神経組織再生のための可溶性および不溶性ビオチン化タンパク質の発現、分離、および精製

Summary

biotinylatable融合タンパク質を開発することは、研究の様々な分野で多くの潜在的な用途がある。組換えタンパク質工学は、カスタム設計されたタンパク質を高収率で提供する、費用対効果のある単純な手順である。

Abstract

組換えタンパク質工学は、 大腸菌（E.coli）発現ほぼ40年のためのシステム、今日Eを利用している大腸菌はまだ最も広く使用されている宿主生物である。システムの柔軟性は、（ストレプトアビジン相互作用のための）ビオチンタグなどの部分と緑色蛍光タンパク質またはチェリーレッドのタンパク質のような大きな機能性タンパク質を付加することができます。また、翻訳後修飾を付与する金属イオンキレート剤、一意的に反応性官能基、分光学的プローブ、および分子などの非天然アミノ酸の組込みは、タンパク質の特性及び機能のより良好な操作を可能にした。その結果、この技術は研究の様々な分野のための重要なユーティリティを提供し、カスタマイズ可能な融合タンパク質を作成します。具体的には、biotinylatableタンパク質配列が原因アビジンおよびストレプトアビジンとビオチンとの間の高親和性相互作用の多くの標的タンパク質に組み込まれている。この追加により、タグ付けされたタンパク質の検出および精製を強化するだけでなく、このような細胞選別などの二次アプリケーションのための道を開くことに支援しています。このように、ビオチン標識分子がbioindustrialおよび生物医学分野で増加し、広範な影響力を示している。本研究の目的のために、我々は、神経成長因子（NGF）およびsemaphorin3A（Sema3Aの）機​​能的領域を含む組換えビオチン化融合タンパク質を設計している。我々は、これらのビオチン化融合タンパク質は、他の活性なタンパク質配列と共に、組織工学および再生の目的のための生体材料に繋留することができる方法を以前に報告した。このプロトコルは、T7 LAC誘導ベクターおよびEを利用し、ミリグラム規模でエンジニアリングbiotinylatableタンパク質の基礎を概説形質転換からのスケールアップおよび精製を開始大腸菌発現宿主、。

Introduction

タンパク質は、最終的に適切な組織形成、組織を導く、多くの生物学的機能に関与している生体分子の広い範囲をカバーする。これらの分子は、人体内の均衡を維持し、規制アップ及び/またはダウンレギュレーション遺伝子および他のタンパク質を制御するシグナル伝達経路の数千を開始する。単一のタンパク質の破壊は、壊滅的な障害または疾患の発症につながることができた信号のこのウェブ全体に影響します。ラボで個々のタンパク質を設計することは、これらの悪影響に対処するための一つの解決策を提供しており、低分子薬物に代わるものを提供しています。 1977年には、14個のアミノ酸ソマトスタチン配列をコードする遺伝子は、E.を使用して作成された第一の操作されたポリペプチドの一つであった大腸菌 ^1。まもなく1979年の後、インスリンは、形質転換、プラスミドpBR322にクローニングし、発現させ、精製した^2。それ以来、組換えタンパク質は、解像度の複数のフィールドに自分の影響力を拡大しているearch などの生体材料、ドラッグデリバリー、組織工学、バイオ医薬品、農業、産業用酵素、バイオ燃料として（レビューは参考文献^3-8を参照してください）。これは、技術には、目的のために、化学的部分またはタンパク質配列の特定のアプリケーションの添加を介して提供し、これらに限定されないが、タンパク質同定、安定化および精製を標的とすることが汎用性によるところが大きい。

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Protocol

1。標的タンパク質の設計

1. バイオテクノロジー情報のウェブサイトのためのナショナルセンターを使用して（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）考慮対象種と任意のスプライスバリアントを取る目的のタンパク質のアミノ酸配列を得る。タンパク質の関心の活性領域に対応するアミノ酸配列を選択します。
   注：Sema3Aのために、アミノ酸21から747を選択した。融合タンパク質は、バルスター、アミノ酸1-90の配列は、NGFのアミノ酸122から241に添加したNGFを用いて設計した。
2. 、Hisタグ（ENLYFQG）の除去のために、K（GLNDIFEAQKIEWHE）でのタンパク質のビオチン化のためのビオチンタグ付けされたシーケンスを6X-Hisの精製のためのタグ（HHHHHH）、タバコエッチウイルス（TEV）プロテアーゼ切断部位：N末端にフォロー·シーケンスを追加そして適切なタンパク質リフォールディング（EFPKPSTPPGSSGGAP）のための部屋を許可するギャップの可撓性のヒンジ。
   注：これらの配列は、所望の融合PROTによって異なる場合がありますEIN。
3. 所望の宿主種及び合成のための遺伝子の設計/最適化のために企業への完全なアミノ酸配列を送信する。キットや商業サービスを利用してを使用してのBamHI-NotI部位を使用して、選択したベクターにサブクローニング。

Results

クローニングとテスト式

めっきが適切に行われると、単一の単離されたコロニーをクローン形質転換された細菌細胞（ 図2A）プラッキングの可能性を高めるために形成すべきである。あまりにも多くの細胞を播種する場合は、プレートを37℃以下で変態が長すぎるインキュベートし、コロニーを寒天プレートを被覆または細胞の大きな凝集体（ 図2Bおよび2C）を形成してもよく、疑問である。テスト式中、NGFとのSema3Aは、第37℃で4時間誘導し、SDS-PAGE分析は、両方のタンパク質が可溶性画分（ 図2D）に位置していたと判定した。タンパク質の発現は、公正、したがって、18℃で一晩誘導と他のテスト式を検討したように見えた。のSema3A（ 図2E）との顕著な違いはなかったのに対し、NGFは、可溶性画分でより良い発現をもたらした。

"> 単離、精製およびビオチン化

Discussion

組換えタンパク質工学は多くの分野にまたがる非常に強力な技術である。これは、カスタム設計のタンパク質の高収量の産生を可能にする、費用対効果の高い、調整可能な比較的簡単な手順である。これは、設計および標的タンパク質を発現することは必ずしも容易ではないことに留意することが重要である。基底発現および組換えタンパク質の安定性を、ベクターの特定の選択に依存E.大腸菌細胞株、ペプチドタグの追加や栽培パラメータ。私たちの具体的な設計基準は、十分に確立さEを利用して大腸菌はタンパク質工学のための株。さらに、プラスミドベクターは、安定な組換えタンパク質発現のためのT7のlacプロモーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む。

高度に精製されたプラスミドサブクローンを取得した後、最初の主要な手順が正常に宿主細胞に標的タンパク質を形質との溶解度を決定することであるタンパク質。テスト式は、標的タンパク質の合成を最適化するのに最適な時期です。これは、プラスミドを含む細菌細胞のより良好な.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-ジチオ-DL-スレイトール、DTT、99.5%	Chem-Impex International	127	100 g
2-ヒドロキシエチルメルカプタン &β;-メルカプトエタノール	Chem-Impex International	642	250 ml
酢酸、氷河	EMD	AX0073-9	2.5 L
寒天	バイオショップ	AGR001.500	500 g
アンピシリンナトリウム塩	Sigma-Aldrich	A9518	25 g
消泡剤 204	Sigma-Aldrich	A6426	500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 & マイクロ;g
BL21(DE3) コンピテントセル	Novagen	69450	1 ml;発現宿主
Bradford 試薬	Sigma-Aldrich	B6916	500 ml
BugBuster	Novagen	70922-3	100 ml
ゲルろ過標準	Bio-Rad	151-1901	6 バイアル
グリセロール	Bioshop	GLY001.1	1 L
グアニジン水閃化物 アミオホルマミジン塩酸塩	Chem-Impex International	152	1 kg
His-Pur Ni-NTA 樹脂	Thermo Scientific	88222	100 ml
塩酸	EMD	HX0603-3	2.5 L
イミダゾール	Chem-Impex International	418	250 g
IPTG	Chem-Impex International	194	100 g
Laemmli サンプルバッファー	Bio-Rad	161-0737	30 ml
ラウリル硫酸ナトリウム塩、ドデシルナトリウム表面	Chem-Impex International	270	500 g
LB Broth	Sigma-Aldrich	L3022	1 kg
NovaBlue Competent Cells	Novagen	69825	1 ml;クローニングホスト
リン酸緩衝生理食塩水	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK	10 パック
塩化カリウム	Chem-Impex International	01247	1 kg
Sema3A-pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 & マイクロ;g
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	1 L
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S5886-1KG	1 kg
水酸化ナトリウム	Fisher Scientific	S318-500	500 g
リン酸ナトリウム ダイヤベーシック	Sigma-Aldrich	S5136-500G	500 g
リン酸ナトリウム 1塩基性	Sigma-Aldrich	S5011	500 g
Terrific Broth Bioshop		TER409.5	5 kg
テトラサイクリン塩酸塩	Chem-Impex International	667	25 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x	Bio-Rad	1610732	1 L
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503	1 kg
Tryptone, pancreatic	EMD	1.07213.1000	1 kg
酵母抽出物,粒状	EMD	1.03753.0500	500 g
ÄKTApurifier10	GE Healthcare	28-4062-64	キットとアクセサリーを含む
ベンチトップオービタルシェーカー	Thermo Scientific	SHKE4000	MAXQ 4000
BirA500	Avidity	BirA500	酵素には反応バッファーとビオチン溶液が付属
透析カセット	Thermo Scientific	66380	Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
透析チューブ	Spectrum Laboratories	132127, 132129	MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923	GE Healthcare	11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit	Invitrogen	1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack C	GE Healthcare	18-6083-13
フラクションコレクター Frac-950	GE Healthcare	18-6083-00	キットとアクセサリーが含まれています
加熱/冷蔵サーキュレーター	VWR	13271-102	モデル 1156D
加熱オーブン FD シリーズ	バインダー		モデル FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg	GE Healthcare	17-1069-01	販売終了 - 交換品: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Centrifuge	Beckman Coulter	393126
JA 25.50 Rotor	Beckman Coulter	363055
JLA 8.1 ローター	ベックマン・コールター	969329	1 L ポリポルピレンボトルを含む
JS 5.3 ローター	ベックマン・コールター	368690
層流フード	Themo Scientific	1849	Forma 1800 シリーズ クリーンベンチ
マイクロプレートリーダー	TECAN		infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8004	4-gel vertical電気泳動システム
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels	Bio-Rad	456-9036	Any kDa, 15-well
comb Ni-NTA Column	Bio-Rad	737-2512	49 ml ボリューム ECONO-Column
Plasmid Miniprep Kit	Omega Bio-Tek	D6943-01
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	164-5052	250 V, 3 A, 300 W
丸底ポリプロピレン共重合体チューブ	VWR	3119-0050	50 ml JA 25.50
ローターSpin-X UF濃縮器	コーニング	431488、431483	20および6 ml;MWCO:10,000 Da
サブクローニングサービス	GenScript USA Inc.		Protein Services
超音波プロセッサ	コールパー	マー18910445A	モデルCV18
ボルテックス-魔神2	サイエンティフィックインダストリー	ズSI-0236	モデルG560