Nanopodia - 細胞運動および細胞間の相互作用において役割を有する薄い、壊れやすい膜見通し

サマリー

Nanopodiaは、セルの前面を先頭または末尾に背面から100ミクロンにまで拡張し、細胞環境を感知薄いが脆弱な膜チャネルである。 37℃で、穏やかに洗浄し、エタノール、メタノール、アセトン等の有機溶媒の回避でより高いトリトンX-100の濃度の直接的な固定は、これらの細胞構造を観察するために必要とされる。

要約

培養液中の接着細胞は、移動や細胞間の相互作用をサポートするために、偏光状態を維持している。 Nanopodiaは、薄く細長い、TM4SF1（膜貫通4-L-6ファミリー-1）免疫蛍光染色によって可視化することができる内皮細胞および癌細胞中の大部分は、F-アクチン負の膜突起で。 100から300ミクロン径TMEDにおけるTM4SF1クラスターのような多くの14のような個々のTM4SF1の分子に3を含む（TM 4SF1 eはマイクロd omainsをnriched。） TMEDは、μメートル当たり1から3 TMEDの規則的な間隔でnanopodiaに沿って断続的に配置されており、しっかりと行列にnanopodiaを固定している。これは、偏内皮細胞または腫瘍細胞の前を先頭または末尾に背面から100以上のμメートルを拡張することnanopodiaが可能となり、MATRに残されるべき膜残基を引き起こすIXの細胞が離れて移動したとき。 TMEDとnanopodiaは、それらの極端な脆弱性および温度に対する感受性見過ごされてきた。ルーチンの洗浄と固定が構造を破壊する。 Nanopodia、染色の前に、0.01％トリトンX-100に短時間曝露し、続いて37℃でパラホルムアルデヒド（PFA）中に直接固定することによって保存される。細胞生物学における新しい展望を開くNanopodia：彼らは検出して距離をおいて他の細胞を識別し、密接な接触で細胞間の相互作用を開始し、移動、増殖に関与するシグナル伝達機構のため、細胞がその環境を感知する方法の理解を再構築し、細胞を約束する - 細胞コミュニケーション。 TM4SF1由来nanopodiaを研究するために開発されている方法は、古典的なテトラスパニン、特に普遍的に発現CD9、CD81、およびCD151の代理店を通じて他の細胞型に形成nanopodiaの研究のために有用である可能性がある。

概要

移動用の偏光の間に、動物細胞は糸状仮足、ラメリポディア、後退繊維、フリル¹を含め、それらの表面から動的、膜突起、さまざまな拡張。最近、このリストに追加さnanopodia、薄いの新しく認識されたタイプ（直径100〜300μmの）、などの糸状仮足のようなF-アクチンの構造の拡張のための膜チャネルを提供する細長い（最大50〜100ミクロンの長さ）の膜突起があったと後退繊維、その汚れ積極TM4SF1（膜貫通4-L-6ファミリー-1）培養内皮細胞および腫瘍細胞^の2,3内で。

TM4SF1は、もともと分子が内皮細胞の増殖および遊走^2,3において必須の役割を果たし、内皮細胞バイオマーカーであるという発見の前に、腫瘍細胞抗原⁴として知られていたテトラスパニン様トポロジーを有するタンパク質である。免疫蛍光染色は、TM4SF1がperinucに局在していることを明らかにしたリア小胞と細胞膜へとは、TM 4SF1 電子 nrichedマイクロd omains（TMED）に富んでいる。 TMEDアンカー行列にnanopodiaとnanopodia 1-3 TMED /ミクロンの長さの等間隔の縞状に存在する。 Nanopodiaは、典型的には、細胞の主要なフロントから延びており、移動のための細胞極性の間にリアト....

プロトコル

1。コラーゲンコーティングされたガラスディスク上の細胞培養

1. ガラスの瓶（4オンス）やディスクを滅菌するオートクレーブ内の場所のガラスディスク（直径12ミリメートル）。
2. 50ミリリットルファルコンチューブに25ミリリットルの70％エタノールを入れ、細胞培養フードに入れてください。溶液のレベルが20mlに低下するまでこの溶液を複数回再利用することができる。
3. ガラスディスクを処理するためにそれを使用する前に、5分間、70％エタノールに余分な細かい点でシャープな鉗子を配置します。
4. 慎重にチューブから鉗子を外し、キャップを閉め、ゆっくり2分間空気乾燥チューブの上にエタノール治療ピンセットを置く。鉗子の先端がフード内には何も触れないようにしてください。
5. ガラスの瓶のうちの一方の滅菌ガラスディスクを取得し、24ウェル細胞培養プレートのウェルに入れて滅菌ピンセットを使用する。井戸の所望の数のディスクが読み込まれるまで繰り返します。
6. （ウシコラーゲン溶液500μlを入れて50 ng / mlの）ガラスディスクを含有し、少なくとも30分間、37℃、5％CO ₂細胞培養インキュベーターに置き、各ウェルに。長いインキュベーションには害はありません。
7. 収穫HUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、またはPC3既にトリプシン処理を介して150ミリメートル細胞培養プレート中で増殖させ、その完全な培地を用いてトリプシ....

結果

ステップ1：

（例えば、HUVEC、およびこの研究で使用PC3等）、細胞が正常に成長することができるならば、細胞は播種後、30分以内にコラーゲン被覆ディスクに付着分極と程なく移動となり、先にそれらの経路のnanopodiaを拡張する運動の。 図1Aおよび1Bは、それぞれ偏光と増殖しているHUVEC。 図2（a）は、携帯状態で偏PC3細胞展覧。

手順2の場合：

37℃に4％PFAの予熱、20分間37℃で細胞を固定し、室温PBSで穏やかに洗浄して、細胞の状態がよく保存されるべきである。一般に、単離された個々のHUVEC（ 図1Aは、1）またはPC3（ 図2A）細胞は、細胞が細胞分裂の状態にある限り、偏光形態を示す（ 図1B、1）。う細胞間の相互作用細胞間結合の形成（ .......

ディスカッション

NanopodiaはしっかりTMEDを通して、マトリックスに付着して、環境を感知し、細胞間の相互作用^2,3を仲介する偏モバイル携帯から100μm以上を拡張することができ、薄い細胞膜チャネルである。 Nanopodiaセルが（ 図1および図2）離れるにつれて残基が残されるように強固に接着マトリックス。 Nanopodiaは、このように私たちは、細胞がその環境を感知する方法の研究と細胞移動経路を決定することを可能にし、どのようにして遺伝子発現または薬物治療の変更の動き。しかし、これらの薄い（100〜300μmの幅）膜構造の脆弱性には注意がそれらを保存するために注意が必要です。

忠実nanopodiaを妨げることなく、細胞活動を記録するために、実験条件はnanopodia活動と細胞移動経路をどのように影響するかを研究するために、1は最初に細胞がpurs前に完全培地中で効果的に成長していることを確認する必要があります実験uing。このようなHUVECなどの正常で健康な初代内皮細胞は、新鮮なEGM2-.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ガラスディスク	フィッシャーサイエンティフィック	12-545-82	直径12 mm
ガラス瓶	フィッシャーサイエンティフィック	02-912-310	認定クリアガラスストレートサイドジャー、4オン
ガラススライド	フィッシャーサイエンティフィック	12-544-1	フィッシャーファイネストプレミアムプレーンガラス顕微鏡スライド
50 ml ファルコンチューブ	BD ファルコン	352070	50 mlの高透明度ポリプロピレン円錐形遠心分離管、16,000 rcf定格。不妊。
発泡スチロールラック付き15mlファルコンチューブ	コーニング	430790	コーニング15ml PP遠心チューブ
シャープ鉗子	フィッシャーサイエンティフィック	13-812-42	解剖 超微細尖ったスプリンター鉗子
24ウェル細胞培養プレート	BDバイオサイエンス	353047	24ウェル細胞培養プレート
150mm細胞培養プレート	BDバイオサイエンス	353025	150mm細胞培養プレート
19 G 1 ½シリンジ針	BD Bioscience	309635	19 G 1 ½
エタノール	デコン研究所	2701	Decon's Pure Ethanol 200 Proof
Collagen Solution	BD Bioscience	354249	Collagen I, High Concentration, ラットテール, 100 mg
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-053-CI	0.25% Trypsin-EDTA 1x
DMEM	Life Technologies	11965-092	DMEM 高グルコース (1x), 液体, L-グルタミン付き, ピルビン酸ナトリウムなし
10x PBS	Affymetrix	75889 5 LT	PBS、10x 溶液、pH 7.4
PFA (パラホルムアルデヒド)	Affymetrix	19943 1 LT	4% in
PBS FBS	Sigma-Aldrich	F4135-500ML	ウシ胎児血清
EGM2-MV	ロンザ	CC-3162	EGM-2 BulletKit、EBM-2 Basal Medium 500 ml および EGM-2 SingleQuot キット サプリメント &成長因子
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002-25G	水に可溶化 4% ストック溶液、使用濃度は0.4%。
マウス抗ヒトTM4SF1抗体	Millipore	MAB3127	Epitopeは、マウス
抗ヒトCD9抗体	BD Bioscience	555370	Epitope is located in extracellular domain
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody	Life Technologies	A-21202	Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)
Phalloidin	Chemicon	90324	Rhodamine-conjugated Phalloidin
Anti-fade mounting media	ライフテクノロジー	ズ P-36931	ProLong Gold 退色防止剤 DAPI
70% エタノール			17.5 ml エタノール (200 プルーフ) 7.5 ml の二重脱イオン水
10x PBS (200 ml を作る)			20 ml の 10x PBS 180 ml の二重脱イオン水
20% Triton X-100 (20 ml を作る)			4 ml Triton X-100 16 ml 二重脱イオン水
4% NaN3 (25 ml を作る)			1 g の NaN3 25 ml の二重脱イオン水
50 ng/ml 牛コラーゲン溶液 PBS (5 ml を作る)			50 &mu のストック溶液;g/ml (50 ml) 830 μl コラーゲンI(3 mg) 50 ml PBS
ICCブロッキングバッファー(50 ml)			49 ml PBS 2% FBS(1 mlを追加) 0.04% NaN3(100 μl 4% NaN3)
ICC ブロッキングバッファー/0.01% Triton X-100 (50 ml)			50 ml の ICC ブロッキングバッファー 25 μ20%のl Triton X-100
HUVEC	ロンザ	C2517A	www.lonza.com
>PC3	ATCC	CRL-1435	www.atcc.org
細胞培養フード	NuAIRE	Nu-425-600	NU-425 (Series 60) 生物学的安全キャビネット
37度;C、5% CO2細胞培養インキュベーター	CellStar	QWJ300DABA	Cellstar CO2 ウォータージャケットインキュベータ
ー 加熱パッド	K&Hマニュファクチャリング	1020	K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com)
遠心分離機	Sorvall	T6000B	Sorvall T6000 (B) ベンチトップ遠心分離機用
血球計算盤	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line 血球計算盤

ス の細胞外ドメインに位置しています