培養細胞における細胞内および細胞外アスコルビン酸の定量のための迅速かつ特異的マイクロプレートアッセイ

サマリー

アスコルビン酸は、近年では光になってきたそれらの多くは、細胞代謝の多数の重要な役割を果たしている。ここでは、媒体スループット、細胞培養の両方において細胞内および細胞外アスコルビン酸の測定のための特異的かつ安価なマイクロプレートアッセイを記載している。

要約

ビタミンC（アスコルビン酸）は、唯一の近年の光になってきた、その多くは細胞代謝の多数の重要な役割を果たしている。脳のアスコルビン酸の恒常性のために重要であると思われる関係 - 例えば、脳内では、アスコルビン酸は、ニューロンとビシアストロサイト間のアスコルビン酸サイクルを伴う神経保護および神経調節的に作用する。さらに、新たな証拠は強くアスコルビン酸よりも古典的に認識され、細胞および全身の鉄代謝の調節において大幅に拡大役割を有することを示唆している。ノーマルと規制緩和、細胞および生物生理学のアスコルビン酸の重要な役割の増加の認識は非常に高価な専門機器を必要とせずに実行することができ、中スループットと高感度な分析手法の範囲を要求している。ここでは、BOの決定のための具体的かつ比較的安価なマイクロプレートアッセイ、中スループットの明示的な指示を提供細胞培養におけるTH細胞内および細胞外アスコルビン酸。

概要

1928年から1934年¹に発表された論文中のアスコルビン酸（ビタミンC）、そして念願のアルバートシェント·ジェルジによる「抗壊血病因子」、および他のようなその同定の化学的性質の発見は、歴史の中で画期的なイベントでした生化学の。確かに、これらの発見は、シェント·ジェルジが1937年にノーベル生理学·医学賞を受賞しているに貢献した。動物や植物生理学におけるアスコルビン酸のための役割の拡大を続けるスイートだけでなく、人間の健康を、アクティブな科学の対象であり続ける調査と論争。

L-アスコルビン酸が豊富な生理学的還元剤であり、哺乳動物系で補因子、酵素、コラーゲンヒドロキシル化、カルニチンやノルエピネフリン生合成、チロシン代謝とペプチドホルモンのアミド化^2を含む数々の明確に定義された酵素反応に貢献しています。興味深いことに、取り付けevideNCEは、アスコルビン酸などの水酸化に関与リルとアスパラヒドロキシラーゼなどの他の鉄依存ジオキシゲナーゼを、刺激し、低酸素誘導因子（HIFS）1αおよび^2α3の標的化に関与していることを示唆している。最近の報告では、アスコルビン酸が核ヒドロキシラーゼ、十文字C（のJmjC）ドメインタンパク質を刺激する、その活性を介したクロマチン脱メチル化に影響を与えることによって、T細胞の成熟に関与していることを示唆している。後者は完全な活性⁴のためのアスコルビン酸を必要とするように表示されます。実際、アスコルビン酸によるこのような酵素の刺激は、HIFとコラーゲンヒドロキシラーゼのアスコルビン酸による刺激と同様のメカニズムで起こると思われる。他の古典的な効果の中で、アスコルビン酸は、水溶性連鎖頑丈ラジカルスカベンジャー⁵などの細胞抗酸化および原形質膜のリサイクルに大きく寄与するα-トコフェロールwを^、6α-トコ基の還元による（ビタミンE）HICHは、膜脂質過酸化に対する保護⁷において重要である。ほとんどの哺乳類は、D-グルコースからのアスコルビン酸の新たな肝臓での合成が可能であるが、重要なのは、高等霊長類、モルモットといくつかのコウモリはビタミン⁸の栄養源に依存しています。これはグロ遺伝子の不活性化に起因して、影響を受けていない哺乳動物のオルソログのは^9月13日オキシダーゼ酵素、γ-グロノ-ラクトンをコードする。この酵素は、グルコース¹³からのアスコルビン酸生合成の最終的な反応のために必要である。

ヒトでの腸管腔からのトランスポーターが介在する吸収後、アスコルビン酸は、循環系によって体全体に分布している。ビタミンは、一般的に（濃度は、通常、一般的な血漿中濃度と同様である、赤血球の注目すべき例外として）、およびマイクロモルの濃で、細胞内にミリモル濃度でその還元型で発見されているほとんどの細胞外液^14,15におけるentrations（ 例えば 50〜200μM）。

生理的条件下では、アスコルビン酸は通常、アスコルビン酸、フリーラジカルに可逆的一電子酸化を受ける（AFR;もmonodehydroascorbateまたはsemidehydroascorbateとして知られている）。 AFRは比較的安定なラジカル¹⁶ですが、戻ってアスコルビン酸への迅速な一電子酵素的還元が存在しない場合に、2 AFRSは1アスコルビン酸とデヒドロ^{1（DHA）9,13,17}に不均化を促進することができます。セルの内部に、アスコルビン酸、DHAの二電子酸化生成物は、急速にグルタチオンとNAD（P）H依存性酵素及び非酵素的反応によって¹³に戻って、アスコルビン酸を低減することができる。

それは古典的に鉄代謝におけるアスコルビン酸の唯一の重要な役割は、非ヘム鉄¹⁸の栄養吸収を刺激することであることが認められているが、我々と他の証拠Sを提供してきたtronglyアスコルビン酸塩、この金属の代謝に大幅に拡張役割を果たすことを示唆している。まず、アスコルビン酸満ち細胞によって放出されたアスコルビン酸は、細胞^19,20による非トランスフェリン結合鉄の取り込みを調節するのに重要な役割を果たしていると思われる、と非常に最近の証拠は、アスコルビン酸はまた、トランスフェリン結合鉄の取り込みを調節することを示すセル²¹で、後半は主要な生理学的な鉄取り込み経路²²に対応しています。

アスコルビン酸は哺乳類^23,24の正常な中枢神経系の機能に必須である。一緒に副腎皮質、脳下垂体、胸腺、網膜と黄体と、脳は他の体組織^23,25-27にアスコルビン酸の相対的な高濃度が含まれています。また、アストロサイト^28,29および神経様細胞にグルタミン酸への³⁰の両方の露出がascorbat外空間へとアスコルビン酸の放出を引き起こすことが知られているEはグルタミン酸誘発神経機能障害³¹に対してニューロンを保護すると考えられている。アストロサイトからのグルタミン酸誘発アスコルビン酸の放出の正確なメカニズムは不明であるが、我々は最近、アストロサイトのグルタミン酸とアスパラギン酸トランスポーター（GLASTによるグルタミン酸の取り込みによる膨潤細胞の関与を示す証拠を提供した。にも知られている興奮性アミノ酸トランスポーターアイソフォーム1 [EAAT1ヒトにおける）とアスコルビン酸塩³²のような小さな有機アニオンに対して透過性容積感受性オスモライトおよび陰イオンチャネル（VSOACs）の結果としての活性化。 VSOAC形成に関与する形質膜導管の分子同一性は^{、33,34同定}されていない。

多くのアッセイは、蛍光分光光度アッセイ及びクロマトグラフィー^35,36を含む生物学的サンプル中のアスコルビン酸の測定のために開発されてきたが、特異性、感度、interferencに多くのばらつきがある化学汚染物質によるE、エンドポイントの分析物の効果的な直線範囲と安定性。さらに、アッセイの選択に影響を与える他の重要な要因は、迅速、使いやすさや、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）装置などの比較的特殊な装置へのアクセスである。

ここでは、培養細胞における細胞内アスコルビン酸の決定だけでなく、培養細胞からのアスコルビン酸の流出を測定するための別々のアッセイのためのシンプルかつ非常に特異的な比色マイクロプレートアッセイを提示する。後者のアッセイは、ナトリウム依存性アスコルビン酸トランスポーター（SVCTs）が発表しアスコルビン酸の迅速な再取り込みによる細胞からのアスコルビン酸の放出の過小評価の問題を回避することを目指しています。これらのメソッドの両方が私たちの前の出版物^{19,20,32,37,38}の一部で登場してきたが、この原稿は、その効果的な実行のための命令とガイドラインの明示的なセットを提供します。

プロトコル

1。培養細胞における細胞内アスコルビン酸の決定

1. 細胞培養および収穫
   1. 標準的な培養手順^{19-21,32,38を}使用して懸濁液（例えば 、ヒト赤白血病、K562）または付着細胞（ 例えば 、一次星状膠細胞）を成長させる。注意：細胞はアスコルビン酸が含まれていることを確認するために、どちらかアスコルビン酸またはDHA ^33,39などのアスコルビン酸で培養された細胞をロードします。
2. アスコルビン酸含有細胞抽出物を作成します。
   1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄懸濁液または氷のように冷たいセル透過処理バッファー[CPBの450μLと接着細胞の適切な数をインキュベートする; PBS中の0.1％（w / v）のサポニン; 4°C]。注：経験的にエンドユーザーが（下記参照）アッセイの直線範囲内で吸光度の値を得るために必要なセルの数を決定します。注：組織抽出物はまた、（さらなる詳細については、説明を参照）を使用することができる。
   2. 胸焼け10分間氷上でTE細胞は、徹底した細胞の溶解を確実にする。
   3. 冷蔵微量遠心（4℃）中で5分間16,000×gで粗溶解物の遠心分離により細胞破片を除去することによって、明確にアスコルビン酸含有細胞内抽出液を作成します。
   4. 慎重に各試料から4×100μLずつを除去し、PBS（ "-AO」）のみ、または25μL/ウェルの45.5 U25μlの/ウェルのいずれかを含む96ウェル平底プレート中のウェルの水平シーケンスに追加/ mlのPBS（「+ AO」）中のL-アスコルビン酸オキシダーゼ（AO）の原液。注：これは（下記参照）の規格の準備と並行して行う必要があります。
3. アスコルビン酸標準曲線の構築（各アッセイのために新たに構築しなければならない）
   1. 氷冷PBS中の10mMアスコルビン酸の原液を準備します。注：1分光光度法で石英キュベットを用いアスコルビン酸の濃度を確認265 nmの（吸光係数= 14.5mmで^-1 cm ^-1）で⁴⁰時1cm経路長。
   2. 慎重に0〜20μmのアスコルビン酸標準のシリーズを用意しております。
   3. ステップ1.2.4と並行して、慎重に各標準から4×100μlアリコートを除去し、PBS（ "-AO」）または25μL/ウェルが含まれ、96ウェル平底プレートのウェルの水平シーケンスに追加PBS中のAOの45.5 U / mlの原液（「+ AO」）。 （注）上記のアスコルビン酸標準100μlのアスコルビン酸0-2ナノモルが含まれます。注意してください、AOの目的は、減少をフェリシアにする非アスコルビン酸還元の寄与のために制御することです。
4. 細胞内のアスコルビン酸を決定-ステップ1：選択的にアスコルビン酸を除去し、定量的にフェリシアンとアスコルビン酸を酸化
   1. 公転ホイルでプレートを覆うことにより、暗所で5分間室温で550rpmで96ウェルプレートを混合する。注：T彼のステップは、DHAに「+ AO」のウェルですべてのアスコルビン酸を酸化する必要があります。 「-AO」ウェルは影響を受けないはずです。
   2. すべてのウェルにPBS中で（ここでは「フェリシアン」という。）3.5 mMのフェリシアン化カリウムの50μlを加える。最終的な[フェリシアン] = 1 mMの。注意：マルチピペッターを使用してください。
   3. 公転暗所でさらに5分間室温で550rpmでプレートを混合する。注：このステップは、酸化されたアスコルビン酸の1分子当たりに減少フェリシアンの2分子の化学量論比でアスコルビン酸によってフェロシアンするフェリシアンの減少をもたらすべきである。
   4. 直ちに50％（v / v）酢酸および30％（w / v）トリクロロ酢酸（TCA）を含有する新たに構成された溶液の25μlを加える。注意：マルチピペッターを使用してください。
5. 細胞内のアスコルビン酸を決定-ステップ2：フェロシアン化物の量を定量^37を形成し
   1. Eにフェロシアン決定液³⁷を100μlを追加よくACH。注：作業溶液は、使用直前になされるべきである：3 M酢酸ナトリウムの2ミリリットル液（pH 6.0）;氷酢酸（〜17.4 M酢酸）を0.5ml; 0.2 Mクエン酸を2ml; 0.1 M酢酸3.3ミリモルのFeCl ₃の2ミリリットル; 30 mMのferene-Sの1ミリリットル。この作業溶液の最終容量は7.5ミリリットルにする必要があります。
   2. 公転室温で30分間、550rpmで、暗所でプレートを混合する。
   3. 593 nmでのウェルの吸光度値を読み取る（ すなわち鉄_{（II）（ferene-S）3}錯体の吸収極大）。
   4. 最初に対応するから「+ AO」井戸のA _{593 nmの}値を減算して百万個の細胞あたりのナノモル、アスコルビン酸などの細胞内アスコルビン酸の量を計算する-各サンプルの「AO」井戸とし、アスコルビン酸の標準曲線から補間する（ステップ1.3を参照してください。 ）。標準曲線を構築する場合、ascorb量に対する各標準のために、この「差分値」をプロットするウェルあたり食べた。

培養細胞からのアスコルビン酸流出の2。決定

1. 細胞培養および収穫
   1. （ステップ1.1を参照）、上記のように、サスペンションや接着細胞を増殖させる。注：最良の結果を得るために、サスペンションや接着細胞で24ウェルプラットフォーム形式で、以下の分析を実施しています。
   2. 再懸 ​​濁浮遊細胞、または、またはカルシウムおよびマグネシウムなしで、予め温めたHEPES-緩衝生理食塩溶液400μlで、接着細胞をオーバーレイし、5mMのD-グルコース含有、ウェル中（HBS / D pH7.3の、37℃） 24ウェルプレート。検査される各24ウェルプレート上の指定された無細胞ウェルにHBS / Dの同じボリュームを追加します。注：後者は（以下を参照）は、ベースライン反応のための無細胞対照として役立つ。

3。リリースアスコルビン酸の量を決定します

1. 以下の原液を予め用意する必要があります。120HBS / D中のU / mlのAO（新鮮な準備）; 2.4 mMのFerene-S HBS / Dでは; HBS / Dでは120μMのFeCl ₃及び600μMのクエン酸Na（より高濃度のストック溶液からすぐにご用意）。
2. ferrireduction反応（ウェルあたり最終容量は600μLであるべき）を開始するには、すでにHBS / Dが400μLを含む個々のウェルに試薬を次のボリュームを追加します。
   1. 三連のウェルをペアリングするには、AO（120 U / ml）またはHBS / Dが50を添加する。最終AO濃度は10単位/ mlである必要があります。注：ラベルとして井戸を対になった」 - AO "と" + AO」。
   2. 37℃で5分間穏やか軌道に混合しながらプレートを混ぜる
   3. すべてのウェルに2.4 mMのferene-Sの50μlを加える。最終ferene-S濃度は200μMである必要があります。 37℃で5分間、上記のようにプレートを混合
   4. 新たに調製された120μMのクエン酸第二鉄の50μlを加える。最終的な鉄とクエン酸の濃度は、10μMの鉄および50μMクエン酸である必要があります。よく混ぜる。
3. 3連のコントロールウェルでは、上にあるメディアを吸引し、0.1％サポニンを含む600μlのHBS / Dを追加します。注：これらは、（下記参照）並行して行われるべき乳酸脱水素酵素（LDH）放出アッセイのために「100％の細胞溶解」対照として役立つ。
4. 37℃の暗所で60分間インキュベート
5. アスコルビン酸流出アッセイの終了時に、急速に各ウェルから500μLを吸引し、適切に24ウェルプレートのウェルをラベルに追加します。注：懸濁細胞を、最初に4℃での遠心分離により細胞を除去
6. 96ウェルプレートに上清の300μlのアリコートを追加してから、593で読み取っ。

細胞外アスコルビン酸4。決定

1. 593 nmでのウェルの吸光度値をお読みください。
2. 細胞内のアスコルビン酸の測定のために記載したようmgタンパク質（または細胞百万個あたり）当たりのナノモルアスコルビン酸として細胞外アスコルビン酸の量を計算するステップ1.5.4中。注：アスコルビン酸放出は、細胞内アスコルビン酸によって制限されないように、エンドユーザが条件を最適化すべきである。

LDH放出の5。決定

1. 各サンプルからの細胞外液の残りの200μlの細胞溶解の程度を決定するために、LDH放出アッセイ^32,41を実施^しています。注：総放出可能なLDHの％として計算します。 0.1％サポニンで処理したサンプルから放出可能なLDHを決定します。

結果

浮遊培養細胞の細胞内アスコルビン酸の定量

第一のアッセイ（ 図1）において、細胞内アスコルビン酸は、以前公開された手順³⁷でフェロシアン化物の高感度な測定を使用して、フェロシアンするフェリシアン化（ すなわち 、AOと小文字を区別）削減アスコルビン酸特有の後、決定されます。アスコルビン酸の検出は、フェロシアン化による第一鉄と第二鉄の還元してフェロシアン化物するフェリシアンのアスコルビン酸依存的な減少、によって生成された第一鉄の比色キレート化に基づいています。いくつかの二価の金属イオン（ 例えば銅^{2 +} CO ^{2 +}とZn ^{2 +）}の超生理学的濃度は、おそらくferene-Sによるキレート化のための第一鉄と競合することにより、干渉することができるように、適切な予防措置は、そのような条件の³⁷の下で撮影する必要があります。

図...

ディスカッション

本稿では、培養細胞における細胞内および細胞外コンパートメントから派生したアスコルビン酸の測定のための2、迅速な特定と比較的敏感比色マイクロプレートアッセイを提示する。アッセイは、標準的な実験機器や試薬へのアクセスを完了することができます。アッセイに必要な適度に高価な試薬は、それが、L-アスコルビン酸に向けた分析物特異性の高い学位を与えるように不可欠である、AO、です。アッセイは、いずれの浮遊細胞（ 例えば K562）または付着細胞（ 例えば HepG2細胞または初代げっ歯類のアストロサイト）に適していて、成功して、このような細胞の^{19,20,32,37,38を}使用して、以前の出版物で使用されてきた。それらはL-アスコルビン酸のために十分に特異的ではないようAOの代わりに他のアスコルビン酸酸化剤（ 例えば、テンポール）の使用は避けるべきである。さらに、例えば、化合物の使用アスコルビン酸放出アッセイでTEMPOLは、細胞膜を通過し、細胞内アスコ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Nunc 96ウェル平底プレート	Thermo	269620	平底96ウェルプレートなら何でも使用可能
冷蔵ベンチトップ微量遠心機	Eppendorf	5415D	冷蔵室の温度に平衡化された非冷蔵微量遠心分離機も使用可能
冷蔵ベンチトップ遠心分離機	Eppendorf	5810R	スイングバケット
バイオ・ラッド Benchmark Plus マイクロプレート分光光度計	バイオ・ラッド		593 nm で読み取り可能な任意のマイクロプレート分光光度計を使用でき、推奨されます。フィルターベースのプレートリーダーを使用する場合は、可能な限り最も近い波長を選択し、標準曲線法を使用してください。
Ependorf MixMate (マイクロプレートオービタルミキサー)	エッペンドルフ		これは非常に汎用性が高く信頼性の高いマイクロプレートミキサーで、これらのアッセイに非常に適しています
汎用バッファー
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS), pH 7.4
MOPS緩衝生理食塩水 (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-グルコース (MBS/D)
HEPES 緩衝生理食塩水 + 5 mM D-グルコース (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O、5 mM D-グルコース、20 mM HEPES-Na+、pH 7.3)
細胞透過化緩衝液(CPB;PBS中の0.1%サポニン)
一般的な化学物質
L-アスコルビン酸またはL-アスコルビン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich		最高純度の調製物を入手する必要があります
デヒドロ-L-アスコルビン酸(DHA)二量体	Sigma-Aldrich	30790	水溶液は、理論的にはDHAダイマーの1モルあたり2モルのDHAモノマーを産出
サイトカラシンB	Sigma-Aldrich	C6762	DMSOまたはエタノールで調製したストック溶液
アスコルビン酸オキシダーゼ(AO)	Sigma-Aldrich	A0157	ストック溶液(120 U / ml)は、PBSまたはMBSで調製し、アリコートで凍結
フェリシアン化カリウム(FIC)	Sigma-Aldrich	455989	三水和
物フェレン-S(3-(2-ピリジル)-5,6-ジ(2-フリル)-1,2,4-トリアジン-5&プライム;、5&プライム;′-ジスルホン酸二ナトリウム塩)	Sigma-Aldrich	92940
L-グルタミン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich
L-グルタミン	Sigma-Aldrich
サポニン	Sigma-Aldrich	47036	0.1%ストック溶液を調製
細胞内アスコルビン酸測定アッセイ
3 M酢酸ナトリウム(pH 6.0)
氷酢酸
0.2 Mクエン酸
3.3 mM FeCl 30.1 M酢酸
30 mM ferene-S
50%(v / v)酢酸+ 30%(w / v)トリクロロ酢酸(TCA)
アスコルビン酸排出アッセイ
AO (120 U/ml)
2.4 mM ferene-S
0.12 mM FeCl3 0.6 mM クエン酸