ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来

Summary

このプロトコルは、単一の細胞懸濁液に解離することなく、球状の神経幹細胞および前駆細胞集合体の拡大を可能にする新たな機械的なチョッピング方法が記載されている。細胞/細胞接触を維持することは、40以上の継代するための迅速かつ安定的な成長を可能にします。

Abstract

研究実験および臨床試験のための単一の試料から多数の細胞を蓄積するための細胞増殖技術が大幅に幹細胞のコミュニティに利益をもたらす。現在の多くの拡張方法は、労力を要し、高価であり、かつ完全な解離を伴うものは、いくつかの幹細胞および前駆細胞型の分化または早期老化を受ける可能性があります。これらの問題を克服するために、我々は、簡単かつ安価である「チョッピング」と呼ばれる自動化された機械的な継代方法を開発した。この手法は、単一の細胞に化学的または酵素的解離を回避し、代わりに一定の細胞/細胞接触を維持中断、スフェロイド培養の大規模な拡張が可能になります。チョッピング方式は、主に胎児脳由来の神経前駆細胞又はニューロスフィアのために使用されており、最近では、胚及び誘導多能性幹細胞由来の神経幹細胞で使用するために公開されている。プロシージャinvolvES組織培養ペトリ皿にニューロスフェアを播種し、その後効果的に手動で機械的に球を解離させる退屈なプロセスを自動化するセルを鋭い、無菌刃を通す。培養中で細胞を懸濁する良好な表面積対体積比を提供する。 50万の細胞は直径が0.5mm未満の単一神経球内で成長させることができるように。 1 T175フラスコ中に、5000万個以上の細胞でのみ1500万接着培養中に比べて懸濁培養で成長することができます。重要なのは、チョッピング手順は、臨床グレードの細胞産物の大量量産を可能とする、現在の適正製造基準（cGMP）の下で使用されています。

Introduction

単層^1-3または集約ニューロスフェア^4-7のいずれかとして、培養中のげっ歯類の神経幹細胞を増殖の長い歴史があります。また、現像^8-17中枢神経系の種々の領域から単離されたヒト神経前駆細胞（hNPCs）をインビトロで増殖されている。これらの細胞は、双方向性、強力、星状細胞及び神経細胞の両方に分化することができると神経の発達^18,19及び疾患メカニズム^20,21を研究する上で非常に有用なツールとなっている。 hNPCsまた、統合、生存および機能的効果^22〜24種々のレベルの中枢神経系疾患の多くの異なる動物モデルに移植されている。

多くの場合、上皮成長因子（EGF）および/ ​​または線維芽細胞増殖因子^{-2（FGF-2）25-28} - - 、付着^29、三両方伝統的には、齧歯類またはヒト胎児由来のNPCは、増殖因子に暴露される次元スフェロイドシステムは、典型的には単一細胞懸濁液^30-34に酵素的解離を使用して継代する。研究や臨床用細胞を拡大する標準的な方法は、容易な操作のために接着単層としてある。しかし、我々は、酵素的または化学的溶液で継代単層およびニューロスフェアhNPCs、早期老化³⁵をもたらしたことを示した。加えて、酵素的解離は、胚性幹細胞

Protocol

1。倫理声明と安全

1. この手順は、ヒトまたは動物由来の細胞培養物の使用を含む。すべての派生組織は、適切な治験審査委員会（S）および/または施設の動物実験委員会（S）で使用する前に承認されなければならない。
2. すべてのバイオ有害廃棄物は、それぞれの機関が合意決定安全規則に従って廃棄しなければならない。この手順全体でしっくり来るの安全および廃棄に関するガイドラインのすべてを知っているとフォロー。

機器の2。準備、消耗品、試薬、および観測

1. 準備
   1. ガラスシャーレ8.5センチ濾紙円、ダブルエッジプレップブレードを得た。
   2. ペトリ皿中の濾紙片を置き、ペトリ皿内の濾紙上にいくつかの非被覆ブレードを転送する。
   3. 繰り返し層ろ紙およびブレードペトリ皿はおよそ75パーセント満杯になるまで、カバーウィットHペトリ皿のふた、オートクレーブ。無菌性を維持するために、無菌または密閉環境で保管してください。
   4. オートクレーブ18センチメートル鉗子や滅菌袋内のオートクレーブナットドライバー。 cGMP産生のために、滅菌パウチ内のいくつかのステンレス鋼のシムディスクをオートクレーブ。シムディスクの詳細については、ステップ3.5を参照してください。
   5. 70％イソプロピルアルコール（IPA）でバイオ安全キャビネット（BSC）をサニタイズ。
   6. すべての手順は....

Results

図5。代表的なデータ。A）は、チョッピングメソッドを介して継代したニューロスフェアに比べて酵素的解離を使用して接着単層として解凍し、拡大し、P19で凍結hNPCsの細胞数を予測した。細胞はP20で解凍したとき、0日目に表しています。B）は球の代表的な画像を事前にチョップ、球後CHOP、10X、D）色見本は、メディアのコンディショニングの範囲を記述するために使用されるのcGMPの10倍。C）代表的な画像比較可能なプロトコルをサポートします。E）1日のためにプレーティングし、ネスチン（赤）の発現について染色した解凍されたP29のhNPCsの免疫細胞。ヘキスト核対比染色（青）、F.......

Discussion

図6。チョッピング回路図 。機械的なチョッピング法を用いて、培養中の回転楕円体幹/前駆細胞を拡大する。

重要なステップ

チョッピング膨張パラダイムの概要を図6に示す。HNPC球サイズがニューロスフェアを継代前に観察するための重要な基準の1つである。球体サイズの大きな分散があるが、球体の少なくとも30％が300ミクロンよりも大きい直径を有するべきである。球が通路に小さすぎると1-4日後に、単に新鮮なMM（25％-50％）でCMを交換し、再評価する。球体は直径が小さすぎるで継代したとき悪い膨張率が発生します。

HNPC膨張率も球.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ビーカー、50 ml	フィッシャーブランド	FB-100-50	複数のメーカー/サプライヤー
バイオセーフティ キャビネット、クラス II	ベーカー	SG-603A	4 フィートまたは 6 フィート モデルをお勧めします。複数のメーカー/サプライヤー
ブレード、ダブルエッジ プレップ	ペルソナ	74-0002	複数のメーカー/サプライヤー 注意: シャープ
セル凍結培地	Sigma-Aldrich	C6295-50ML	DMSO、無血清
遠心分離機、15mlインサート付きスイングバケット	Eppendorf	5810 R	複数のメーカー/サプライヤー
コニカルチューブ、15 ml	フィッシャーブランド	S50712	複数のメーカー/サプライヤー
コニカルチューブ、50 ml	BD ファルコン	352074	複数のメーカー/サプライヤー
制御速度冷凍庫プレー	ナー	Kryo 750	複数のメーカー/サプライヤー
クライオバイアル、2 ml	コーニング	430488	複数のメーカー/サプライヤー
培養フラスコ、通気孔、T12.5	BD ファルコン	353107	複数のメーカー/供給
培養フラスコ、通気孔、T25	BD ファルコン	353081	複数のメーカー/サプライヤー
カルチャーフラスコ、ベント付き、T175	BDファルコン	353045	複数のメーカー/サプライヤー
チャーフラスコ、ベント付き、T75	BD Falcon	353110	複数のメーカー/サプライヤー
フィルター、0.22 & マイクロ;m、付属のカップ、1 L	ミリポア	SCGPU11RE	複数のメーカー/サプライヤー
フィルター、0.22&マイクロ;m、付属のカップ、150 ml	ミリポア	SCGVU01RE	複数のメーカー/サプライヤー
フィルター、0.22&マイクロ;m、付属のカップ、500 ml	ミリポア	SCGPU05RE	複数のメーカー/サプライヤー
フィルター、0.22&マイクロ;m、付属カップ、50 ml	ミリポア	SCGP00525	複数のメーカー/サプライヤー
濾紙、8.5 cm 円	Whatman/GE	1001-085
鉗子、標準パターン - 鋸歯状/湾曲/18 cm	ファイン サイエンス ツール	11001-18
冷凍室、イソプロピル アルコール	Nalgene	5100-0001	"Mr. Frosty"
インキュベーター、37 °;C/5% CO2	Forma	370 series	複数のメーカー/サプライヤー
血球計算量計、Phase	Hausser Scientific	1475	複数のメーカー/サプライヤー
McIlwain Tissue Chopper	Lafayette Instruments	TC752-PD&	nbsp;ペトリ皿の改造が必要です。  ご注意: 動く、鋭い刃。
マイクロピペッター、1-10 μl	ギルソン	F144562	複数のメーカー/供給者
マイクロピペット、100-1,000 μl (スターターキット)	ギルソン	F167700	複数のメーカー/サプライヤー
マイクロピペット、2-20 μl (スターターキット)	ギルソン	F167700	複数のメーカー/サプライヤー
マイクロピペッター、20-200 μl (スターターキット)	ギルソン	F167700	複数のメーカー/サプライヤー
ナットドライバー、オートクレーブ可能、5/16インチ	ステリツール	10302
パスツールピペット、綿目抜き	フィッシャーブランド	13-678-8B	複数のメーカー/サプライヤー
ペトリ皿、ガラス、オートクレーブ可能	コーニング	3160-100
ピペットエイド	ドラモンド	4-000-101	複数のメーカー/サプライヤー
シムディスク	マクマスター・カー	変数	複数のメーカー/サプライヤー
滅菌バリアピペットチップ、10 μl	AvantGuard	AV10R-H	複数のメーカー/サプライヤー
滅菌バリア ピペット チップ、1,000 μl	AvantGuard	AV1000	複数のメーカー/サプライヤー
滅菌バリアピペットチップ、20 μl	AvantGuard	AV20-H	複数のメーカー/サプライヤー
滅菌バリア ピペット チップ、200 μl	AvantGuard	AV200-H	複数のメーカー/サプライヤー
滅菌済み使い捨てピペット、オールプラスチックラップ、10 ml	フィッシャーブランド	13-676-10J	複数のメーカー/サプライヤー
滅菌済み使い捨てピペット、オールプラスチックラップ、2 ml	フィッシャーブランド	13-675-3C	複数のメーカー/サプライヤー
滅菌済み使い捨てピペット、オールプラスチックラップ、25 ml	フィッシャーブランド	13-676-10K	複数のメーカー/サプライヤー
滅菌済み使い捨てピペット、オール プラスチック ラップ、5 ml	フィッシャーブランド	13-676-10H	複数のメーカー/サプライヤー
滅菌ポーチ、19 x 33 cm	Crosstex	SCL	複数のメーカー/サプライヤー
ストレーナー、40 & マイクロ;m	BD Falcon	352340
組織培養皿、60 mm	BD Falcon	351007
チューブラック、インターロッキング 4 ウェイ	フィッシャーブランド	03-448-17
ウォーターバス	フィッシャーブランド	S52602Q	複数のメーカー/サプライヤー
神経前駆細胞 細胞特異的処理試薬
神経幹細胞拡張媒体(ステムライン)	シグマ・アルドリッチ	S3194-500ML	ムラインブランドを使用する上で重要
組換えヒト上皮成長因子(EGF)	ミリポア	GF316	複数のメーカー/サプライヤー
組換えヒト白血病抑制因子(LIF)	ミリポア	LIF1010	複数のメーカー/サプライヤー
トリパンブルー(0.4%)	シグマ・アルドリッチ	T8154-100ML	複数のメーカー/サプライヤー
TrypLE Select (1x)	Life Technologies	12563-011