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方法論記事

コンセンサス脳由来のタンパク質、2D-DIGEとミニ2DEイムノ両方を使用して、ヒトおよびマウスの脳プロテオーム研究のための抽出プロトコール

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DOI：

10.3791/51339

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2014年4月10日

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1Team Alzheimer & Tauopathies, Jean-Pierre Aubert Research Centre, Inserm UMR 837, 2EA 4308-Department of Reproductive Biology-Spermiology-CECOS, CHRU-Lille, 3EA2686-Laboratorie d'Immunologie, Faculté de Médecine - Pôle Recherche, 4Department of Neurology, CHRU-Lille

この記事について

サマリー

人間とマウスの脳組織のために尿素/チオ尿素/ SDS緩衝液を使用した一般的なタンパク質抽出プロトコルを可能にする2D-DIGEとミニ2DEのイムノブロット法によるそれに続くキャラクタライゼーションによるタンパク質のINDENTIFICATION。この方法は、人間の生検および実験モデルから、より再現性と信頼性の高い結果を得るために1を可能にします。

要約

二次元ゲル電気泳動（2DE）は潜在的に異なる生理学的または病理学的状態に関連するプロテオームの変更を明らかに強力なツールです。基本的に、この技術は、第一工程におけるそれらの等電点に係るタンパク質の分離に基づいており、そして第二SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によってそれらの分子量に記載の方法。本報告書では、ヒトの死後、マウス脳組織の少量のための最適化されたサンプル調製プロトコルが記述されている。この方法は、両方の二次元蛍光差ゲル電気泳動（2D-DIGE）とミニ2DEイムノブロッティングを行うことが可能となる。これらのアプローチの組み合わせは、一質量分析検出との相溶性にそれらの発現のおかげで、新しいタンパク質および/またはタンパク質修飾を見つけることができるだけでなく、またマーカーの検証への新しい洞察。このように、ミニ2DEポストを特定し、検証するために、ウェスタンブロッティングを許可に結合された翻訳の修正、蛋白異化と異なる条件および/または処理間の定性的な比較を提供します。ここで、我々は、ADなど、アミロイドβペプチドとα-シヌクレインなどのレビー小体型認知症に見られるタンパク質凝集体の成分を研究するための方法を提供する。我々の方法は、このようプロテオームの解析のために適合させることができ、不溶性タンパク質もヒト脳組織およびマウスモデルから抽出する。並行して、それは、神経変性疾患、ならびに潜在的な新規バイオマーカーおよび治療標的に関与する分子および細胞経路の研究に有用な情報を提供することができる。

概要

精神的、神経学的障害は、病気の世界的な負担の13パーセントを表し、病態生理学的メカニズム、リスク要因と前駆症状のバイオマーカーのような新たな課題は、1を模索しなければならない。この目的に沿ったもので、人間の脳のプロテオミクス研究は、生理学的のためだけでなく、病理学的状態のためだけでなく、メモリ、行動、感情やインスタンスの神経可塑性のようなプロセスに関与する分子経路を明らかにすることが不可欠になる。従って、動物モデルの使用、より具体的にはトランスジェニックマウスは、ヒト神経変性障害の病因2を模倣する可能性の広い範囲をもたらす。

プロテオミクスアプローチは神経科学分野では、これらの新しい視点を達成するために、現在では利用可能です。二次元ゲル電気泳動（2DE）は、広範囲の試料のプロテオームを比較することができ、強力かつ簡単な方法である可能性が高い。また、も識別し、さらに質量分析によって分析するために複雑な混合物からタンパク質を単離するための強力な方法。 （IEF）を等電点電気泳動による等電点（pI）に係る1）タンパク質分離：この技術は、本質的に2つの連続するステップからなる。より正確には、電位がpH勾配の中でイモビアクリルアミドストリップに印加され、次いでタンパク質は、それらのグローバルネット電荷の関数に移動し、決定されたpIに焦点を当てる。 2）等電集束タンパク質が変性しており、それによって負にその第1の構造体中のタンパク質をSDS-PAGE 3によってそれらの見かけの分子量（MW）に応じて分離され、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の添加によってチャージされる。これら二つの異なる性質は、私たちはプロテオームの研究では、さらに行くためにdoub​​le値に対処することができます。一方で、このアプローチは、最小限の染料2D-DIGE法を用いて定量分析を実行するために可能性を提供し、一方qualitativウェスタンブロッティングに結合されたミニ2DEによるE分析。

2D-DIGEによる定量分析は、タンパク質の発現は、すべてのサンプルプロテオーム的に変化授ける。簡潔には、サンプルは三つの異なる波長（青、緑、赤）で発光する3シアニン（Cy 2を表し、Cy3およびCy5）で標識される。 N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル基を含有するこれらのフッ素最小限の染料は、共有結合、アミド結合4で得られたタンパク質のリジン残基のε-アミノ基と反応する。リジン残基は、タンパク質および主要なネットチャージ修正5,6ごとに複数のラベルの追加を防ぐ唯一の1〜3％、したがって、ラベルが付いています。 Cy3およびCy5は、多くの場合、Cy2は、比較したサンプルの同じ割合の組み合わせをタグしながら、2の独立したサンプルを標識するために使用される。 2つの主な利点は、全ての標識されたサンプルが混合され、IEFおよびSDS-PAGEの比較をゲル化するため、実験間のばらつきを回避する間、ステップごとに一度に1つのゲル中で行われていることである。また、タンパク質7の約1フェムトモルの高い検出閾値を示す。ゲルを走査し、2次元ソフトウェアがCy2と質量分析によるそれらの後方同定のためのスポットのうち統計的差異の同定を可能にする内部標準としての2Dゲルの蛍光画像を比較している。内部標準を用いて二次元解析ソフトウェアは、統計的信頼8の95％以上を有するサンプル間の差の10％未満の迅速な検出を達成する。

ミニ2DEによる定性分析は、タンパク質の特性評価のための重要なステップである。原理は、以前のpI及びMW分離のために記載したのと同じであるが、この場合、タンパク質は、膜およびイムノブロッティングに小さなポリアクリルアミドゲルから転送され、その後実行される。一次元ゲル電気泳動は、抗体の機能における1つまたはいくつかのタンパク質のエピトープのためのタンパク質発現の変化、情報技術を提供するがミニ2DEのNは、2つの追加パラメータを指定して賦与。まず、タンパク質isovariantsは、翻訳後修飾が起こる可能性があることを示す、pIはの関数として変化する。第二に、質量分析同定は、もっともらしいチモーゲン及びタンパク質の異化生成物を示すことができる。従って、2D-DIGEによって観察修飾は、グローバルプロテオームプロフィールの変化のメカニズムを示す可能性がある。同じタンパク質のエピトープのためのいくつかのサンプル間のイムノブロットのアライメント/ミニ2DEによるSはやや一次元免疫ブロッティング9、10で観測されたりしない翻訳後の変化に光を流して酸味の変更を反映することができる。さらに、この分析は、代謝残基11,12のPIとMWの知識に起因する潜在的な切断部位について通知します。

これら2つの技術の組み合わせは、相補的なプロテオミクス分析を提供する。一方では、2D-DIGEは、標準をもたらす表情は異なりますポリペプチドの正確な分離を可能差異のE。これらの違いは、スポットや蛍光ゲルのソフトウェア解析によって指定された1の強度の増加/減少の表示または非表示に本質的になる。しかし、それ自体でこれらの観​​察は、観察修飾の性質を説明する可能性は低い。の等変/アイソフォームレベルの変化：ポリペプチドを単離し、質量分析により同定されると、これらの理由から、ミニ2DEの使用は）正確に1を確認するために、単離されたタンパク質のアイデンティティと差の2）自然を可能にします例えば、発現、翻訳後修飾および切断プロセス。しかし、それは非常に似ていない抽出プロトコールの使用から生じる潜在的な分散体を制限するために2D-DIGEと、ミニ2DEと互換性両方の出発溶解緩衝液を開発する必要がある。

本稿では、デヒトおよびマウスの組織から来る脳タンパク質の2D-DIGEとミニ2DE技術の準備、抽出、性能に適合したプロトコルをスクライビング。

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プロトコル

1。均質化およびヒトおよびマウス脳組織からの全タンパク質の抽出

  1. 脳組織の均質化。 （ヒトサンプルについて）、ポッターガラスまたはマウス（サンプルの）テフロンホモジナイザーを用いて脳組織を10％（w / v）の8 M尿素、2 Mチオ尿素およびw / vのSDS緩衝液（UTS）を1％均質化する。全組織の崩壊13、14のための0.5秒を適用する超音波発生器と60 Hzの30パルスで超音波処理。
    1. 標準としてBSAを使用して、Bradfordアッセイでタンパク質濃度を決定します。これは、バッファ抽出限り溶解物が過熱カルバミル15を避けてはならないように1次元のSDS-PAGEと完全に互換性がありますUTS。
    2. アンバーの（w / v）の1％を加え、室温で10分の間に穏やかに混合しながらインキュベートする。その後、0.22μmのシリンジフィルターにフィルター処理し、最終的に尿素/チオ尿素溶液にSDSを加える。このステップは、equilibrである尿酸およびイソシアン酸の量を低減溶液中の尿素でIUMとその分解を促進する。
  2. クロロホルム/メタノールタンパク質沈殿。 11センチメートルIPGストリップのための蛋白質の100〜150μgの18センチのもの（独立IEFを実行するために選択されたpH範囲での）のために1〜1.5ミリグラムの間で沈殿させる。
    1. 氷上または4℃で、すべての手順を実行します。沈殿手順を開始する前に30分間、4℃でクール、クロロホルムとメタノール。
    2. UTS溶解物の1の体積にメタノールとクロロホルムの1の体積の3ボリュームを追加します。手動での混合物を振ると冷水の3ボリュームを追加します。 1分間の4℃で30分間、12,000×gでの遠心分離によってタンパク質をペレット渦
    3. パスツールピペットを用いて上清を捨て、冷MeOHの3ボリュームを追加します。再びボルテックスし、4℃で30分間12,000 xgで遠心最終的に上澄み液を廃棄し、N 2下でペレットを乾燥させます。
  3. 二次元分析のためのタンパク質の調製。2D-バッファー（8 M尿素、4％CHAPSを補充した2 Mチオ尿素）中のタンパク質 - 乾燥ペレットを再懸濁する。上に示したようにアンバーライトで溶液を洗浄し、2D-DIGE用2Dバッファー200μl当たりタンパク質500μgの割合を維持しようとします。注：2Dバッファは-80℃で保存するか、または（尿素分解を防ぐために）一週間の間4℃に保つことができる。
    1. 超音波処理とは、次の工程を実施するまで-80℃でサンプルを格納します。注目すべきは、このプロトコルは、タンパク質凝集体10のギ酸可溶化して使用することができる。簡単に言うと、N 2下でギ酸を蒸発させて説明したようにペレットを再懸濁。

（2）2D-DIGE

  1. サンプルテスト品質。投与量は、試料を再びブラッドフォード法を用いて。 、LDSサンプル緩衝液中のタンパク質15μgのを希釈し、37℃で加熱し、15〜12％ポリアクリルアミドゲル上にロードする。
  2. クマシー染色。 0.1％ポリアクリルアミドゲルを染色（w / v）のクーマブルーG-250は、少なくとも1時間、50％エタノール及び10％（v / v）の酢酸溶液。背景が7％酢酸および10％（v / v）エタノール溶液中で一晩脱色しましょう​​。
  3. サンプルの前の電気泳動ラベル。シアニン色素標識を実行する前に、N-ヒドロキシスクシン置換が塩基性pHでより効率的であり、pH 8.6において最適であることが指定されて以来、基本的な、あるいは中性であるべき試料のpHを確認する。
    1. 50μgのprotein/400 pmolの色素の比率を最小限にCy3またはCy5蛍光色素を用いた研究の2サンプルにラベルを付け、非プロトン化アミンとシアニンのNHSエステルの反応基を容易にするために、暗闇の中で、4℃で1時間保つリジンのグループ。
    2. 特にシアニンに1サンプルの優先的な結合を回避し、Cy3およびCy5色素でクロスラベルを作るサンプル変動を低減。シアニン色素標識は、最小限の広報は1μgの比率を維持しながら、タンパク質の少量に適合させることができることに留意されたい8 pmolのシアニン色素につきotein。その場合、ミニ2DEシステムが代わりに大きな2Dゲルシステムを用いることもできる。これは脳組織の少量のための2D-DIGE解析が可能になります。
    3. Cy2は蛍光色素で同量のタンパク質（計50μg）を用いて、両方のサンプルのプールを標識し、内部標準として用いられる。先に示したのと同じ条件を使用してください。
    4. 1.1％のDestreak試薬、IPGバッファーの1.2％とフェノールブルー標識されたタンパク質の合計150μgの（Cy2と50μgの、Cy2との50のCy3のおよび50μg）の痕跡を含む2次元のバッファーで、総容量350μLへの完全な。 4の独立したストリップを使用して四重に、この手順を実行します。また、分取ゲル用タンパク質の350〜450μgの2の追加の非標識ストリップ（各サンプルの1）を準備します。
    5. 受動的な再水和のための鉱物油を一晩で覆わ6ロードされたストリップを残す。
  4. 等電点電気泳動法。 20でIEFを実施6。C. pHは3-11NLの場合は、18センチメートルは、プロトコルを削除されています：最大電流設定は8段階で50μA/ストリップである：1）、150Vで1時間ステップ、2）200 Vの5時間、3）500 Vのグラデーションのステップのために2時間後、24,000 Vの計2時間、2時間、5）2000 Vの勾配、2時間6）4000 Vの勾配、2時間および8用7）8,000 Vの勾配）のため4）千Vの勾配·時間ステップ。 IEF後、クロマトグラフィーペーパーを用いて鉱物油を過剰に派遣し、二次元目まで-20℃でストリップを格納する。
  5. IPGは平衡を取り除きます。同じ緩衝液中の4.7％ヨードアセトアミドではなくDTTなしに6 M尿素、2％SDS、30％グリセロール、50mMのトリス-HCl、15分間のDTT、1％の緩衝液中で8.6とした後、ストリップを平衡化する。
  6. 二次元またはSDS-PAGE電気泳動。 6〜12％SDS-PAGEゲル（1.5 Mトリス-HCl、8.6、12％アクリルアミド/ビスアクリルアミド、0.1％（w / v）のSDS 0.072％（w / v）のAPSおよび0.1％（v / v）を作るTEMED ）STRIための4つの低蛍光ガラス板と、大きな2Dシステムを使用して同時にタンパク質スポットを切除するために、分取ゲルについての厚さの1.5ミリメートルの蛍光サンプルと他の二つのガラス板とPS。
    1. （w / v）アガロース0.5％でゲルの上に層状の上に6 IPGストリップをロードします。ランニング緩衝液は25mMトリス、192mMグリシンおよび0.1％（w / v）のSDSで構成されている。 4℃で16,17に設定された冷凍システムを用いて一晩2.5 W /ゲルで泳動を行う。
  7. 蛍光画像の取得と分析。蛍光ゲル画像（一つの実験のための12のイメージ）を得るために台風9400スキャナーを使用してください。スキャンCy2は、520分の488ナノメートル、580分の532 nmおよび670分の630 nmの励起/発光波長は、それぞれの各ゲルのためのCy3およびCy5のイメージ。画像を分析するインフォマティクスソフトウェアを使用してください。データは、研究2試料間の4のゲル間での信号の分配に関連するスポット量の変化を表している。
  8. 大きなゲルについてクマシー染色。 5で分取ゲルを修正0％（v / v）のエタノールおよび3％、少なくとも24時間（v / v）のオルトリン酸溶液。次いで後、20分間超純水で2回洗浄する。クマシーブルーG-250（w / v）の0.1％を添加する前に34％で着色1時間（v / v）のメタノール、17％（w / v）の硫酸アンモニウムおよび2％オルトリン酸を実行する。少なくとも48時間、着色がゲルを維持し、超純水で脱色。
    1. MS同定のためのスポット。蛍光画像を解析されると、ソフトウェアが表現統計的に差があるスポットのリストを提供します。手動で取ゲルからこれらのスポットを切り出す。この手順では、ケラチン汚染を回避するために実際に、いくつかの手先の器用さを必要とする。次いで、サンプルを、MSに送信するまで-20℃で水中に保つことができる。スポットの同定は、タンデム質量分析（MS / MS）と完全に互換性があり、タンパク質アイデンティティの関連性は、0.05に（p <0.05）18のp値が計算された確率もとのMowseスコアに従って判定される。

    3。定性的ミニ2DEアッセイ

    1. 11センチメートルIPGストリップのための最終容量200μlまでの2Dバッファにタンパク質試料の最大1​​00μgの再懸濁する。過剰発現系または精製されたタンパク質の場合、開始量は20μgのに下げることができる。
    2. 200μlの最終容量まで（v / v）のDestreak試薬、0.55％（v / v）のIPG緩衝液およびブロモフェノールブルー、微量の1.1％を加える。その後、渦は、高速スピンをして、一晩鉱物油で覆われた（元の厚さにストリップをもたらすために）パッシブ再水和のためにIPGストリップにロードします。注：IPG緩衝液の割合は、（pHが3-11、4-7、7-11、等）の所望のpHのすべての区間について同じであるが、その組成物は、選択されたpH範囲の関数として変化する。
    3. Isoelectrofocalisation。 20℃でIEFを実行プログラムの期間は、選択されたpH間隔に依存します。注目すべきは、このような電気浸透は、IEFプロファイルを乱す可能性があるこれらの場合のパラメータ、electrofocalisation時間の最適化が19必要です。注：それは必ずしも良い結果を提供しますが、IEFの時間を短縮することも解像度を向上させることができ、より長いIEFではありません。 IEFの後、IPGストリップをヶ月間-20℃で保存することができる。
    4. IPGは平衡を取り除きます。 25mMのトリス-HCl、pH6.8、20mMのDTT、10％グリセロール、5％SDS、0.05％ブロモフェノールブルーを含有する緩衝液中でストリップを平衡化する。 3平衡は、各浴との間の緩衝液を変えて15分間浸す作る。
    5. SDS-PAGE。目的のタンパク質の分子量に応じて選択アクリルアミドの割合がプレキャストゲル（IPG 1だけでなく、11センチメートルIPGストリップ）にIPGストリップレイヤ。その後、33分の間に100 mVでニトロセルロース/ PVDF膜上にゲルをブロット。
    6. 必要な抗体を用いて一晩インキュベートし、ペルオキシダーゼ活性により可視化する。二次抗体によって明らかに無関係なポリペプチドを用いてイムノブロットのアライメントを行う。半quantitリーチImageJのソフトウェアを使用してトレース/スポットのボリュームと強度のデンシトメトリー分析をative。

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結果

理想的な緩衝液は、タンパク質の100％、特に膜結合又は細胞骨格タンパク質を回収するために存在しないので、脳組織に対するプロテオミクスは依然として厳しい。実験の最初のセットは、タンパク質の大きなパネルを回復することができますつのアプローチと互換性の適切な溶解バッファーの検索に焦点を当てた。したがって、3つの溶解緩衝液は、最も適切なものを決定するためにアッセイした。第一に、それは1％の10mM（w / v）のSDS（図1A）に共通の生化学および分子生物学のトリス-HCl緩衝液20を用いた。さらに、トリス-HClポリアクリルアミドおよびアガロースゲル電気泳動のためのバッファとして堅牢なアプリケーションを有している。他の2の溶解バッファは、UTS（図1B）と2DE 1だった。トリス-SDS高いスポット分離、無distorsionとFA UTSで観察したプロファイルと比較した（図1B）悪い解像度が得られるし、スポットの数が大幅に低下したrは良好タンパク質の回収（図1B）が観察された。この点は...

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ディスカッション

タンパク質の病理学的な発現変化を発見、バイオマーカー探索および薬理学的標的の可能性経路の調節がneuroproteomicsの目的の一つであるが30に近づく 。新興のツールの中で、2DEフィールドが有望予想されているものが追加されます。それにもかかわらず、コンセンサスがばらつきを最小限にし、実験で再現性を高めるために、到達されるべきである。このアイデアの行に2D-DIGEを実行するための標準化されたプロトコルのモノ次元イムノブロット法と完全に互換性が、ヒトとマウスの脳組織のために（ 図2）とその後の2DEのイムノブロット（ 図3）は 、本明細書に詳細に記述されている。

プロテオミクスにおける最大のジレンマの一つは、可溶化バッファーの選択である。それはIEFと完全に互換性があるので、異なるアプローチの間での再現性を高めるためには、UTSを選択した。また、UTS抽出緩衝液はPELLEを生じなかっTまたは12,​​000×gで遠心分離した後、実際にわずか1（4℃で、SDS沈降と...

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開示事項

著者らは、宣言する特別の利害関係はありません。

謝辞

この作品は、向かわせる、リール2大学、MEDIALZ、LabEx（卓越した研究室、プログラムは将来のための投資）とDISTALZ（アルツハイマー病への横断型アプローチのための革新的な戦略の開発）によってサポートされていました。 FJ.FGは現在、ANR（フランス国立研究機関/ NeuroSpliceドタウ01プロジェットANR-2010-BLAN-1114）の受信者の交わりですが、この作品はJCCM（スペイン）からの助成金の支援の下にもありました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 NmoGE Healtcare25-8010-65
Immobiline DryStripGE HealtcareReference in function of the pH interval/size
IPG Buffer, pH X-XGE HealtcareReference in function of the pH interval desired
AMBERLITE IRN-150L Mixed Bed Resin 1 GE Healtcare551797N
Drystrip カバー フルイモビリン 1 * 1 lGE Healtcare17-1335-01
キットボックス IPG 1 * 1 キットGE Healtcare28-9334-92受動的な水分補給を行うためのプラスチックボックス 
MILLEX GS FilterMilliporeSLGS033SB
Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)Bio-Rad関数の参照
IPGphor III アイソエレクティング フォーカシング ユニットGE Healtcare11-0033-64
Ettan DALTsix 大型電気泳動システムGE Healtcare80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm ゲルカンパニーP2D1.5
MW

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