における虚血/再灌流のための無酸素飢餓モデル<em&gt; C.虫</em

サマリー

プロトコルは、Cで酸素欠乏症/飢餓を使用していますことが記載されている虚血/再灌流をモデル化するエレガンス 。機能的転帰は、死亡率の増加、GFP標識神経突起で見える異常、および神経機能を必要とする障害のある行動反応が含まれています。

要約

遺伝的モデル生物C. elegansの酸素欠乏症/飢餓のためのプロトコルは、虚血/再灌流をシミュレートします。ワームは、細菌の食品から分離され、無酸素下に置かれた20時（シミュレートされた虚血）のために、その後の食品（シミュレートされた再灌流）と通常の大気に移動されます。この実験的パラダイムを大きく死および神経損傷をもたらし、および技術は、生物の生存率を評価するために提示される、神経機能の行動出力を表すタッチニューロンプロセスの形態と同様に、タッチ感度の変化。最後に、一般的なキッチンの貯蔵容器を使用して、低酸素培養器を構築するための方法が記載されている。改変は、カスタムインキュベーター内のガス混合物に対して行われるの付加質量流量制御ユニットができ、循環水浴は、両方の温度制御を可能にし、漏れを同定することを容易にする。この方法は、商業的に低コストの代替を提供する利用可能な単位。

概要

線虫は広くブレンナー¹によるその導入以来、多細胞真核生物のモデル生物として採用されている線虫である。これは、遺伝的変化および表現型間で簡単にリンクが^2を変更可能にする安価で、簡単で、汎用性の高いモデルです。

虚血は、反応性酸素種のバーストが^3を作製し、損傷のほとんどが発生し、続いて再灌流組織への栄養素および酸素供給の欠如によって特徴づけられる。 2002年には、Cの虚血/再灌流（IR）のモデル虫は通常の条件下で24時間に続いて、約20時間、無酸素、栄養欠乏や熱ストレスに全体ワームを提出含む^4を開発した。このモデルは、技術的に無酸素飢餓（AS）の条件ではあるが、細胞死は、再灌流の間に酸化剤によって誘発された損傷を含む哺乳動物において保存されているメカニズムは、を介して行われます ^{5。 Cと同様により誘導され、さらに、哺乳類のIRと同様に、損傷虫は虚血プレコンディショニング、6,7または麻酔前処理8,9を防止することができる。}

以下のプロトコルは、C言語でのIRを模倣する方法を示し虫 ASから生じる形態学的および行動異常を獲得する方法を、ASモデルを使用して、どのように実験をカスタムメイド、簡単に構成されたチャンバーの代替を使用してより低い初期投資で行うことを可能にする方法で、プロトコルを適応させる。

プロトコル

1。C.虫の成長

1. 35ミリメートル線虫増殖培地（NGM）を準備し、寒天プレートは、標準的な栽培方法¹に従って、OP50細菌を播種。
2. シードされたNGMプレートに6妊娠成人を配置することにより、 線虫を同期します。 〜100卵（〜3時間）敷設された後に成人を削除します。
3. ワームは若年成人期に開発され、この実験のために最適であることになる、その時点で20℃で3日間培養する。 Cを同期するための代替プロトコル虫は、他の場所で¹⁰記述されている。

2。 ASのための材料

1. M9緩衝液（22mMのKH ₂ PO _4、42mMののNa ₂ HPO _4、86 mMのNaCl、1mMのMgSO _4）し、実験前に30分間（アルゴンを使用することもできる）N ₂で平衡化することによって酸素をパージされたいと氷に囲まれ続けた。
2. 小さな穴（3ミリメートルを作る）幅を1.5 mlマイクロチューブのふたにするワームは、AS間に配置されます。これは、過剰なメディアの蒸発につながることができように穴が開いた蓋を維持することなく、ガス交換を可能にします。

3。無酸素症/飢餓

1. 少なくとも三連ですべての実験を行っています。
2. 上記のように成長し、若い成虫を含む各35ミリメートルプレートに、RTの1ミリリットル、酸素化のM9バッファーを追加します。 （細菌が播種されていないエッジにM9を追加）をプレートから細菌を削除しないように注意してください。 〜1分後、ワームはM9で泳ぐ必要があります。
3. ピペット及び滅菌の1％BSA溶液を排出することによりコートBSAで1mlのピペットチップ。
4. 慎重にM9バッファ内のワームを含むプレートを傾け、それを添加した同じ場所からM9を削除し、準備されたマイクロ遠心チューブにサスペンションを配置。ワームは、チューブの底に落ちているまで氷で休息をしましょう​​（〜1-2分）。
5. （約100μLを残す）チューブからワームを乱すことなく可能なM9の最大量を削除し、酸素をパージし、アイスM9の1ミリリットルを追加し、ワームが再び底に沈殿するまで、氷の上のチューブを配置します。最後のステップ3回繰り返します。 〜100μlをチューブ内に残るまで最後の洗浄では、M9を削除します。
6. （3.6.2項は、以下の手順を参照してください）​​カスタム密閉された容器に、あるいは、（以下の手順は、セクション3.6.1を参照）、または無酸素/低酸素チャンバー内の脱酸素M9でのワームとチューブを配置します。
   1. 商業無酸素/低酸素室を使用する場合は、ステップ3.5を起動する前に室内にいくつかのパージM9を残して、ワームが室内にあると、ステップ3.5を繰り返します。
   2. カスタム·チャンバを使用する場合は、低コストの装置を作成する方法の詳細な説明は、このプロトコルの終わりに提示され、以前に¹¹別のグループによって記載されている。簡単に言うと：
      1. 250ミリリットルタッパーウェア型容器の蓋に二つの穴を作り、それらにチューブコネクタを追加します。一方が他方の水浴内へのガス出口であって、一方のガス混合物を注入するために使用される。
      2. チャンバー内にワームを置き、蓋を使用してチャンバーを密閉する。
      3. 一定のN ₂フラックス（100ml /分）を有するガス。
      4. 26℃の水浴の中に容器を置き漏れが（チャンバ自体から発生する気泡によって見かけ上の）システム内に存在しないこと、および空気が返すように出口管が十分に水に浸されていることを確認します。
7. 20時間26℃でワームをインキュベートする。

4。シミュレートされた再灌流

1. AS条件下での20時間後に、室内空気中にインキュベーションチャンバーからチューブを取り外します。
2. ピペットで OP50の上に（ステップ3.3のように）、BSAでコーティングされたチップを用いて虫が 35ミリメートルのNGMプレートを播種した。 24時間20℃で培養する。この後、ワームは採点されできるようになります。

5。ライブワームVERSUSデッドの識別

1. プラチナのピックを使用して、軽くワームの頭の上をタッチします。ライブワームは触れられることの後に逆方向に移動します。ワームは応答しないであれば、死んだように得点。時折、ワームは後方に移動しませんが、わずかに左右に頭の動きを示すことができる。技術的には死んではいないが、これらのワームは、数時間以内に期限切れになることはほぼ確実であり、死んだとして採点されるべきである。 1ワームスコアが遅れる場合は、子孫の内部ハッチングが発生する可能性がありますし、これらの「バッグ·オブ·ワームは、「非常に困難な死体を検出すること、破裂することができます。
2. これらは重複してカウントを避けるためにカウントされるように、プレートの両方から生死ワームを削除します。ライブワームは行動アッセイを実行するために別のプレートに移動することができます。合計に対して生きているワームの量は、生き残ったワームの％として表されます（ 図1（A） ）。

6。応答アッセイをタッチ

1. このプロトコルの詳細な説明は、ハート、アンC.編で提示されている。行動（2006年7月3日）、WormBook、エド。 C.虫研究コミュニティ、WormBook、doi/10.1895/wormbook.1.87.1、http://www.wormbook.org。
   1. タッチレスポンスに得点を、移動して軽くまつげピック（ 図3）と（咽頭の中央部付近で）ワームの頭部の側面に触れているワームを識別します。
   2. ワームは後方に移動した場合、などの応答性のスコア、そうでない場合、（ 図1B）などの非応答スコア。 10秒間隔でそれぞれのワームについて、このステップ10-15Xを繰り返します。正確なデータを有するように、各グループに少なくとも10ワームプローブ。同じアッセイは、前方、後方、体壁に軽いタッチを、次の運動器官の変化を評価するために使用することができる。これは明確な行動を刺激するので、ワームの頭や尾に触れないようにしてください。
   3. 最後に、中企業の遺伝子制御系統[負のポジティブ、MEC（機械刺激）変異体のためのN2ブリストル野生型- 例えば CB1338 MEC-3（e1338）IV]ワームに触れることをする力をキャリブレーションする。刺激の厳しすぎる少な野生N2コントロールで効果を引き出すませんが、MECの変異体における行動反応を誘発する。

7。神経細胞の変更

1. 神経細胞の修飾などのポストを視覚化するために、タッチ応答MECニューロン^4,5にGFPを表現株を用いる。これらのニューロンは、体壁に沿って実行され、簡単に形態異常のために採点され、長いプロセスがある。また、形態学的情報は、上述したように、神経機能の行動尺度と統合することができる。この目的のために使用することができるOne株はC. TU2583から入手可能である虫遺伝学センターとあちこちGFPを発現uIs25組み込まれた導入遺伝子が含まれています統合MEC-3 :: GFP融合が含まれているMEC-18プロモーター、あるいはTU2562を、メートル。
2. アガロースパッドを準備します。
   1. 水にアガロース2％を溶かす10倍の在庫を1X M9にもたらす、そして70℃でのソリューションを維持
   2. その下側にテープの一枚を持ってそれぞれが2他のスライドの間に配置されたガラススライド（X 75ミリメートル25ミリメートル）で、この溶液の液滴（〜20μL）を配置します。
   3. 2％アガロース溶液の上に最初に垂直最終ガラススライドを置き、それが室温で冷ます。これは、テープの厚さのパッドを形成すべきである。
   4. 一番上のスライドを削除し、ワームを固定します0.1％テトラミゾールを含むM9の10μLを追加。
3. 2％アガローススライド上にワームを生きて、いくつかの（〜10）を移動させる。それらの上にカバースリップを置き、適切な照明と100Xの対物レンズ下で蛍光顕微鏡を用いてGFPを可視化する。
4. 損傷を受けたニューロンは、複数の涙（ 図2A）で構成プロセス、および/ ​​またはプロセス（ 図2B）が壊れているように見える異常における真珠パターンの細胞質ゾル膜文字列が表示されます。少なくとも10ワームの合計を使用して、各ワームのための両方の神経細胞における涙点や異常を数える。

8。ラボ製低酸素会議所

1. タッパーウェアスタイル、密封可能な、密閉容器は、無酸素室として改造することができます。可能な限り小さいコンテナを選択するように注意してください。小さ ​​な容器は、より高速、低酸素環境を作成します（ 図4）の水浴中に収まるように簡単です。
2. 蓋の上に二つの穴を作る（ドライバーでまたは鉗子を加熱し、蓋に強制することによって行うことができます）、チューブ（ 図5A）をフィットするプラスチックまたは金属のコネクタを挿入します。水の下に配置することができ、接着剤を使用し、またの動きを避け、乾燥した後に、ハードを取得コネクタひいては漏れ（ 図5B）の可能性を低減。
3. それは（ 図4）を完全に浸漬されるように、容器を水浴中に配置されるべきである。コンテナを浸漬すること、ボトル重量やダイビングの重みを使用しています。
4. チューブ接続の1つは、ガス混合物および他のチューブが容器は外部環境（ 図4）から密封されるように、それは水の下に残されるべきであるため、圧力逃がしとして作用する導入するために使用される。
5. 空気組成は、カスタムメイドガス、マスフローコントローラまたは所望のガスを混合する任意の装置を用いて調節することができる。高流量が過剰に蒸発を作成できるように、ガス流は、制御されるべきである。例えば、250mlの容器内に、ガスを100ml /分ウォームの良好な空間および適切なフラックスを提供する。
6. それらはガスであり、aに対して透過性とすることができるように、チューブの長さは、最小に保たれるべきであるllowing O ₂の入り口。これらの材料はガス交換に透過性であるように、シリコーン、タイゴンチューブを使用しないようにすることが重要です。私たちは、ポリプロピレンまたはナイロンチューブを好む。ガラスや金属管はよくガスを維持するだけでなく、で動作するように困難です。

結果

供することでカスタムラボメイドインキュベーションチャンバー内の26℃でのASの20時間に虫説明したように（3.6.2項）が相当な死亡率（ 図1A）の結果^5。生存者の神経突起のラベルが付いたGFPでの涙や休憩のその後の蛍光イメージングは、形態異常（ 図2）の存在が確認された。生存者は、光体壁タッチ（ 図1B）にはあまり反応した。このモデルは、遺伝的素因、薬学的介入、および代謝の可塑性がAS依存成果^{4-6,8,9,12,13}にどのように影響するか^を研究するために、複数のグループによって使用されています。

図1。 で後の生存とタッチレスポンスエレガンス24時間後に、生存を示すワームのものです。A）の割合。 N2株は野生型の遺伝的背景であり、KWN85はGFPでMECの神経細胞を標識する統合された導入遺伝子が含まれています。生きているCの刺激に触れるB）応答ASの後に虫 （N 2系統）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2。このような曲がりくねったプロセスや切断（A）またはプロセス（B）におけるGFP凝集体の蓄積などのASの後ニューロンの修正をタッチします。タッチニューロン（PLMLとPLMR）異常 ​​が存続中でモニターした温度を麻酔eleg ANS AS後。

図3。まつげピック。組み立てまつげピック。挿入図では、まつげの詳細は、爪楊枝の木に釘付け。

図4。ラボ製水浴内部の低酸素室。実験を開始する準備が密閉された容器。矢印は、ガス入口と出口と浮動からそれを維持するために使用するボトル重量を示している。

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図5。容器の蓋の内側と外側の詳細。 A）容器蓋の外側を、以前に形成された孔に付着し、チューブ、コネクタを示す。B）容器蓋の外側を、以前に形成された孔に装着チューブコネクタを示す。

ディスカッション

C.広くに使用されているAS IR傷害をモデル化するエレガンス 。いくつかの重要なポイントは、このプロトコルのために強調表示されます： 線虫は、このシステムを使用して、死を達成するための3付随侮辱（熱、飢餓や無酸素）の必要性を正当化する、傷害の広い配列への耐性がある。無酸素症は、一人の時間¹⁴のこのウィンドウのワームを殺すことはありません。また、温度上昇は、追加の応力であるので、厳密に監視することが重要である。厳密に言えば、飢餓はそれ自体が ^、7を観測し、死亡率の程度に大きく寄与していないが、それは実験の反復間のばらつきを減少させるようである。日々からの有意な変動があり得ることを考慮すると、試料は並行して直接実行比較するために、複数の日にわたって実験を繰り返すことが非常に重要である。一般的に、アウトカムは50〜100ワーム/実験条件の3つの別々のプレートを測定し、これらはされているN平均化され、単一の実験的な複製とみなす。一般的には、7ないし9回の反復は、統計的有意性を達成し、または排除するのに十分であると思われる。

実験に用いたワームの発生段階にも損傷が大きく^15,16変化するにつれて、慎重に異なる段階の感受性として監視する必要がある。若年成人の使用は、標準的であり、幼虫期​​（L3及びL4）ワームは、AS（未発表データ）の有害な影響に対してより耐性であるように思われる。

このプロトコルは、実験を行うには二つの方法は、市販の低酸素室^4,6を使用して、その他の（タッパーウェア型容器やガス入力^11を使用）、ラボ製の装置を用いて1を提示します。他の箇所^13,17記載のように無酸素は、酸素を消費する他の手段によって達成することができる。低酸素環境を作成するための代替技術の使用は、必要なASのインキュベーション時間を変更することができる死の所望の量を作成します。 80パーセントがASの有害な影響を悪化させる介入についても同様に理想的な状態で約20％の生存率を目標とすることは、保護介入を研究するための理想的な出発点です。もう一つの重要な注意点は、観測者のスコアのデッド/生きているワームの時間です。分析のための時間が24時間を超えて延長されている場合は死んでワームを識別することがますます困難になっているので、データは誤解を招くかもしれません。これは、時間の経過だけでなく、受精胚は、死体の内部で子孫の死後に発展し、彼らが出てくるとして混乱させることができるという事実のために、比較的透明になってきて、ワームの死骸である可能性があります。

ニューロンの形態学の分析は、タンパク質発現パターン^18、核の断片化⁴および適切な遺伝的にコードされたマーカーを発現するウォーム株を置換することにより、他のパラメータ¹⁹を見て変更することができる。一つは、最終的な注意点があることを視覚化したもの神経突起は、スライド上でワームを配置した後に30分未満を行う必要があります。動物は、AS-独立の損傷を示すことができる長い期間スライドに麻酔下で続けた。それらを追跡し、分析するために必要な時間に応じてスライドあたりの動物の量を調整します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
N2  CGC			株 野生型株. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)	CGC	TU2583	は、タッチニューロンの標識に使用される蛍光導入遺伝子を統合しています http://www.cbs.umn.edu/CGC/
CB1338 mec-3 (e1338)IV		CGC CB1338	canonical mec-3 mutant that is touch insensitive. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
微量遠心チューブ	Eppendorf	0030 120.086
Nikon Eclipse TE2000-U 顕微鏡	ニコンUSA	TE2000-U
低温インキュベーターシェル	ドンマニュファクチャリング株式会社	モデル2005
ラッシュピック			まつげピックは、木製のつまようじにまつげを取り付け、ガラスのパスツールピペットにつまようじを取り付けることで準備できます(図3)。
低酸素チャンバーコ	イ	8307030	パラジウム触媒とCO2コントローラーを装備した低酸素グローブボックス。

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