンフレイユニットをプローブスタンドに置きます。プローブとケーブルがディスプレイユニットに適切に接続されていることを確認し、機器の電源を入れます。セットアップモードで読み出しをゼロ(0.00 g)に設定し、付属のテストウェイト(5.00 g)をフォンフレイプローブのコーンにそっと置きます。
2. 読み出したものを実験ノートに記録し、試験セッションの終了時にこの手順を繰り返します。試験セッションの前後で試験分銅の読み取り値に0.20 gを超える不一致がある場合、または試験分銅の適用後に読み取り値に変動がある場合は、装置の再校正(メーカーによる)が必要になる場合があります。
3. マウスの後肢の離脱閾値を評価するには、プローブに付属のものの中から適切なポリプロピレンチップを使用します。チップの選択は、プローブする組織によって異なります。硬い先端は、感度が低く、丈夫な後足組織に適していますが、肛門性器隆起(Chatterjea、未発表)などのより柔らかい領域には、セミフレキシブルチップが適している可能性があります。剛性のある先端をプローブのコーンにそっと取り付けます。
4. 最大印加圧力を記録するには、動作モードをセットアップから操作に切り替えて、最大印加圧力がディスプレイに記録されるようにします。このモードでは、プローブが引っ込められたときに、最大印加圧力の読み出しがディスプレイ画面に保存されます。

3. 後足離脱閾値評価の一般的な考慮事項

1. 理想的には、EvF装置を使用して後肢離脱閾値(機械的感度)を測定するには、2人の研究者が必要です-1人は装置を操作して測定を実行し、もう1人は記録された測定値を書き起こしてマウスを処理します。
2. バイアスを減らすために、装置を操作する研究者は、治療と記録された離脱しきい値を知らされていない必要があります。さらに、測定値間の一貫性を確保するために、同じ個人がすべてのベースラインおよび実験の離脱閾値を評価する必要があります。
3. すべての測定は、静かで温度管理された部屋で、¹⁴日目の同じ時間に行ってください。
4. 測定値を記録する実験者は、メッシュのフロアスタンドにセットされたマルチユニットポリメチルメタクリレート(PMMA)ハウジングの個々のチャンバーに各マウスを配置する必要があります。穴あきPMMA蓋でチャンバーを覆い、マウスが逃げるのを防ぐために、上に重いものを置きます。スタンドの下に吸収材を置き、排泄物を吸着・回収します。マウスをチャンバー内で 15 分間順応させてから、ベースラインまたは実験的離脱閾値評価 ^6,7,10 を行います。
5. マウスの後足は、メッシュの床の開口部から簡単にアクセスできる必要があります。したがって、メッシュの床スタンドをブレーキ付きのカートの快適な高さに配置するか、すべての側面からアクセス可能な安定したベンチトップに置きます。
6. 測定中、マウスは、測定チャンバのすぐ外側に置かれた食物ペレット¹⁵、または測定前に、または測定中ではなく、チャンバの床の金網に沿ってペンをタッピングまたは実行することによって生じる非常にわずかなノイズに気を散らさなければならない場合がある。これにより、マウスが静止するようになり、実験者がより簡単に測定を開始できます。

4. ベースライン後肢離脱閾値評価

1. ベースライン測定の最初のセットは、治療を投与する48時間前に実行する必要があります。.リジッドチップを取り付けるときにプローブをゼロにします。両手を使って、プローブをゆっくりと上げて、左または右の後足の中央(フットパッド領域)を刺激します(両方の足が同じ治療を受けた場合)。
2. 後足の引っ込み、後足の舐め、または4本足のジャンプなどの定義された侵害受容反応行動が観察されるまで、圧力を徐々に上げます^6,10。観察された行動を引き起こした圧力を書き写すように他の研究者に指示します。
3. 隣接するチャンバーに位置するマウスの離脱閾値を測定します。各マウスの引き出ししきい値を一度評価するまで続けます。さらに4回繰り返して、各マウスが前に説明した¹⁰のように5倍に測定されるようにします。
4. 各マウスについて、5 つの測定値の中央値を計算し、各値が中央値からどれだけ逸脱しているかを計算します。最も逸脱が少ない3つの値を選択し、それらを平均化して、前に説明した¹⁰のベースライン引き出ししきい値を取得します。このデモンストレーションでは、5 つの値のうち 3 つを使用して測定が標準化されています。具体的な測定回数は実験デザインによって異なりますが、ベースラインを評価するためには、すべてのマウスに同じ回数突くようにすることが重要です。
5. 24 時間後にベースライン測定を繰り返します。マウスごとに5回の測定を行い、中央値に最も近い3回を平均して、ベースラインの離脱閾値を取得します。
6. マウスの平均ベースライン離脱閾値を計算するには、治療の48時間前と24時間前に測定したベースライン離脱閾値を平均します。ベースラインの平均離脱閾値が3.50 g未満の場合、または2つのベースライン閾値の差が2.00 g以上異なる場合は、マウスを実験から除外します。これらの基準により、実験に参加したすべてのマウスが一貫したベースライン反応を示し、治療後に低い閾値を観察できる十分に高いベースライン離脱閾値が得られるようになります。
7. 注:除外閾値は、プローブする組織、研究する動物の系統、および使用するチップの種類によって異なります。例えば、3.5gはND4後足組織の有用なベンチマークであることがわかっていますが、肛門性器隆起のようなより柔らかい領域には、より低い排除閾値が必要であることがわかりました(Chatterjea、未発表)。
8. マウスを治療群に割り付けて、治療が実施される前に実験群の平均離脱ベースラインができるだけ類似するようにします。

注:ベースライン測定は、実験の48時間前に実行できます。ただし、治療開始前に定期的に少なくとも 2 セットのベースライン測定を完了する必要があります。

5. 実験的後足離脱閾値評価

1. 実験のデザインによって決定された適切な時点での治療後の後肢離脱閾値 (機械的感度) を評価します。測定が完了したら、すぐにマウスをケージに戻して、餌と水を手に入れます。
2. 上記の手順に従ってください。特に感度を複数の時点で評価する場合は、(治療された)後足組織を過剰に刺激する可能性を減らすために、5回ではなく3回の測定を行います。3つの測定値のうち2つが2.00 g以上異なる場合は、4番目の測定値を採取します。
3. 3 つの測定値の平均を計算して、各マウスの実験離脱閾値を取得します。4 回の測定を行ったマウスについて、中央値からの逸脱が最も少ない 3 つのマウスの平均を計算して、実験的な離脱閾値を取得します。
4. 特定の時点での各マウスのデルタ離脱閾値を取得するには、実験的な離脱閾値からベースラインを差し引きます。すべてのマウスとすべての実験時点について繰り返します⁹.
5. 収集したデータに対して適切な統計分析を実行します。ここでは、JMP 9.0(SAS、ノースカロライナ州ケーリー)を使用して、一元配置ANOVAとTukey HSDの事後分析を実施しました。

結果

Local B. jararaca venom 投与は、ND4 スイスの雄マウスの後肢触覚感度と組織浮腫の変化を引き起こします。

45 μg/kg B. jararaca venom の投与から 1.5 時間後、ND4 Swiss 雄マウスはベースラインより 3.0 g 低い圧力で後肢を引っ込めました (図 1A)。すべてのグループのベースライン離脱は、~4.5 g の印加圧力で発生しました。毒処理後、実験マウスは1〜1.5gの圧力で後肢を引っ込めました(データは示していません)。生理食塩水処理された対照マウスは、テストされたすべての時点で、ベースラインと比較して圧力に対する応答の減少をほとんどまたはまったく示さなかった。治療されたマウスの反応閾値の低下は、毒毒投与後3時間および6時間で明確に維持され(図1A)、24時間後には対照と区別がつかなかった(データは示さず)。毒マウスの後肢は、炎症に特徴的な組織浮腫を示しました。毒液投与後1.5時間で、前述した¹⁰と同様に測定した治療後肢の厚さは、ベースライン時よりも1.5mm厚かった。浮腫は3時間および6時間持続しました(図1B)。対照的に、生理食塩水で処理した足は、実験期間を通じて腫れや厚さの変化を示さなかった。ここに示す代表的な実験では、合計21匹のマウスをベースライン測定に使用し、14匹を実験に含めるために選択しました。これらは、ベースラインでの平均離脱反応が各グループ全体で約4.5gになるように治療グループに割り当てられました。.

B. jararaca 毒による触覚感度の変化は、肥満細胞の脱顆粒とND4スイスの雄マウスの後肢への好中球の流入を伴います。

触覚感度の増加と組織浮腫に加えて、毒物処理マウスと生理食塩水処理マウスの後足における好中球の流入(図2A-B)と肥満細胞の脱顆粒(図2C-D)も評価しました。好中球は、循環から病変に動員される最初の炎症細胞であり、炎症性侵害受容反応を媒介することが知られている^10,16,17。肥満細胞は組織に常在するセンチネル細胞¹⁸であり、肥満細胞の脱顆粒は、マウス¹⁰の後肢およびラット¹⁹の硬膜における侵害受容反応と関連している。

ここでは、毒物処理された後足への好中球の流入が、生理食塩水で処理された後足(図3A)と比較してほぼ1,000倍に増加したことを発見しました。これは、安楽死させたマウスから毒物投与後^1.5時間で採取されたヘマトキシリン-エオシン染色された4μmパラフィン包埋矢状足底組織切片10を数えることによって評価されました。

生理食塩水処理された足では、後足組織の足底肥満細胞はほぼ無傷であったか、または軽度の脱顆粒が見られました（図3B〉。対照的に、毒のある後足は、肥満細胞の中等度および広範囲の脱顆粒を15〜20%示しました(図3B)。上述の組織切片をトルイジンブルーで染色し、肥満細胞ごとに数えられた可視顆粒の数を観察して、前述の¹⁰の脱顆粒状態を確認した。

図 1.局所的なB. jararaca毒投与は、ND4スイスの雄マウスの後肢の機械的感受性の変化と組織浮腫を引き起こします。ベースラインの離脱閾値とベースラインの足の幅は、足底内 B. jararaca 毒 (Bjv; 45 μg/kg) またはビヒクル (生理食塩水) 治療 (10 μl) の 48 時間前と 24 時間前に評価されました。離脱閾値は、治療後1.5時間、3時間後、6時間後に評価されました(A)。足底中央部における平均足幅(マウスの左足と右足の平均幅)を、ベースライン時にデジタルノギスを使用して評価し、次いで治療後1.5、3、および6時間後に、前に説明したように組織浮腫を決定した¹⁰(B)。有意性は、Sal処理マウスと比較されます(*=p<0.05、**=p<0.01、***=p<0.001それぞれ)。n = 治療群あたり10〜11匹のマウス。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 2.B. jararaca 毒による機械的感受性は、肥満細胞の脱顆粒とND4スイスの雄マウスの後肢への好中球の流入を伴います。3匹のマウス/治療を治療後1.5時間で_CO2

ディスカッション

離脱反応の変化の測定は、痛みと炎症のげっ歯類モデルにおける触覚感度の変化を評価するために使用される重要なツールです。ここでは、この評価を実行するための電子フォン・フレイ装置の有用性を示します。この技術にはいくつかの利点があります:i)かなり近い複数の時点で複数のマウスに加えられた圧力に対する離脱反応を迅速に評価できる、ii)単一のチップを使用して組織の小さな領域に連続的かつ特定の圧力を加えることができる、iii)離脱反応を得るために加えられた正確な圧力を正確に測定できる、 iv) 堅牢なベースラインカットオフ、除外基準、および内部統制を簡単に実装して、行動評価が可能な限り正確かつ客観的であることを保証できます。

EvFアッセイの最良の結果を保証するための重要なステップは、機器の事前校正と一貫した測定方法です。プロトコルのセクションで詳しく説明されているように、機器は慎重に取り扱い、使用前および使用中に適切な校正を確保する必要があります。測定を行う前に、最適な機械機能を確保するために、試験重量の測定値を確認する必要があります。測定値が大幅に変動する場合、または試験重量の測定値が正確でない場合は、直ちに製造元に連絡して装置を校正する必要があります。これを念頭に置いて、機器の校正の予期しない必要性のために時間に敏感な実験を損なわないように、可能であればバックアップの電子フォンフレイ装置を用意することをお勧めします。さらに、十分に訓練された 1 人の研究者は、治療グループを知らせずに、特定の研究または一連の実験についてすべてのベースラインおよび実験測定を行う必要があります。マウスは、静かな部屋で評価し、一定の温度に保持し、少なくとも15分間EvFチャンバーに順応させるが、ストレスや不快感による行動の変化を最小限に抑えるために、必要以上にチャンバー内に拘束しないでください(特に1日以内に複数の測定が行われる場合)。

EvF測定は、既存のCvF技術と比較して大幅な改善をもたらします。研究者は連続的な圧力を加えることができ、CvFフィラメント実験6で行われているように、さまざまな重量の先端を切り替える^{必要はありません。}これにより、組織を突くことが少なくなり、特に炎症を起こしたり損傷したりした場合に関係します。CvF測定で使用される利用可能なフィラメント重量によっても制限される50%の引き抜き測定を使用して、引き抜きが発生する正確な圧力を測定できます¹³。合理的で均一な除外基準を実装できるため(上で説明したように)、実験の開始時にすべてのグループが同様の平均ベースラインを持つように、マウスを実験グループに割り当てることができます。EvF測定は、絶対的な反応自体ではなく、特定の刺激に対する行動反応 の変化 を評価します。したがって、侵害受容反応における各マウスの変化は、個々の実験離脱とベースライン離脱の差として測定され、行われたすべての測定の内部制御が提供されます。

おそらく、EvFの最も重要な制限は、手動の対応物と同様に、同じ研究者が特定の一連のベースライン測定と実験測定のすべての測定を行う必要があることです。そのため、時間、人員、設備の観点から、技術のスケールアップが困難になっています。一度に~20匹のマウス(アッセイチャンバーの構成に応じて)は、測定間に少なくとも45分ある場合、複数の時点で30〜45分以内に測定できることがわかりました。この点に関連する考慮事項は、個々の実験者の学習曲線です。個々の研究者が本格的な実験に着手する前に、内部の一貫性を確立する必要があり、これには、望ましい一貫性に達するまで、ベースライン応答測定を繰り返す何時間もの献身的な練習が必要です。さらに、ベースラインカットオフを使用することは、実験のためにベースライン化されたすべてのマウスを含めることができるわけではないことを意味します。実験ごとにベースラインされたマウスの25〜30%が通常除外されていることがわかりました。

変更と将来の応用の観点から、EvF行動測定は、炎症の病状の根底にある可能性のある付随する急性および/または慢性の痛みを分析するために、炎症の幅広いモデルに強力な次元を追加します。毒液化では、ND4雄マウスの後足における組織の腫れ、白血球動員、および肥満細胞の脱顆粒の期待される結果を伴う触覚感度の顕著で急速な変化が伴うことがわかりました。これらの発見は、ラットの熱感受性²⁰およびCvF²¹を使用して測定されたND4スイスマウスのB.ジャララカ毒によって誘発される機械的感受性に対するマスト細胞メディエーターの寄与に関する以前の観察を裏付けています。EvFプロトコルは、後足以外の組織、例えばCvFが現在使用されている腹部⁷および肛門生殖器隆起⁸で使用するために簡単に変更することができます。アレルギー、創傷治癒、神経障害、その他の病状のげっ歯類モデルは、後足を含む組織およびそれ以外の組織における機械的感受性の測定を含むように簡単に適応できます。

要約すると、EvF は、げっ歯類の侵害受容を測定する古典的なアプローチを更新する有用で効果的な技術であり、幅広い疾患モデルにおける痛みの複雑な根底にあるメカニズムを調査するための重要な新しいツールです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ND4 スイスのオスマウス	Harlan	0-32	ここで使用したマウスは生後8-12週齢で、マカレター大学のIACUCガイドラインに従って飼育および使用されました。
3 ml / 100インスリンシリンジ、29 G 1/2インニードル	BD	入り	BD BD309301 使用後は、各使用後、適切な容器に廃棄してください。
B. jararaca毒	Sigma	V5625	注意:有毒物質。目と皮膚の保護具を着用してください。滅菌0.9%生理食塩水に溶解します。
電子フォン・フレイ装置; プローブ = 90 g 範囲	IITC	2394	静かに動かし、常に水平であることを確認してください。プローブをゼロにするには、「プログラム」と「クリア」を押します。セットアップモードから動作モードに切り替えるには、「ファンクション」(「MH」読み出しの場合)または「MAX」を押します。
メッシュスタンド + PMMAチャンバー	IITC	410	すべての側面にアクセスするために、安定したベンチトップまたは4つの車輪付きのカートに置きます。
電子フォンフレイ硬質チップのみ、90 g レンジ	IITC	2390	n/a