ここで報告されたプロトコルは、細胞株における光線力学療法（PDT）の有効性および動物モデルにおいて治療を適用する前に、PDTの設定の最適化の評価を可能にする。
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方法論記事
骨肉腫細胞における光線力学療法の細胞毒性有効性
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
近年では、より少ない全身性副作用、癌に対してより効果的な治療法を見つけることが困難であった。したがって光線力学療法は、それ以上の腫瘍選択的治療のための新規なアプローチである。
酸素の存在下で特定の波長の光で活性化されると、細胞傷害性応答を誘発する1酸素ラジカルを生成し、非毒性の光増感剤（PS）を使用する光線力学療法（PDT）。 FDAによる、ほ ぼ20年前の承認にもかかわらず、PDTは、最近だけのタイプの癌（皮膚、膀胱）とnononcological疾患（乾癬、光線性角化症）2限られた数の治療に使用されます。
PDTの使用の主な利点は、全身性の副作用を防止する局所治療を行うことができることである。また、（神経や血管の周囲などで ）繊細な部位における腫瘍の治療を可能にする。ここでは、intraoperatPDTのIVEアプリケーションは、骨肉腫（OS）で、原発腫瘍の衛星を対象とする骨の腫瘍は、外科的腫瘍切除後に周囲の組織の腫瘍に残さ考えられている。治療は、再発の数を減少時と（術後の）転移のリスクを低減することを目的とする。
本研究では、十分に確立されintratibial OSマウスモデルにおいてヒトの疾患を再現するために使用される広く使用されているOS細胞株の効果的な治療のためのPDTの最適な設定を確立するためにインビトロ PDT処置で提示する。分光光度計や光毒性は、WST-1アッセイを用いて、および生存細胞の計数によって評価し、細胞死を誘導するために652 nmでのmTHPCのレーザー光励起により引き起こされたとPS mTHPCの取り込みを調べた。確立された技術は、動物モデルでの今後の研究のために最適な、PDTの設定を定義するために私達を可能にする。彼らは、PDTの有効性を評価するための簡単かつ迅速なツールです生体内での適用前にin vitroで。
概要
骨肉腫の芸術治療の現在の状態（OS）、原発性骨腫瘍は、ネオアジュバント化学療法と手術との組み合わせを包含する。この治療計画は、現在、60〜70％3、4との間に、化学療法の使用前に約20％からローカライズされた疾患を有する患者の生存率の増加を明らかにした。しかし、過去20年間、地元の疾患を持つOSの患者の全生存期間は4、5を頭打ちしている。さらに、これらの患者の30〜40％は、診断後3年以内に再発および転移性疾患の患者は、20から30パーセント4、6、7の貧しい人々の生存を持ち続ける。これらの患者の転帰を改善するために、新たな治療戦略を開発する必要がある。
光線力学療法（PDT）、むしろ新規な抗癌治療は、photosensiの励起のために特定の波長の光を使用する血流への注入後に腫瘍細胞中に蓄積tizer（PS）。 PSのレーザー光励起は、腫瘍細胞および細胞死を細胞毒性反応を誘発し、酸素の存在下で酸素ラジカルを生成する。この主要なメカニズムに加えて、二つの追加PDTは生物学的プロセスが減少し、腫瘍の成長に寄与する誘発：PDTは、腫瘍の微小血管の血管収縮および血栓形成を引き起こすと、腫瘍内部の結果として、地元の低酸素および無酸素、腫瘍梗塞につながる。最後に、PDTは負傷し、瀕死の腫瘍細胞が局所的免疫応答、PDTのかなりユニークな機能をトリガします。これは、補体系及び樹状細胞の抗原提示8....
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プロトコル
1。それぞれの低および高転移性HOSおよび143B、OSの細胞株におけるmTHPCの取り込みを比較する
- DMEM、ハムF12、及び比4.5:4.5:1の熱不活性化ウシ胎児血清を含む細胞培養培地を調製する。
注：PS mTHPCのリポソーム製剤を1.5 mg / mlのmTHPCの最終濃度で水に溶解した。 - プレート0.2×10 6 HOSおよび143B細胞/ 6ウェルプレート（各条件について三重）での、細胞を一晩接着してみましょう。
注：番号は個々の細胞株に調整しなければならない。 80から90までパーセントの集密度は、実験時に最適です。 - 次の日に、異なる期間（時間依存性の取り込み）用、又は一定時間（用量依存性の取り込み）の間mTHPCの濃度を増加させてmTHPCの固定濃度で細胞をインキュベートする。
- 特定の時間PのためmTHPCで細胞を培養するointsまたはmTHPCの濃度。
注：本研究では、HOSおよび143B細胞株の両方が5時間0.6μg/ mlの0のためmTHPC、2.5、5、または10時間、または0で、0.6、2.5、および10μg/ mlのmTHPCとインキュベートした。印加される期間及び投与量は、使用される細胞株に依存して変化し得る。 - 常に細胞の直接露光を防ぐために、暗闇の中、または淡色表示光の状....
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結果
ここで報告された技術では、我々人間のOS細胞内mTHPCベースのPDTを調査した。まず、mTHPCの時間および用量依存的取り込みは、低転移HOSおよび高転移143B OS細胞株で調べた。 mTHPC取り込みは、蛍光分光光度計でmTHPCの蛍光を測定することによって評価することができる（レイディらからの許可を得て複製、 図2、 図11）。 図2Aは、時間依存的にmTHPCの取り込みを示す。細胞懸濁液の蛍光強度は、mTHPCの細胞内レベルを表す。 図2Bは、5時間のインキュベーション後HOSの用量依存mTHPC取り込みおよび143B細胞を示す。高転移性細胞株143Bでの取り込みは、低転移親HOS細胞株に比べて高い傾向にあった。
暗い143B細胞におけるmTHPCの光毒性は、細胞metaboliを測定することによって評価した（WST-1アッセイと）とmTHPC、230秒、暗所で24時間、さらにインキュベーションの.......
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ディスカッション
PDTに応じて最適な細胞毒性を達成するためには、右のレーザ光設定およびインキュベーション時間を選択することが重要である。ここで説明する手順は、PSの取り込みを決定し、in vitroで 、PDT誘導される細胞毒性を定量化するために一貫性があり、効率的です。 PS mTHPCの特定の吸収波長を用いて、PSの細胞取り込みは、直接的に決定することができ、PSは、細胞傷害性活性酸素種を生成するために活性化することができる。
このインビトロセットアップを使用して、例えばPS濃度、薬物光間隔とレーザ光 の強度などのすべてのパラメータが容易にPSと使用した細胞株の特性に調整することができる。細胞数は一緒に、WST-1アッセイ（代謝活性をモニターする）で、細胞の生存のための良好な推定値を与える、生き残っ付着した細胞から直接読み取りができます。しかし、提示された方法は、細胞毒性すなわち 、「最初のヒット"をモデル化することができますすぐにPSの活性化後の活性酸素種。 in vivoでのその後の血管収縮を観察し、完.......
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開示事項
著者らは、競合する経済的利益や利益相反を宣言していません。
謝辞
作者は親切に彼らの助けのためのスザンナグレーフェとアルノWieheに感謝し、技術的な専門知識と、リポソームmTHPC製剤を私たちに提供するためbiolitecリサーチ社（イエナ、ドイツ）に感謝したいと思います。また、結果の大部分を生成し、その出版11 coresponsibleたカースティンレイディを、感謝したいと思います。
この作品は、Schweizerischerの法令に基づく連合組織体Balgrist、チューリッヒ大学、チューリッヒKrebsligaだけでなく、ウォルター·L.とヨハンナウルフ財団、チューリッヒ、スイス、EuroNanoMed ERA-NET / SNFスイスからの助成金からの助成金によってからの補助金によって支えられて国立科学財団31NM30-1分の131004。この作品はまた、カントンチューリッヒの筋骨格系の腫瘍学のためのHSM（高度専門医療）プログラムによってサポートされていました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-883 | |
| HAM F12 | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-817 | |
| Heat-inactivated fetal calf serum | GIBCO, Basel, Switzerland | 10500-064 | |
| mTHPC | biolitec Research GmbH, Jena, Germany | このリポソーム製剤はR&;D 現在カタログ番号はありません。在庫:1.5mg / ml;ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)とジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG;純度>99%)の9:1混合物で提供されます | |
| Spectramax Gemini XSプレートリーダー | Molecular Devices、サニーベール、CA | ID# 861 | |
| 顕微鏡 Zeiss Observer.Z1 | Axio Observer、Axio Vision Release 4.6.3 SP1、イエナ ドイツ | ||
| Ceralas PDT 652 nm Laser | biolitec AG、イエナ、ドイツ | LD652nm2W400u | |
| 水溶性テトラゾリウム(WST)試薬 | Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland | 1644807 |
参考文献
- Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications. Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).
- Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA Cancer. 61, 250-281 (....
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再版と許可
