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方法論記事

Synapto核メッセンジャータンパク質の活性に依存する核内移行を研究するために海馬スライスからCA1原子力エンリッチ画分の単離

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DOI:

10.3791/51310

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2014年8月10日

 ,  ,  ,  , 
1RG Neuroplasticity, Leibniz Institute for Neurobiology, 2Department of Cell Biology, Utrecht University

この記事について

サマリー

私たちは、海馬のCA1領域とスライスのtetanizedエリアからの核に富む画分のその後の単離における長期増強の誘導のための詳細なプロトコルを提供する。このアプローチは、学習および記憶の細胞モデルにおいて活性に依存する核タンパク質のインポートを決定するために用いることができる。

要約

勉強活動依存性タンパク質の発現、細胞内転座、またはリン酸化がシナプス可塑性の基礎となる細胞メカニズムを理解することが不可欠です。長期増強（LTP）および急性海馬スライスにおいて誘導される長期抑圧（LTD）が広く学習および記憶の細胞モデルとして受け入れられている。活動依存性タンパク質の動態を可視化するために、ライブセルイメージングまたは免疫組織化学の手法を使用する多くの研究があります。しかし、これらの方法は、単一ニューロンにおける蛍光タグ融合タンパク質の免疫細胞または過剰発現のための抗体の適合性に依存している。タンパク質のイムノは調査結果の独立した確認を提供する代替的な方法である。個別のtetanized海馬スライスからの細胞成分分画の製造における最初の制限要因は、材料の量が少ないです。第二に、処理手順は非常に重要ですlとさえ非常に短いとマイナーな操作のためスライスをivingすると、特定のシグナル伝達カスケードの活性化を誘導し得る。ここでは、ラット脳からの急性海馬スライスのCA1領域から十分な純度の核濃縮画分の十分な量を得るために最適化されたワークフローを説明する。代表的な例として、私たちはsynapto-核タンパク質のメッセンジャーのERK1 / 2リン酸化形態はヤコブが積極的にLTPの誘導時に核に移動し、CA1ニューロンの核濃縮画で検出できることを示している。

概要

シナプスN-メチル-D-アスパラギン酸受容体（NMDARを）は、シナプスNMDARをの活性化に対し、シグナル伝達、シナプス可塑性および細胞の生存に重要な役割を果たす神経変性および細胞死を誘発することができる。これらの変更は、厳密に制御/調整された活動依存性遺伝子発現に依存し、このようにして活性化シナプスや樹状突起および核7との間に一定の通信を必要とする。 MAPは、ERK1 / 2シグナル伝達シナプスNMDARを下流のエフェクターであるとシナプス外NMDA受容体を介したシグナルがないか、またはERK1 / 2活性8,11に対する阻害効果を有するのに対し、NMDAR活性化によって誘導される遺伝子発現に関与していませんキナーゼ。

遠位樹状突起と核の間を往復することが示されているタンパク質の数があります。これらのタンパク質の多くは、核局在化シグナルを含有し、積極的に核6,9にダイニンとインポーチン依存的に微小管に沿って輸送される。 Interestinglyは、これらのメッセンジャーのいくつかの特定のシナプスの刺激に応答して、核への唯一のトランジット。例えば、サイクリックAMP応答エレメント結合タンパク質2（CREB2）の逆行性輸送は、化学LTDなくLTP 12によって誘導される。ローカライズされたNMDAR依存シナプス刺激は、長期的な海馬可塑4に関与している転座法、核内にCREB調節される転写コアクチベーター（CRTC1）を駆動する。最近、蛋白質メッセンジャーヤコブは、シナプスとシナプス外NMDA受容体活性化の両方の後に核へ移行し、CREB依存性遺伝子の転写5を調節することが示された。信号のシナプスまたはシナプス外起源は、ヤコブの翻訳後修飾で符号化される。シナプス活性は、初代海馬培養物中の核へのその後の転座のための必要条件である180位（pJacobS 180）での重要なセリンでヤコブのERK1 / 2依存性リン酸化を誘導する。また、私nは急性海馬スライスのpJacobSのCA1ニューロンは180はシャファー側枝LTP後に核に移行したが1,10 LTDません。 pS180ヤコブは可塑性関連遺伝子の発現の増加につながり、この遺伝子の発現は、シナプス機能にフィードバックする。著しく対照的に、シナプス外NMDARを活性化がSer180でリン酸化されておらず、核内の異なるタンパク質複合体と関連する可能性があります後に核へ移行ヤコブは原因となる「CREBを遮断'とシナプスの接点10の後退。

synapto-核タンパク質のメッセンジャーの核内移行のほとんど発表された研究は、解離神経細胞初代培養で行われてきた。従って、そのような知見は、神経細胞の接続性と機能がはるかに優れた保存された海馬スライスを使用して、生理学的に関連性の高い状態で再現できるかどうかを確認するために興味深いものになるだろう。ここでは、LTPドを評価するための最適化されたプロトコルを提示イムノブロットによるタンパク質メッセンジャーの核移行をペンダント。この方法は、粗核画分中のタンパク質の活性依存性リン酸化を分析するのに適している。具体的には、現在のプロトコルは、急性CA1海馬スライス、誘導、およびLTPの記録の調製を含む。次に、CA1領域が微視的に刺激された領域を分離するために解剖される。私たちは、趙と同僚17で導入された変更でCellLytic核抽出キットにより提供される核を単離するためのプロトコルを組み合わせて変更しました。最適化された手順では、細胞膨張および核の放出を可能にする低張性緩衝液中で解剖し、CA1領域の溶解が含まれています。細胞溶解および核の形態は、顕微鏡検査により決定することができる。核濃縮は、短い遠心分離工程によって達成される。のNeuN及びNSE2、核または細胞質画分の特異的マーカーに対する抗体で免疫ブロットすると、このアプローチは速いとして使用できることを示しこれらの細胞成分分画を分離し、タンパク質リン酸化のような非常に不安定な翻訳後修飾を研究するために、再現性のプロトコル。さらに、この方法は、海馬スライスの解剖CA1領域に由来する小さな組織サンプルのために有利であり、海馬切片の免疫組織化学的に組み合わせて使用​​することができる。

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プロトコル

成体ラットの脳からの急性海馬スライスの調製

  1. イソフルランでラットを麻酔。注意：クローズexicatorを使用しての手順を実行して、イソフルランを吸入しないでください。動物が完全に麻酔をかけていることを確認します。
  2. ラットを斬首、すぐに脳を隔離し、mM単位precarbonated（95％O 2/5％CO 2ガス混合物）の氷冷をゲイ液（組成物中にそれを浸す：130のNaCl、4.9のKCl、1.5のCaCl 2·2H 2 O 、0.3のMgSO 4·2H 2 O、11のMgCl 2·6H 2 O、0.23 KH 2 PO 4、0.8のNa 2 HPO 4·7H 2 O、5グルコース·H 2 O、25 HEPES、22 NaHCO 3を、pHが7.32） 30分1,2,10,16のため。
  3. 嗅内皮質の小脳及び一部を削除します。その内側表面に各半球を下に置き、その後、正中矢状カットで皮質半球を分離します。その後作る各半球13,14の背側縁に沿って50〜70カット（50〜70°の横）。
  4. セクショニングシステムのスライスプラットフォーム上で新鮮にカット面を各半球を接着。プラットフォームはprecarbogenated、氷冷をゲイのソリューションでカバーしなければならない。
  5. z軸の振動を最小化するように調整ビブラトームを使用して前方から後方側に350μmの50〜70の横断スライスをカットします。海馬、嗅内皮質subicularとだけでなく、海馬に背外側に位置している皮質を実験13,14に使用するスライスの一部となります。
  6. U字型や水没型保育器に海馬スライスを移し、carbogenated人工脳脊髄液（単位：mm含むACSFで32℃で少なくとも2時間インキュベートする：110のNaCl、2.5のKCl、2.5のCaCl 2·2H 2 O、1.5マグネシウム4·2H 2 O、1.24 KH 2 PO 4、10mMグルコース·H 2O、27.4 炭酸水素ナトリウム、pH7.3）で1,2,10,16。

2電極のポジショニング、ベースラインの記録、およびLTPの誘導

  1. 顕微鏡下に取り付けられた水没型の記録室に海馬スライスを転送します。 32℃で少なくとも30分間carbogenated ACSFで（6〜7ミリリットル/分）を灌流する。
  2. （チップ抵抗は3-5MΩです）ACSFを充填したガラスキャピラリー微小電極を準備します。
  3. 刺激のためとのfEPSPは1,2,10（ 図2）を記録するのCA1放線層におけるCA1シェーファー担保繊維にACSFを充填したガラス微小電極を配置します。電極間の距離は約300μmであるべきである。
  4. 3-4 Vの範囲で、二相性の矩形電流パルス（200ミリ秒/極性）を持つシェーファー担保繊維の刺激によってフィールド興奮性シナプス後電位（fEPSPs）を想起
  5. INPを測定することにより、最大刺激テストを実行しますUT-出力の関係とは、得られた最大のfEPSP-勾配値の40％として、刺激の強さを定義し、実験を通じて一定に保つ。
  6. 最大刺激試験後、少なくとも15分間のベースライン記録を開始します。実験の間、毎分の刺激テストするための応答を測定します。低周波刺激とベースラインのレコーディングを行ってください。
  7. 少なくとも30分間のベースラインを記録します。
  8. 後期LTP誘導は5分あいだの間隔で100Hzで3 1秒刺激トレインからなる高周波数100 Hzの強直誘発を適用するため。 CA1領域内の刺激の場を増やすには5μMのビククリンは強直誘発前の2分で洗浄することができますし、すぐに最後の強直誘発した後に洗浄する必要があります。

3 LTPの誘導後のスライスの収集とスナップ凍結

  1. 後期LTPを誘導するテタヌス刺激の3列車の後に2分または30分の記録を停止LTP。
  2. は、電極を取り出し、すぐにドライアイス上に置きColD前駆金属プラットフォームにスライスを転送する。 U字型のインキュベーターで維持制御スライスするための手順を繰り返します。注意：ドライアイスでの作業中に手袋を使用してください。
  3. -80℃で1.5mlチューブとストア内の各スライスを収集します。

海馬のCA1領域から核エンリッチ画分の4の単離

  1. -80℃から凍結切片と1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブを取り出し、氷上に保管してください。
  2. チューブに、プロテアーゼ（PI）およびホスファターゼ（PS）阻害剤を含有する新鮮な冷たいTBS緩衝液を0.5ml加える。 2〜3分間インキュベートし、実体顕微鏡に移す。注意：PIおよびPSでの作業中に保護手袋と白衣を使用してください。
  3. 2本の針を使用して、海馬のCA1錐体層域を解剖。実体顕微鏡とのCA1領域を切断するための第二の針の下にスライスを保持するための一方の針を使用してください。
  4. 解剖したCAを収集50μlの溶解緩衝液（：10 HEPES、1.5のMgCl 2、10、PIおよびPSとのKCl、pHは7.9、mMの中に含む1×低張溶解バッファー）を含む新しい1.5 mlチューブに（グループごとに）5スライスから1地域。材料のこの量は2-3イムノブロットを実行するのに十分であることに注意してください。
  5. 慎重なピペッティングを上下することにより採取した組織を均質化する。 200μlのピペットを使用してください。細胞が膨潤することを可能にするために5-7分間氷上でライセートをインキュベートする。
  6. 、溶解液2μlのを取り、顕微鏡スライド上にドロップし、明視野顕微鏡下で細胞の膨潤を可視化する。細胞の適切な腫れで核が無傷の構造ラウンドとして表示されます。
  7. 'ホモジネート分画」として新しい1.5mlチューブにサンプルを20μlを収集します。 4×SDSサンプル緩衝液の変性8を添加する。
  8. 1分間11000 rpmで、残りの溶解物を遠心。
  9. 慎重に、TRトップ（ 'サイトゾル画分」）から上清を収集ansfer新しいチューブに4倍サンプル緩衝液20μlを加える。
  10. 低張性緩​​衝液60μlの中でペレットを再懸濁し、4倍のサンプル緩衝液20μlを加える。この画分は、「核濃縮画分」と呼ばれる。
  11. ホモジネート、細胞質ゾル、核濃縮された画分は、後で免疫ブロッティングのために℃〜-20℃または-80℃で保存することができる。

Synapto核タンパク質のための5。半定量免疫ブロッティング

  1. サンプルをDefreeze 95°Cで5分間それらを沸騰。
  2. 各画分からの5μlを取り、アミド黒のテストまたはBCA試験によりタンパク質濃度を決定する。
  3. SDS-PAGE上ホモジネートからのタンパク質サンプルを同量、細胞質および核に富む画分をロードします。コントロールとLTPスライスからのサンプルを、直接比較のために同じゲル上に配置する必要があります。
  4. 標準ウェスタンブロッティングの手順を実行します（ウェット転送を推奨します）。
  5. トンを有する膜をプローブ好きな彼は、抗体。その後、同じブロット（または同じ試料を並行して実行される）、細胞質マーカーを用いてプローブすることができます - ニューロン特異enolase2（NSE2）および核マーカー - のNeuNおよびローディング対照としてアクチン抗体。

6。データ解析

  1. LTP誘導の効率は、Clampfitソフトウェアによって分析することができる。ベースライン記録の平均勾配は、二元配置ANOVAを使用して強直誘発後の斜面と比較して、p <0.05での有意差があると考えした。のfEPSPの勾配値は、平均±SEMとして図に描かれた
  2. イムノブロットの定量化のために、オートラジオグラフィーフィルムのいずれかをスキャンし、LICORシステムをImageJのまたは蛍光バンドによってタンパク質バンドの積分密度を分析する。免疫反応性バンドの値がロードおよびブロッティング制御のために正規化されるべきである。 nonparametricalマンホイットニーU検定を使用してもよい制御およびLTP群の比較のために。
バッファの名前 試薬 濃度（mM）の 額 コメント/説明
をゲイ液 （pH：7.3〜7.4） NaClを 130 7.6グラム除菌
千ミリリットル塩化カリウム 4.9 0.37グラム
のCaCl 2·2H 2 O 1.5 0.22グラム
の MgSO 4·2H 2 O 0.3 0.0739グラム
のMgCl 2·6H 2 O 11 2.24グラム
KH 2 PO 4 0.23 0.0313グラム
のNa 2 HPO 4·7H 2 O 0.8 0.2145グラム
グルコース·H 2 O 5 0.9909グラム
HEPES 25 5.96グラム
炭酸水素ナトリウム 22 1.85グラム
ACSF液（pH：7.3〜7.4） NaClを 110 6.428グラム除菌
千ミリリットル塩化カリウム 2.5 0.1865グラム
のCaCl 2·2H 2 O 2.5 0.368グラム
の MgSO 4·2H 2 O 1.5 0.370グラム
KH 2 PO 4 1.24 0.169グラム
グルコース·H 2 O 10 1.9817グラム
炭酸水素ナトリウム 27.4 2.3グラム
1×低張緩衝液 （7.9） HEPES 10 0.23グラム
100ミリリットルのMgCl 2·6H 2 O 1.5 0.0304グラム
塩化カリウム 10 0.07455グラム

表1。バッファ。

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結果

私たちは、以前にsynapto-核タンパク質メッセンジャーヤコブはLTPの誘導ではなく、LTD 1以下の核内に蓄積することが示されている。また、シナプス刺激後のヤコブの転座は、MAPK ERK1 / 2およびSer180でのヤコブのリン酸化（ 図1）の活性化が必要である。リン酸化されたヤコブはインポーチン依存的に核に移行し、リン酸化された状態が15αinternexin中間径フィラメント（ 図1）との会合により、長期間にわたって保存することができる。ヤコブのリン酸化状態は、活動依存性遺伝子および細胞生存の発現に重要である。興味深いことに、シナプス外NMDARをの活性化にも核にヤコブを駆動しますが、この場合、ヤコブはSer180でリン酸化されていないし、その核内蓄積がCREBを誘導する5,10を 「遮断」。上記の結果は、protocoにより得た私たちの最近の研究で確立LS（参照Karpova ら 10モデルの詳細については）。

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ディスカッション

上記のプロトコルに記載の手順は、どのように迅速にスライスの誘導エリアを分析し、活動依存性タンパク質のダイナミクスを研究するための核濃縮画分を準備し、LTPを、若年または成体ラットからスライス海馬急性の準備誘導し、記録するためのガイダンスを提供する。このアプローチは、互いに独立して使用されるいくつかの異なる方法の組み合わせに由来する。私たちは、ワークフローを最適化し、LTPの誘導によって、タンパク質の細胞内再分布を研究するために、独自の実験をセットアップするための初心者のための十分な詳細を提供します。例として、私たちは、LTPの後期形はS180リン酸化されたヤコブの核蓄積を誘導することを実証している。所与のタンパク質の既存の核プールのリン酸化およびシナプス活性後のリン酸化形態の移動を区別するために、このアプローチは、核濃縮画分中の目的のタンパク質の総レベルの制御と組み合わせることができる。また、TESTILTP誘導後の異なる時点にわたるngのサンプルは、タンパク質活性化/不活性化または核ターンオーバーの時間経過を研究するための非常に洞察力に富んだかもしれません。

刺激されたスライスか...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究はDFG(SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK)、DIP助成金(MRK)、EU FP7 MC-ITN NPlast(MRK)、Center for Behavioral Brain Sciences(CBBS、Sahsen-Anhalt)、(AKおよびSB)によって資金提供されました。MMは、European Molecular Biology Organization(EMBO)のLong-Term Fellowship（EMBO ALTF 884-2011)およびMarie-Curie IEFの受賞者です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Equipment
CED 1401 AD/DAコンバーターCambridge Electronics Design, UK
a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">Stereomicroscope>Leica S4E, ドイツ
バイブロトームライカ VT1000S, ドイツ
絶縁パルス刺激装置A-Mシステム、米国モデル 2100
遠心分離機Thermo Scientific
SDS-PAGE システムBiorad
CoolerJulabo
明視野顕微鏡Nikon Eclipse TS100
細胞培養インキュベーターThermo Electron Corporation
マイクロマニピュレータールイグス &ノイマン、SM-5、ドイツ
ッティングチャンバーおよび電力供給業者のHoefer Scientific Instruments、カリフォルニア州
水中タイプ録音チャンバーカスタムメイド
のU字型および水中タイプインキュベーター カスタムメイド
の小さな外科用ハサミ
メス
薄いヘラプラスチック
パスツールピペット
プラスチック培養皿 
ブンゼンビーカー
Syringe
Reagents
NaClRothArt.-Nr.3957.1≥99.5%、PA、ACS、ISO
KClロスアート-Nr.6781.1≥99.5%、年率、ACS、ISO
CaCl2·2H2Oメルク1.02382.0500pro 分析
MgSO4·2H2OMerck5886.05pro analysis
MgCl2·6H2OAppliChemCAS-NO:7791-18-6;EC-NO:2320946分子生物学用
KH2PO4Merck12034.025分子生物学用
Na2HPO4·2H2OMerck1.06574.1000余分な純粋な
ブドウ糖·H2ORothArt.-Nr.6887.1分子生物学
HEPESRothArt.-Nr.9105.4PUFFERAN, ≥年率99.5%
NaHCO3Merck1.06329.1000pro analysis
プロテアーゼ阻害剤カクテルロシュ
ホスフォストップロシュ
BicucullineTocris Bioscience
イソフルランバクスター
Antibodies
一次抗体企業カタログ番号種数
pJac-s180Biogenesrabbit (希釈 1:100)
NeuNMiliporeMAB377マウス (希釈 1:1,000)
NSECell SignalingD20H2rabbit (希釈 1:1,000)
Β-actinSigmaA-5441マウス (希釈 1:5,000)
二次抗体会社カタログ番号種
IgG HRP 抱合型DAKOヤギ 抗マウス (1:5,000)
IgG HRP 抱合型NEBヤギ 抗ウサギ (1:5,000)
<ブロサンフランシスコの

参考文献

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