ポスト病変呼吸神経可塑性を研究するための子宮頸脊髄損傷のマウスモデル

サマリー

呼吸不全は、子宮頸部脊髄損傷後の死亡の主要な原因である。部分的な頚椎損傷によって誘発される呼吸不全の、再現性の定量化、および信頼性の前臨床動物モデルを持つことは、その後の呼吸器および非呼吸神経可塑性を理解するのに役立つと推定される補修戦略をテストすることができます。

要約

子宮頸部脊髄損傷は永久的な麻痺を誘導し、しばしば呼吸困難をもたらす。現在まで、効率的な治療薬は、高子宮頸部脊髄損傷（SCI）は、次の呼吸不全を改善/向上させるために開発されていない。ここでは、多様なポスト病変呼吸神経可塑性を研究するために、子宮頸部2（C2）メタメリックレベルの高い、SCIのマウス前臨床モデルを提案する。技術は、脳幹に位置して呼吸中枢からの横隔運動ニューロンの求心路遮断にダイヤフラムのhemiparalysisを誘発するC2レベルの外科部分の損傷、から構成されています。損傷の反対側はそのまま残り、動物の回復を可能にする。 （胸部と腰部のレベルで）運動機能に影響を与える他のSCIと異なり、呼吸機能は、動物のモチベーションを必要とせず、欠陥/回復の定量化が容易に（横隔膜と横隔膜神経記録を行うことができますS、全身換気）。この前臨床C2のSCIモデル（生理学、分子）の異なるレベルでの様々な呼吸器および非呼吸神経可塑性の事象を研究し、中に呼吸が向上する可能性があり、多様な推定の治療戦略をテストするために、強力で便利、そして信頼性の前臨床モデルであるSCI患者。

概要

脊髄損傷は、永久的な麻痺などの劇的な発生率とのヒト集団において観察された一般的な傷害である。しかし、損傷の重症度は、最初の外傷の程度と範囲に依存します。呼吸不全は、上部頸椎脊髄損傷^（SCI）1以下の死亡率の主な原因である。現在、唯一の治療的処置は、換気補助の下に患者を配置することです。少数の患者は、後の病変の遅延で発生する自然回復による換気支援^2をオフに離乳することができるので、新しい革新的な非侵襲的な治療薬を開発する必要性が緊急³である。 、推定治療戦略の適用を研究し、そのため呼吸不全に対する子宮頸SCIの効果を調査してもいい標準化された前臨床モデルを持つことは不可欠です。

この技術的な記事では、特定の前臨床マウスモデルOを記述C2レベルでの部分的な子宮頸SCIによって誘導されたF呼吸障害。このモデルは、現在^{、（：4月13日}のレビューのために）、世界中のいくつかの研究室で使用されます。しかし、外科的処置のわずかな差は、この特定の子宮頸部損傷のマウスモデルを生成する別の研究者の間で観察することができる。呼吸器の出力にC2 SCIの効果は、第ポーター¹⁴によって1895年に記載された。子宮頸片側切断サイレント横隔神経活動とその後のダイヤフラムの麻痺につながる、損傷の同側（脳幹にrVRGにあり、 図1（a））、その中央のドライブから横隔運動ニューロンの求心路遮断を誘導する。反対側はそのまま残り、動物が生き残ることができます。下脊髄分節（C4レベル¹⁵で例えば挫傷の傷害）に位置する異なるSCIとは異なり、両方の側で横隔運動ニューロン核の完全性が維持されます。 CERVの後iCalのC2の損傷、いくつかの自発的な活動は、分節レベルC3〜C6（クロス横隔経路、CPP、 図1B）で、脊髄正中線を越えて反対側のサイレントシナプス経路の活性化を（横隔膜と横隔膜）同側で観測することができます。定義上、あるCPPの活性化、同側の部分横隔膜神経の回復を誘導対側横隔神経切断術と組み合わせたC2片側切断は、時間から数週間の損傷後^16〜18を発生することがあります。呼吸の回復でこのCPP経路の本当の有益な効果は¹⁹制限されており、さらなる調査と治療は、自発的な回復³の大きさを改善するために開発されるべきである。

このプロトコルは、（前と横隔運動ニューロン、介在ニューロン、分子·蜂巣から呼吸生理学、様々なレベルでの呼吸ポスト病変可塑性を研究するための前臨床マウスモデルの強力なタイプが用意されていますR、例えば前肢）の運動だけでなく、C2は、部​​分的頸髄損傷後の呼吸器および運動回復を改善することを目的とした侵襲的·非侵襲的な治療戦略をテストするためのモデル。

プロトコル

このプロトコルは、優秀（パリシュッド、グラント契約番号246556の大学）と大学·ド·ベルサイユサンカンタン·アン·イヴリーヌのRBUCEアップ椅子の倫理委員会によって承認された。

滅菌手術器具の1。準備

1. 実験室の洗剤で手術器具を清掃してください。
2. 手術前に楽器をオートクレーブ。
3. 外科セッションでは、2の手術の間、180℃で10分間ホットビーズ滅菌器でのヒントを配置することでツールを殺菌。

医薬品の2。準備

1. 前麻酔薬カクテルや術後の薬のために2×1ミリリットル注射器を準備します。
2. カルプロフェン（5 mg / kg）を、ブプレノルフィン（50μgの/ kg）を、バイトリル（5 mg / kg）をし、デクスメデトミジン（0.5 mg / kg）をラットの体重に応じて、事前に麻酔薬を注射器を準備します。乳酸リンゲル液に1ミリリットルにボリュームを完了します。
3. 中準備別のシリンジプレ麻酔薬の逆転：アチパメゾール（500μgの/キロ）。

ラットの3。麻酔

1. 動物にステップ2.2で説明した前の麻酔薬の溶液を皮下投与する。その後、戻ってケージに動物を入れて、鎮静効果が表示されるまで待ちます。
2. 100％のO _2、5％イソフルランでいっぱいにクローズ室にラットを置き、呼吸リズムが（30秒程度）遅くなるまで待ちます。その後、チャンバーからラットを削除し、挿管のテーブルの上に置きます。

4。経口気管内挿管

1. テーブルに彼の前歯に付属のストラップを配置することにより、ヘッドを固定した後、彼の背中に動物に存在する。
2. 光ファイバの光で、胸部のスペースを照らす。その後、動物の口の中に喉頭鏡（または1をカスタムメイド、詳細は城之内ら ^20）を配置します。声帯を視覚化する。
3. SLIDEと（声帯の間）気管内に経口気管ガイドを配置。ガイドに経口気管内チューブ（16gのカテーテルサイズ）をスライドさせます。
4. ガイドを削除して、水分の存在のために経口気管内チューブの端部に配置され、喉頭鏡で確認し、気管内ではなく食道にチューブの適切な位置を確認した。
5. （683齧歯類人工呼吸器、ハーバード装置）げっ歯類の人工呼吸器にチューブを接続し、（100％のO _2）で2％イソフルランの濃度を調整します。
6. サージカルテープで経口気管内チューブを固定します。

5。脊椎手術

1. 外科医に90°の角度を指して鼻で、加熱された手術用プレート上腹臥位の位置に動物を配置します。手術全体で37.5℃付近体温を維持。
2. 肩甲骨の間にバリカンで毛を剃るとガーゼで髪を削除します。
3. それから7で、ベタジンで肌をきれいに0％アルコール。このステップ3回繰り返します。
4. つま先のピンチは、適切な麻酔深度を確保するために、手術の開始前に行われる。  すると、肩甲骨の間にはさみで横方向の皮膚切開の吻側尾側を実行します。
5. 出血を防ぐために、腱に従うことによってacromiotrapezius筋吻側尾側をカットします。その後、脊髄筋（脊椎骨の周囲）にアクセスするための菱形筋を解離する。
6. C3は椎骨にC1から脊髄の筋肉を撤回。 C2は椎骨は、著名な骨端を有するものである。
7. 無菌綿棒を使って、椎骨の背側部分の周りの筋肉を清掃してください。
8. 骨鉗子で慎重にC2の骨端を除去して起動します。背側脊髄が露出するまで、細心の注意を払って継続する。椎弓切除術は、背側半椎弓切除術であることを確認してください。脊髄を囲む硬膜、この領域の近傍の動脈に細心の注意を払う。
9. ＃55ピンセットで、ROSを解剖TRO-尾C2方向硬膜は、次の各吻側および尾側に横方向に続けています。
10. 脳脊髄液をスポンジ。
11. microscissorsと頸椎後根番号2の下の横方向のセクションを作る。病変の程度は（傷害の背側については、図2（a）参照 ）、脊髄の正中線に到達するのに十分近いことをマイクロメスで確認してください。そうでない場合には、別のカットが損傷を完了するために行うことができる。出血の場合には、滅菌した綿棒を使用しています。それ以外の場合は、動物が怪我から回復せず、呼吸不全を持って、反対側に行かないように注意してください。
12. 保護層としての筋肉を縫合し、皮膚を縫合バック。ベタジン飽和滅菌ガーゼで傷口をきれいにします。
13. イソフルラン気化器をオフにして、反転薬（アチパメゾール[500μgの/ kgで、IM]）を注入し、体温をチェックしてください。
14. 動物は、人工呼吸器に対して息をし始めると、人工呼吸器から気管チューブを切断した後、経口気管内チューブを取り外します。回復のために加熱されたケージに動物を配置します。

6。手術後のケア

手術後、動物を回復するために可能な限り最高の環境を確保するために継続的に監視される。抗生物質（バイトリル、5 mg / kg）を、抗炎症（カルプロフェン、5ミリグラム/ kg）およびブプレノルフィン（50μgの/ kg）の薬物が感染を防止し、発生を低減する最初の2日間、12時間ごとに、手術後に与えられている手術後の痛みの。ラットは、（第一術後一日またはゼリー状水）ソフト食料と水へのアクセスを自由に摂取しています。皮下流体は、最初のいくつかの術後の日に脱水を予防するために用いることができる。体重および食物摂取量を毎日モニターする。その環境は、実験と時間、損傷後（デュアル住宅、ケージ内チューブ）を通じて濃縮されている。

結果

傷害の程度

成功と、この特定の実験モデルの再現性は、各マニピュレータ/外科医の経験に依存している。 C2は損傷後の呼吸の回復（横隔神経活動と横隔膜活性）のその後の量は、残りの腹と相関している白質^21を免れる。怪我が「手作り」で、外科医からのいくつかの練習を必要とするので、それぞれのけがの程度は正確なサイズを決定するために、組織学的技術（ホルムアルデヒドで組織の固定4％、凍結組織スライス、クレシルバイオレット染色）によって確認されなければならないの損傷を受けた組織（ 図2B）。

電気生理学的記録

C2はSCI後、同側の横隔神経活動が廃止された（ 図3A、Vinitのら ^17を参照してください。方法論）。反対横隔神経活性は、損傷により影響を受けた動物の生存率（

ディスカッション

C2は傷害モデルを作る技術的な問題

C2の損傷のマウスモデルでは、呼吸器、ポスト病変神経可塑性を研究するための興味深いツールです。しかし、再現性と信頼性の高いモデルを作成するために必要な手順が多数あり、それぞれが研究の結果に影響を与える可能性がある。たとえば、挿管過程で細心の注意を経口気管内チューブが怪我自体に起因する初期の呼吸不全に加えて、このような閉塞性呼吸器障害などの多様な合併症を引き起こすことができ、気管の炎症を生成することができますので、取られる。また、手術の手順中の脊髄へのアクセスは、動物の回復のために重要である可能性があります。すべてのステップ（筋肉の解剖/後退、背側椎弓切除術、硬膜切除、傷害自体が）は、手術部位の周囲や脊髄への多様な動脈が存在するために細心の注意を払って実行しなければならないコー​​ド。大規模な出血は手術後の回復が失血によって妨害することができ、脊髄虚血傷害に加え、発生する可能性があるため、避けなければならない。

注意すべきもう一つの重要な部分は、楽器の清潔...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Animal
Male Sprague Dawley Rat	Janvier		225-250 g
Surgical Instruments
Student Dumont #5 鉗子	ファインサイエンスツール	91150-20
Student Standard Pattern Forceps	ファインサイエンスツール	91100-12
Mayo-Stilleはさみ	ファインサイエンスツール	14013-15	湾曲
学生ヴァンナススプリングはさみ	ファインサイエンスツール	91500-09	ストレート
スプリングはさみ-8mmブレード	ファインサイエンスツール	15025-10	ストレートブラント/ブラント
ドマンピアソンロンガー	ファインサイエンスツール	16121-14	湾曲
剖ナイフ-ファインチップ	ファインサイエンスツール	10055-12	ストレート
オルセン ヘガー ニードル ホルダー	ファイン サイエンス ツール	12002-14	鋸歯状
Weitlaner-Locktite リトラクター	ファイン サイエンス ツール	17012-11	2x3 鈍色
性外科用縫合糸	Centravet	BYO001	縫合糸サイズ 4-0
Equipment
Hot Bead Steriliser	ファイン サイエンスツール	18000-45
カテーテル	Centravet	CAT188	16 G
喉頭鏡
ガイドワイヤー
喉頭ミラー	Centravet	MIR011
乳酸リンガー	Centravet	RIN020
シリンジ	Centravet
針	Centravet
O2	Air 液体	I1001M20R2A001
683 げっ歯類 換気装置 115/230V	ハーバード装置	55-0000
スタンドアロン気化器	WPI	EZ-155
細い線加熱ベッド	WPI	EZ-211
エアキャニスター	WPI	EZ-258
Drugs
カルプロフェン	セントラベット
マジル	セントラベット	RIM011
プレノルフィン	セントラベット	BUP001
リル	セントラベット	BAY001
クスメデトミジン	セントラベット	DEX010
チパメゾール	セントラベット	ANT201
ベタジン溶液	Centravet	VET002
イソフルラン	Centravet	VET066

したフリー解吸収リブバイトデア