方法論記事

多剤耐性を実証結核菌増幅マイクロアレイ

DOI：

10.3791/51256

⸱

2014年4月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Akonni Biosystems, Inc.

この記事について

サマリー

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増幅マイクロアレイは大幅にエンドユーザーのために、マイクロアレイのワークフローを合理化し、単一の室内に非対称PCR増幅およびマイクロアレイハイブリダイゼーションを兼ね備えています。マイクロアレイワークフローを簡略化する日常的低リソース環境において使用することができるマイクロアレイに基づく診断を作成するために必要な最初のステップである。

要約

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マイクロアレイワークフローを簡略化する日常的低リソース環境において使用することができるMDR-TBマイクロアレイベースの診断を作成するために必要な最初のステップである。増幅マイクロアレイは単一の溶液中で、単一のマイクロ流体チャンバ内に非対称PCR増幅、目標サイズの選択、標的標識、およびマイクロアレイハイブリダイゼーションを組み合わせる。バッチ処理法は、9 -プレックス非対称マスターミックス及び多剤耐性結核菌 （MDR-TB）を遺伝子型決定するための低濃度のゲル素子マイクロアレイを用いて実証されている。ここで説明するプロトコルは、6時間で完了し、ゲノムDNAの少なくとも1,000細胞同等で正しい遺伝子型決定を提供することができる。オンチップの洗浄工程を組み込むことは完全に閉じアンプリコンの方法およびシステムになるであろう、実現可能である。増幅マイクロアレイでの多重化の程度は、最終的に単一のマスタmに組み合わせることができるプライマー対の数によって制約される九依然としてむしろアレイ上に固定化されるプローブの数よりも所望の感度および特異性のパフォーマンス·メトリックを達成する。同様に、総分析時間は、特定の使用目的に、研究課題、および検出の所望の限度に応じて短縮または延長することができる。それにもかかわらず、一般的なアプローチは、有意に手動集約的で時間のかかる処理工程の数を減らすことによって、エンドユーザーのためのマイクロアレイのワークフローを効率化し、日常的な臨床実践にマイクロアレイに基づく診断を翻訳するための簡略化された生化学的およびマイクロ流体経路を提供する。

概要

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早期患者発見と迅速な治療が結核菌を減らす最も効果的な制御戦略（MTB）変速機1と見なされ、ポイントオブケア（POC）またはPOCテストの近くには、同時に結核を診断することを結核コミュニティの幅広い合意が今そこにあるアール薬剤耐性（DR）が必要である。例えばCepheid社のGeneXpertおよび他の核酸増幅試験などの技術は、多くのTB患者のための診断までの時間を短縮し、リファンピンまたは他の第一または第二選択薬2に対する耐性を付与する選択された変異に耐性を示す急速な読み出しを提供する。リアルタイムおよび等温核酸増幅試験は、MDR-TBをもたらす薬剤耐性突然変異を同定するために設計されているが、それらは検出突然変異のスペクトルは、患者の薬剤耐性プロファイルに対応する個別化された薬物療法を設計することがしばしば不十分であるおよび関連する技術的な制約光クロストークまたは増幅および報告化学の複雑さのために3-7座位または検出された変異の数を制限することがあります。したがって、より高い多重化容量を有する検出技術は、MDR-TBのPOC診断において公知のギャップに対処するために必要とされる。

マイクロアレイとWHOが承認しハインラインプローブアッセイは、MDR-TBの8月29日を診断する「複数の遺伝子、複数の変異「課題に対処することができます。残念ながら、これらのハイブリダイゼーションに基づく、多重化された検出プラットフォームは、多段階で複雑、かつ分子技術の大幅な訓練と技能を必要とするオープンアンプリコンプロトコルを使用しています。増幅マイクロアレイ30は 、これらのマイクロアレイワークフローと運用の問題の一部に対処するために設計されました。簡略化流体原理は、増幅ハイブリダイズし、単一のマイクロ流体チャンバ内での核酸標的を検出することである。ユーザーは、核酸増幅MASを紹介TERはピペットで流体室に混ぜて熱サイクルプロトコルを開始します。ここに示されているバッチ処理法では、マイクロアレイは、その後、バルク溶液中で洗浄し、乾燥させ、結像される。この研究は、 のrpoBのためのMDR-TBのマイクロアレイ試験（30の変異）、 のkatG（2の変異）、 仁荷 （4の変異）、 のrpsL（2の変異）、embB（1変異）、IS1245、IS6110を用いた増幅マイクロアレイの機能性を実証、および内部増幅およびハイブリダイゼーションコントロール。マイクロアレイプローブ（野生型（WT）及び一塩基変異体（MU））の少なくとも一つのマッチしたペアは、関心のある各変異のために含まれている。多剤耐性Mから精製された核酸結核は 、TDR結核菌株バンク31からのものである。他の箇所32記載のようにゲル素子マイクロアレイは、我々がpolymeriz各プローブ4％のモノマーおよび0.05mMを使用することを除いて、実質的に共重合させることによりガラス基板上に製造されるATION混合物。アレイは、使用前の50mlガスケットで囲まれている。熱サイクル、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程の後、増幅マイクロアレイはAkonni携帯型分析に結像される。バックグラウンド補正、統合された信号強度は、生から得られる。tifの画像を、固定円アルゴリズムを使用して。各ゲル素子のノイズは、ローカルスポットのバックグラウンドの標準偏差の3倍として計算される。対雑音比（SNR）、信号用の≥3が値遺伝子標的は、典型的には、検出と見なされる。各遺伝子または特定のコドンにおける変異の有無を決定するために、判別比は、（WT-MU）/（WT + MU）とし​​てSNR値から計算される。 0野生型配列の指標である判別比<比は、一方0は、遺伝子座における薬剤耐性変異の指標である>は。

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プロトコル

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ユニバーサルPCR法上の注意事項に従ってくださいラボラトリーズためには、基板ごとに複数の増幅マイクロアレイとガスケットを含み、ここで説明したように、バルクコンテナで同時にすべての増幅マイクロアレイを洗浄するために、運用が効率的です。他の場所で30,33報告されているように消耗品のフォーマットは、完全に密閉され、閉じられたアンプリコンテストで増幅後のマイクロアレイの洗浄工程を実行するために用意されています。

1。セットアップ

  1. 抽出と選択の方法で適当な生物学的安全性条件下で試料から核酸を精製する。要件は、核酸は、非対称多重PCR増幅のために十分な純度であることである。
  2. 汚染除去のソリューションと表面と機器を拭いて、ワークスペースを準備します。
  3. 氷や冷たいブロックに増幅試薬を配置します。
  4. 増幅マスターミックスのための無菌1.5mlマイクロチューブにラベルを付けて、滅菌した0.2ミリリットルマイクロ遠心TUにラベルを付ける各サンプルについても。
  5. 試薬は、簡単に渦を解凍し、ミニ遠心機でのパルススピンでチューブの底に内容を収集した後。 Taqポリメラーゼをボルテックスしないでください。穏やかに混合し、ミニ遠心機でのパルススピンに従うようにチューブをフリック。
  6. 可能なピペットの不正確さを考慮するために、表1に示すサンプルごとの反応容量を用いた増幅マスターミックスを調製し、処理中のサンプルの総数よりも少なくとももう1つの反応容積を調製する。何度muliplex PCRバッファーを備えているものの上に、マスターミックスは、追加のTaqポリメラーゼが含まれていることに注意してください。他のすべての試薬が組み合わされた後にマスターミックスを増幅/禁止制御を追加し、ストック·試薬チューブは、ストレージに戻った。
試薬 サンプルごとの容量（μL） <強い>ファイナル[]
ホットスターのTaq PlusをMulitplex PCRバッファー 25 1X
ウシ血清アルブミン（BSA） 0.55 0.6 mg / mlの
ホルムアミド 3.8 7.6％
追加のTaqポリメラーゼ 0.8 ユニット/μl（4台の合計）
MDR-TBのプライマーミックス 15.75 -
RNaseフリーのH 2 O 2.1 -
増幅/禁止の制御 1 5.0 FG /μL
合計 49

表1。MDR-TBの増幅マイクロアレイマスターミックス組成物。

  1. 渦マスターミックス、ミニ遠心機でのパルススピンでチューブの底に内容を収集します。
  2. マスターミックス49μLとMの1μLを組み合わせる上記工程1.4からの試料管の各々に結核 DNA。外部、鋳型なし対照（NTC）は、M.の代わりに、分子生物学グレードの水の1μlを使用する結核 DNAサンプル。渦とパルススピン仕上げチューブ（S）。

2。増幅マイクロアレイをロード

  1. マイクロアレイ自体には手を触れないように注意して、それぞれのマイクロアレイの中心に、各マスターミックス/サンプルの48を添加する。
  2. マイクロアレイチャンバー内の気泡ではないトラップに気をつけながら、マイクロアレイガスケットおよびシールの上にカバースリップを配置。気泡が負に増幅効率に影響を与える可能性そして、その後のマイクロアレイ画像にアーチファクトやノイズを作成することがあります。

3。熱サイクル

  1. いったんすべてのマイクロアレイは、フラットブロックサーマルサイクラー上のサンプル、場所基板が装填されています。加熱蓋オプションが「オフ」になっていることを確認してください。 Akonniバイオシステムズから入手した機器は、既に使用のために事前資格になります。それ以外の場合は、フラットブロックサーマルサイクラー（s）が（複数の）均一な、全てのマイクロアレイ基板で一貫した加熱を提供することを検証することは非常に重要である。
  2. サーマルサイクラーソフトウェアを開き、適切なプログラムを選択して、反応体積は、「50μL」と入力し、実行を開始します。ここで説明する熱サイクルプロトコルは、で構成されています。
    熱サイクル手順
    1 88℃ 5分
    2 88℃ 30秒
    3 55℃ 1分
    4 65℃ 30秒
    5 50サイクルの工程（2-4）を繰り返す
    6 65℃ 3分
    7 55℃ 3時間
  3. 必要に応じて、または特定の実験に応じて全熱サイクル数と55°Cの増幅後の保持時間は、ユーザが変更することができることを独立した変数である。 MDR-TBのマスターミックスは、非対称（主に一本鎖）アンプリコンを作成するので、それは他の点では従来、指数関数的なPCR増幅プロトコルのために利用されているより多くの熱サイクルを含めるようにして、通常は便利です。
  4. 熱サイクルとハイブリダイゼーションのプログラムが完了したら、プログラムを終了増幅マイクロアレイを削除、ソフトウェアを終了し、サーマルサイクラー（複数可）をオフにしてください。

4。洗浄及び乾燥

  1. 同時に24基材への洗浄のために、1×SSPE少なくとも250ミリリットル調製 - 0.1％トリトンX-100洗浄緩衝液、および脱イオン水またはそれぞれのMilli-Qグレード水は少なくとも250 mlの二つの容器を。洗浄緩衝液を予め調製することができる。
  2. 慎重にフラットエンドピンセットを用いて、各増幅マイクロアレイ室からカバーガラスとガスケットを取り外します。 この手順では、物理的に損傷ゲル素子アレイの最大の危険性がある点である。増幅された核酸の拡散を防止するための適切なPCR汚染コントロールを使用して、作業環境の中。
  3. 組織学のスライドホルダーにマイクロアレイ基板を配置し、洗浄バッファーを含む洗浄ビンにすべてのスライドを配置。蓋付きの容器をカバーしています。
  4. 穏やかに攪拌しながら室温で10分間、マイクロアレイを洗浄する。
  5. 脱イオンの2連続洗浄にマイクロアレイを3回ずつ浸したりミリQグレードの水、そして空気乾燥。

5。イメージング

非対称のMDR-TBのプライマーミックスは、Cy3標識アンプリコンを生成します。ゲル素子マイクロアレイのCy3を撮像することが可能な任意の標準的マイクロアレイイメージャーで画像化することができる。次の撮像手順はAkonniが提供する多剤耐性結核マスターミックス、Dx2100フィールドポータブルイメージャ、および自動化された解析ソフトウェアに特異的である。

  1. イメージャからのイーサネットケーブルがコンピュータに接続されていることを確認します。
  2. イメージャの電源をオンにします。電源スイッチが機器の背面パネルに配置されている。イメージャの電源を入れたときのイメージャの前面にある青いLEDが点灯します。
  3. コンピュータの電源を入れます。
  4. コンピュータのデスクトップ上で、自動化された画像解析ソフトウェアを起動するためのソフトウェアのアイコンをダブルクリックします。
  5. イメージャカメラとの接続を確立するためのソフトウェアのを待ちます。接続が確立されると、分析ボタンが使用可能になり、メッセージ「接続成功」とは、画面の左下隅に表示されます。
  6. マイクロアレイは、ユーザから、対物レンズに向かって反対側で乾燥させた増幅マイクロアレイを挿入します。マイクロアレイが不適切レンズとカメラに対して配向されている場合は、自動化された分析ソフトウェアは、蛍光画像上にグリッドを配置するために失敗する。
  7. アクセスドアを閉じます。プレビュー画像は、コンピュータの画面上で利用できるようになります。
  8. ドロップダウンメニューから多剤耐性結核解析スクリプトを選択し、（ミリ秒単位）所望の露光時間を入力します。ゲル素子増幅マイクロアレイのための典型的な出発点は、100〜500ミリ秒である。
  9. 飽和画素は赤でプレビュー画像に表示されます。個々のスポット内の飽和画素の数を最小化するために露光時間を調整する。
  10. 蛍光画像を取得して分析する分析をクリックしてください。ソフトウェアが自動的に配置されますMDR-TBアッセイ特異グリッド画像上に、積分強度及びバックグラウンド値を抽出し、薬剤耐性及び遺伝子型決定の結果を報告する。自動化された分析では、典型的には数秒かかります。傷、埃、蛍光アーティファクト、またはマイクロアレイ機能への物理的な損傷が含まれている挑戦的なイメージの場合、ソフトウェアは分析を完了するために1分までが必要な場合があります。
  11. 分析が完了したら、[保存]をクリックインストール先のフォルダを選択し、ファイル名を入力し、[OK]をクリックします。基礎となるマイクロアレイデータは。xlsファイルとして保存され、オフライン分析のために、必要に応じて、エクスポートすることができます。
  12. 分析が完了すると、イメージャからの増幅マイクロアレイを削除し、次の分析を開始するために新規をクリックしてください。
  13. データの収集が完了したら、コンピュータをシャットダウンし、ソフトウェアを終了し、イメージャの電源を切ります。

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結果

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定性的画像分析は、自動画像解析ソフトウェアにより生成されたデータテーブルに識別するために挑戦している実験的なノイズやばらつきの原因への洞察を提供することができる。このように、それは1）すべてのゲルの要素が無傷で損傷がない、2）グローバルなバックグラウンドノイズ比（SNR）の値に個々の信号に影響を与える可能性のある蛍光成果物がないことを確認するため、視覚的に有用である可能性があり、3）のための証拠はない気泡形成や不均一な増幅/ハイブリダイゼーションアレイ全体、および4）ソフトウェアが正確にマイクロアレイ画像上の全てのスポットを同定していること。実施例MDR-TB増幅マイクロアレイ画像は、高品質のアレイと、熱サイクリング中の物理的損傷や気泡を生じ得るアーチファクトを示す、 図1に示されている。標準的なマイクロアレイ画像解析ソフトウェアは、通常、グリッドを配置してもshなどの低品質画像から積分強度とバックグラウンドデータを抽出することができる図1Bに独自なので、さらなる分析からマイクロアレイの画像を受け入れるか、拒否 ​​するための品質管理基準や測定基準を確立するために、研究...

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ディスカッション

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増幅マイクロアレイとの多重化の程度は、最終的には、マルチプレックス非対称PCRの効率ではなく、マイクロアレイによって決定される。我々の経験では、一意の10〜12のプライマー対を容易に増幅マイクロアレイフォーマットで多重化することができる。従来のプライマーおよびプローブの設計基準のでその一つはこれもPCR緩衝液中の溶液相核酸および固定化されたマイクロアレイプローブ、サーマルサイクラーの熱効率、及びプローブハイブリダイゼーション挙動との間の潜在的相互作用を考慮する必要がある以外は、新しいアッセイに適用PCRプライマーおよび低分子量の増幅アーチファクトが含まれている。このような全ゲノム増幅などの高多重増幅アプローチはランダムヘキサと固定されたプローブ間の干渉、および長い二本鎖アンプリコンの非効率的なハイブリダイゼーションなど、技術的な理由の数のための単室の増幅マイクロアレイプロトコルに資するものではない。そこまた、個々のユーザーがカスタムアッセイを設計したり、ここで説明したMDR-TBのテストを使用するときに考慮する必要があることを検出した使いやすさ、総分析時間、および限界の間の相互関係である。例えば、増幅サイクルの数を減らし、さらに増幅後ハ...

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開示事項

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著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、付与RC3の​​AI089106の下で国立衛生研究所（NIH）によってサポートされていました。

多剤耐性結核核酸は、熱帯病研究訓練のための国連児童基金/国連開発計画/世界銀行/世界保健機関特別プログラム（TDR）、ジュネーブ、スイスから提供された。

我々は、プロトタイプアッセイに含める特定の遺伝子突然変異についてのガイダンスのために米国疾病対策予防センターの博士トムShinnickに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
MDR-TB増幅マイクロアレイ、ガスケット適用済み、カット済みカバースリップ付きAkonni BiosystemsInquire
Multiplex PCRキット、HotStar TaqとQiagen#206143
TaqポリメラーゼQiagen#201207
RNAseフリー水Qiagen#206143 
ホルムアミドサーモフィッシャーサイエンティフィック(株)#BP227-500
20 mg mL-1非アセチル化ウシ血清アルブミン(BSA)Sigma-Aldrich#3B6917
5X 濃縮 MDR-TB プライマーミックスAkonni BiosystemsInquire
500 fg uL-1 増幅および阻害制御Akonni BiosystemsInquire
20X SSPEサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社#BP1328-4
トリトン X-100サーモフィッシャーサイエンティフィック#BP151-500
除菌スプレー カレントテクノロジーズ株式会社
#BRSPRAY128 70%イソプロピルアルコールデコンラボ株式会社#8416
マイクロアレイイメージャー、自動画像およびデータ分析ソフトウェア付きAkonni Biosystems100-20011
フラットブロックインサート付きサーマルサイクラーAkonni Biosystems100-10021
ハイスループット洗浄ステーションとスライドホルダーArrayItHTW
解剖鉗子サーモフィッシャーサイエンティフィック社#10-300
ミニボルテクサーVWR#3365040
ミニ遠心分離機VWR#93000-196
エアブラシコンプレッサーキット中央空気圧#95630
を含むマルチプレックスPCRキット

参考文献

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