ペプチド第三級アミドライブラリのスプリット·アンド·プールの合成とキャラクタリゼーション

Summary

ペプチドの第三級アミド（PTAは）が含まれるが、ペプチド、ペプトイドおよびN-メチル化ペプチドに限定されないが、ペプチドミメティックのスーパーファミリーである。ここでのPTAの1ビーズ1化合物ライブラリーを合成するためにスプリット·アンド·プールとサブモノマー戦略の両方を組み合わせた合成法を記載している。

Abstract

ペプチド模倣物は、タンパク質リガンドの大源である。これらの化合物のオリゴマー性質は、コンビナトリアルケミストリーを使用して固相に大きな合成ライブラリにアクセスすることを可能にします。ペプチド模倣の中で最もよく研​​究されたクラスの一つは、ペプトイドです。ペプトイドは、合成が容易であり、タンパク質分解耐性及び細胞透過性であることが示されている。過去10年間、多くの有用なタンパク質リガンドは、ペプトイドライブラリーのスクリーニングによって同定されている。しかし、ペプトイドライブラリーから同定されたリガンドのほとんどは稀な例外を除いて、高い親和性を表示しません。これは、ペプトイド分子中のキラル中心およびコンホメーションの制約の欠如に一部起因し得る。最近では、ペプチドの第三級アミド（PTAは）にアクセスするための新しい合成経路を説明した。 PTAはとしては、ペプチド、ペプトイドおよびN-メチル化ペプチドに限定されないが、ペプチド模倣体のスーパーファミリーである。 α-炭素主鎖窒素原子の両方の側鎖を有する、これらの分子の立体構造が大幅に立体障害及びアリル1,3歪みによって制約されます。 （ 図1）我々の研究は、これらのPTA分子が溶液中で高度に構造化されており、タンパク質リガンドを同定するために使用され得ることを示唆している。我々は、これらの分子は、高親和性タンパク質リガンドの将来の源となり得ると考えています。ここでは、サンプルのPTAの1ビーズ1化合物（OBOC）ライブラリを合成するスプリット·アンド·プールやサブモノマー戦略の両方のパワーを組み合わせた合成方法が記載されている。

Introduction

ペプチド模倣体は、天然ペプチドの構造を模倣する化合物である。それらは、タンパク質分解^1-3に対する細胞透過性および安定性を含む天然ペプチドに関連する問題のいくつかを克服しながら生物活性を保持するように設計されている。により、これらの化合物のオリゴマー性質のために、大規模な合成ライブラリーは、容易に単量体またはサブ単量体の合成経路^4-7を介してアクセスすることができます。ペプチド模倣の最も研究されたクラスの一つは、ペプトイドです。ペプトイドは、サブモノマー戦略^8,9を用いて容易に合成することができるN-アルキルグリシンのオリゴマーである。多くの有用なタンパク質リガンドが正常タンパク質標的^{1、10月14日}に対する大規模な合成ペプトイライブラリーをスクリーニングから同定されている。それにもかかわらず、トイドライブラリーから同定"ヒット"はめったにタンパク質標的^1,10-14,22に対して非常に高い親和性をアーカイブしません。一ミリアンペアJORペプトイドおよび天然ペプチドとの差がペプトイドのほとんどは、一般的に起因キラル中心およびコンホメーションの制約の欠如のために二次構造を形成する能力を欠いていることである。この問題を解決するために、複数の戦略は、主に主鎖の窒素原子上に含まれる^15-22側鎖の修飾に着目し、過去十年間にわたって開発された。最近、我々は、ペプチドの第三級アミド^23を作成....

Protocol

1。スプリット·アンド·プール合成の基礎

効率的に固相上の多数の化合物を生成するために、スプリット·アンド·プール合成は、しばしば一般的な戦略として採用される。 図4に示すように、テンタゲルビーズは三つの部分への最初の分割である。各部分はビーズ上の最初の残基を生成する別の試薬と反応させる。最初の反応の後、3つのすべての部分が、一緒にプールし、混合し、再び3つの部分に分割される。各部分は、再度、ビーズ上の第2の残留物を生成し、別の試薬と反応する。 2分割し、プールの工程を経て、9化合物が生成されます。

サブモノマー合成において、ビーズは、第一のカップリング試薬の存在下で異なるブロモ酸と反応させるためにいくつかの部分に分割される。溶媒で洗浄した後、全てのビーズは再び異なると反応させるためにいくつかの部分に分け、一緒に混合されプールされる第一級アミン。アミノ化後、すべてのビーズは一緒にプールされ、各ビーズ上の完全な単量体を完成、十分に洗浄した。所望の多様性に到達するまで、このプロセスを繰り返すことができる。

天然アミノ酸から酸臭化物の2。準備

。酸臭化物および第一級アミンと2アミノ化（ 図2）の1カップリング：サブモノマー合成において、各モノマーの合成は、2....

Results

ここでは、リンカーとPTAトリマーから3つの代表的なMALDIスペクトルを示している。 図6Aに示すように、50％TFA / DCM溶液を用いて室温下で切断された場合に、有意な分解が観察される。 図6Aに、593ピークと484は、それぞれのリンカーとPTAトリマーに対応し、分子全体が正常にビーズ上で合成が、切断時に分解されたことを示している。上記のように低温条件下で開裂すると、図6（b）に示すように、TFA誘発分解の量が大幅に抑制される。そのような切断のメカニズムは、以前の文献²⁴に記載されており、それはオキサゾリジン中間体を経ると考えられている。 PTA分子は、MS / MSによって配列決定することができ、 図6Cに示すように、断片化パターンは、ペプチド及びペプトイドと同様である。 （S）を用いて合成PTA分子-2 -ブロモプロパン、一般酸-D ₄グラムによるこのような（S）-2 -ブロモプロパン酸_3-dを（ 図7A

Discussion

ペプチドの第三アミド（PTAは）ペプチド模倣オリゴマーのスーパーファミリーである。よく研究されたペプチド、ペプトイドおよびN-メチル化ペプチドに加えて、このファミリー内の化合物の大部分がすぎなかったため、一般的なN-アルキル化ペプチドをアクセスするための合成法がないために、代役のまま。ここでは、アミノ酸由来のキラルビルディングブロックとのPTAを合成する効率的な方法を記載している。以前、我々は、PTA分子²³の合成ライブラリーに新たなサブモノマールートを使用することが報告されている。私たちは、PTAは、バックボーンを通じてコン​​フォメーションの拘束具を持っている、高度に構造化されたオリゴマーであることが示されている。 生体内で試験した場合、PTA分子が改善された細胞透過性、したがって、改善された活性^25を示した。しかし、すべての利点と並んで、PTAはまた、すぎなかっヒンダーの位置で第二級アミンのアシル化から、いくつかの合成の課題が付属しています。コンフォメーションの提供、α-側鎖制限は、次のカップリングステップのための立体障害をもたらします。これらの合成の課題を克服するため.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6トリメチルピリジン	ACROS	161950010	CAS:108-75-8
2-モルフォリノエタンアミン	Sigma-Aldrich	06680	CAS:2038-03-1
48% HBr 水溶液	ALFA AESAR	AA14036AT	CAS:10035-10-6
アセトアルデヒド	Sigma-Aldrich	402788	CAS:75-07-0
アセトニトリル	フィッシャー	SR015AA-19PS	CAS:75-05-8
無水テトラヒドロフラン(THF)	EMD	EM-TX0277-6	CAS:109-99-9
ベンジルアミン	Sigma-Aldrich	185701	CAS:100-46-9
炭酸ビス(トリクロロメチル)(BTC)	ACROS	258950050	CAS:32315-10-9
ブロモ酢酸		ACROS 106570010	CAS:79-08-3
クロラニル	Sigma-Aldrich	23290	CAS:118-75-2
シクロヘキサンメチルアミン	Sigma-Aldrich	101842	CAS:3218-02-8
D2O	ケンブリッジ同位体	DLM-4-99.8-1000	CAS:7789-20-0
D-アラニン	Anaspec	61387-100	CAS:338-69-2
ジクロロメタン (DCM)	フィッシャー	BJ-NS300-20	CAS:75-09-2
ジメチルホルムアミド(DMF)	フィッシャー	BJ-076-4	CAS:68-12-2
エチレングリコール	オークウッド	44710	CAS:107-21-1
イソペンチルアミン	Sigma-Aldrich	W321907	CAS:107-85-7
KBr	ACROS	424070025	CAS:7758-02-3
L-アラニン	Anaspec	61385-100	CAS:56-41-7
3-メトキシプロピルアミン	Σ-Aldrich	M25007	CAS:5332-73-0
2-メトキシエチルアミン	Σ-Aldrich	143693	CAS:109-85-3
N-(3-アミノプロピル)-2-ピロリジノン	Σ-Aldrich	136565	CAS:7663-77-6
N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド (DIC)	アクロス	115211000	CAS:693-13-0
N,N-ジイソプロピルエチルアミン (DIPEA)	シグマ-アルドリッチ	D125806	CAS:7087-68-5
NaNO2	ACROS	424340010	CAS:7631-99-4
NAOD 40% 水溶液	ACROS	200058-506	CAS:7732-18-5
ピペリジン	ALFA AESAR	A12442-AE	CAS:110-89-4
ピペロニルアミン	Sigma-Aldrich	P49503	CAS:2620-50-0
プロピルアミン	Sigma-Aldrich	240958	CAS:107-10-8
トリフルオロ酢酸	Sigma-Aldrich	299537	CAS:76-05-1
&α;-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸	Sigma-Aldrich	39468	CAS:28166-41-8
α-ケトグルタル酸	ALFA AESAR	AAA10256-22	CAS:328-50-7
テンタジェル樹脂 RINK リンカー付き	ラップポリマー	S30023
アラニントランスアミナーゼ	ロシュ	10105589001	AKA: グルタミン酸-ピルビン酸トランスアミナーゼ (GPT)
インキュベーター	ニューブランズウィック サイエンティフィック	Innova44
NMR	ブルカー	400 MHz
MALDI質量分析計	Applied Biosystems	4800 MALDI-TOF/TOF
凍結乾燥機	SP Scientific	VirTis ベンチトップ K
シリンジリアクター	INTAVIS	反応カラム	3 ml、5 ml、10 ml、20 ml
真空マニホールド	Promega	A7231	Vac-Man