細胞壁の弾性特性のAFMベースのマッピング：ティッシュ、携帯電話、および細胞内の解像度で

サマリー

原子間力顕微鏡(AFM)を使用して植物組織の機械的特性をマッピングする方法を記述します。私たちは、広視野メソスケールで植物の発生過程で細胞壁に起こる力学的変化をいかに記録し、これらの変化を成長や形態形成と相関させるかに焦点を当てています。

要約

我々は、JPK AFMのために、原子間力顕微鏡（AFM）マイクロ/ナノくぼみを用いて植物組織の表面の機械的特性を測定するために、最近開発された方法を記載している。具体的には、このプロトコルでは、我々は花の分裂組織、胚軸および根×100ミクロンまで100μmの地域間で細胞内の解像度で細胞壁の見かけのヤング率を測定します。これは、サンプルの慎重な準備、マイクロ圧子とインデントの深さを正確に選択する必要があります。唯一の細胞壁の特性を考慮して、測定は、細胞を原形質分離を起こさせる、従って、細胞膨圧の寄与を除去するために、マンニトールの高濃度溶液中で行われる。

他の現存の技術とは対照的に、別の圧子の押し込み深さとを用いて、この方法は、マルチスケール同時測定を可能にするしかし、いくつかの制限が残っているこの方法はかなり小さな試料（直径100ミクロン程度）にして、外部の組織にのみ使用することができます。方法は、組織地形の影響を受けやすいです。それは、組織の複雑な機械的特性のみ特定の側面を測定します。技術が急速に開発されており、これらの制限のほとんどは、近い将来に解決される可能性がある。

概要

植物における成長は、各々を取り囲む硬質細胞壁の協調膨張および生物のあらゆる細胞によって達成される。証拠が蓄積することは、植物が局所的にこの膨張を制御すること、細胞壁の化学的性質の改変によるものであることを示している。膨張は、細胞の高い膨圧によって引き起こされる、セル壁に株によって主に駆動されると考えられている;膨圧この歪み応答は、細胞壁¹の機械的特性によって支配される。少しは、これらの機械的特性が知られており、それらは開発中にどのように変化するか。さらには、これらの小さな機械的特性を制御する方法で明らかにし、この組織を横切って調整されるようにして細胞壁の化学的性質を変化させるために貢献するかどうかは知られている。我々は、開発中に、植物細胞壁中の化学的および機械的変化との間の接続を理解することであり、これらの微視的な相互作用は、プラントを管理する場合には、最終的にどのようにの巨視的成長、細胞または組織スケールでの臓器の開発における細胞壁の機械的特性を監視することができる方法が必要とされる。

原子間力顕微鏡（AFM）マイクロメートルまたはナノメートルの組織の圧迫又はくぼみに基づいてここで説明する方法は、正確に細胞下解像度で同時に臓器の開発に組織の全領域にわたって細胞壁の機械的特性を測定するために開発された。伸びは、ミリメートルスケール^2-4における全組織の平均的な機械的特性を測定することができるだけであり、例えばにおける初期事象を測定す....

プロトコル

1。試料載用ガラススライドを準備

1. アガロースメディアを埋め込む準備：10％マンニトール（水中）での0.7％低融点アガロースを。
2. 強力な金属器具（ 例えばドリル先端、ライム）を使用して、顕微鏡スライドガラスの中央にある0.5×0.5センチメートルの領域をエッチングする。またはその代わりに、アラルダイト接着剤を使用してスライドガラスにガラスラメラ（約20×200ミクロン）の小片を接着します。注：これはスライドにアガロースメディアスティックまたは修正のことを確認するためにアガロースの付着を容易にするために、表面を粗くする。このスライドは、再利用することができます。
3. スライドガラスのエッチングされた領域の上にアガロースメディアを埋め込む約20μlの液滴を配置します。これは、アガロースの薄膜を提供します。
4. 湿度の高いボックス内のガラススライドを保存し、アガロースメディアが固化するのを待ちます。

2。分裂組織のサンプルを解剖し、取付

1. 共焦点想像力のための顕微解剖分裂組織NG：超微細ピンセットでそれらを引いて、茎から花芽を一つずつ削除してください。それは、がく片（ すなわち 、P1の原基^14）を示さない芽までのすべての花芽を除去することが重要である。
2. かみそりの刃やピンセットの先端を使って、離れて茎から分裂組織....

結果

図1において、我々は花の分裂組織（ 図1Aおよび1B）、老いも若きも胚軸（ 図1C-F）、および根分裂組織（ 図1G及び1H）の代表的なヤングモジュラスマップを提示する。全ての実験において圧子は、半球状であるが、異なる空間解像度が達成できるように、その半径が異なり1Cおよび1Dは、メソスケール-ナノスケールのくぼみ（50 nmの深さ）を有するメソスケール-ナノスケール圧子（50 nmの半径）の典型的な結果を示す。 cartographsは胚軸の表皮細胞の表面細胞壁中のマイクロスケールの不均一性を明らかに図1A、1E、および1Gは花の分裂組織、胚軸、根のためのメソスケールのくぼみ（500 nmの深さ）とメソスケール圧子（500 nmの半径）の典型的な結果を示している。;.......

ディスカッション

植物では、変化する機械的特性は、成長や形態形成を演出に大きな役割を果たしている。これまでに存在し、植物の成長を制御する遺伝的および化学的なネットワークの解明に大きな進歩であったが、これらのネットワークはに貢献し、機械的性質の変化によってどのような影響を受けるかについての我々の知識は、初歩的でもあります。このメソッドは、このギャップを埋めるために私たちを有効にする必要があり、そしてそれは、植物の成長や形態形成のあらゆる側面を研究する科学者への強い関心があるはずです。我々は今、課題や制限法の、そして今後の展望をまとめた。

プロトコルの中で最も困難なステップは、サンプル調製である。サンプルでは、​​しっかりとアガロースでガラススライドに固定されている必要がありますが、このアガロースは、測定すべきであるサンプルの任意の領域をカバーしてはならない。微妙に乾燥を防止しするように、組織の損傷を防止するようにさらに準備が（数分以内）に十分迅速に完了されなければならない：創傷ndは干ばつ、セル壁¹⁸の機械的特性の不可逆的変化をもたらすと予測される。別の挑戦的な工程は、適切なAF.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AFM	JPK	NanoWizard	すべての3世代は、同じプレファーメンテーションで作業を行うことができます。
AFMステージ	JPK	CellHesion	低トポグラフィー(11 µフォーススキャン領域の最低点と最高点の間のm)。
AFM光学系	JPK	トップビュー光学系	サンプルを位置決めするために非常に重要です。長距離双眼鏡や顕微鏡に置き換えることができます。
実体顕微鏡	ライカ	M125	どんなタイプの実体顕微鏡でも大丈夫です。
150nmマウントカンチレバー	ナノセンサー Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 ヌーシャテル、スイス	R150-NCL-10	表皮の表面の細胞壁のみを測定するために使用します。
1 &マイクロ;m マウントカンチレバー	ナノセンサー Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 ヌーシャテル、スイス	SD-Sphere-NCH-S-10	表皮の表面に直交する細胞壁の力学を測定する。
チップレスカンチレバー	ナノセンサー Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 ヌーシャテル、スイス	TL-NCH-20	組織の局所力学を測定するには (2-3 セル幅) 5 & micro;mはカンチレバーを取り付けました。5 & micro;mホウケイ酸ビーズからチップレスカンチレバーまで。
5 &マイクロ;m シリコン マイクロスフェア	Corpuscular	C-SIO-5
Araldite	Bartik S.A. 77170 Coubet, France		Araldite ビーズをチップレスカンチレバーに固定します。
低融点アガロース	フィッシャーサイエンティフィックフェアローン、ニュージャージー州 07410	BP160-100	34-45 °C ゲル化温度
D-マンニトール	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA	M4125-500G
2 Stainless Steel No. 5 Tweezers	Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland

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