コンセンサス脳由来のタンパク質、2D-DIGEとミニ2DEイムノ両方を使用して、ヒトおよびマウスの脳プロテオーム研究のための抽出プロトコール

Summary

人間とマウスの脳組織のために尿素/チオ尿素/ SDS緩衝液を使用した一般的なタンパク質抽出プロトコルを可能にする2D-DIGEとミニ2DEのイムノブロット法によるそれに続くキャラクタライゼーションによるタンパク質のINDENTIFICATION。この方法は、人間の生検および実験モデルから、より再現性と信頼性の高い結果を得るために1を可能にします。

Abstract

二次元ゲル電気泳動（2DE）は潜在的に異なる生理学的または病理学的状態に関連するプロテオームの変更を明らかに強力なツールです。基本的に、この技術は、第一工程におけるそれらの等電点に係るタンパク質の分離に基づいており、そして第二SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によってそれらの分子量に記載の方法。本報告書では、ヒトの死後、マウス脳組織の少量のための最適化されたサンプル調製プロトコルが記述されている。この方法は、両方の二次元蛍光差ゲル電気泳動（2D-DIGE）とミニ2DEイムノブロッティングを行うことが可能となる。これらのアプローチの組み合わせは、一質量分析検出との相溶性にそれらの発現のおかげで、新しいタンパク質および/またはタンパク質修飾を見つけることができるだけでなく、またマーカーの検証への新しい洞察。このように、ミニ2DEポストを特定し、検証するために、ウェスタンブロッティングを許可に結合された翻訳の修正、蛋白異化と異なる条件および/または処理間の定性的な比較を提供します。ここで、我々は、ADなど、アミロイドβペプチドとα-シヌクレインなどのレビー小体型認知症に見られるタンパク質凝集体の成分を研究するための方法を提供する。我々の方法は、このようプロテオームの解析のために適合させることができ、不溶性タンパク質もヒト脳組織およびマウスモデルから抽出する。並行して、それは、神経変性疾患、ならびに潜在的な新規バイオマーカーおよび治療標的に関与する分子および細胞経路の研究に有用な情報を提供することができる。

Introduction

精神的、神経学的障害は、病気の世界的な負担の13パーセントを表し、病態生理学的メカニズム、リスク要因と前駆症状のバイオマーカーのような新たな課題は^、1を模索しなければならない。この目的に沿ったもので、人間の脳のプロテオミクス研究は、生理学的のためだけでなく、病理学的状態のためだけでなく、メモリ、行動、感情やインスタンスの神経可塑性のようなプロセスに関与する分子経路を明らかにすることが不可欠になる。従って、動物モデルの使用、より具体的にはトランスジェニックマウスは、ヒト神経変性障害の病因²を模倣する可能性の広い範囲をもたらす。

プロテオミクスアプローチは神経科学分野では、これらの新しい視点を達成するために、現在では利用可能です。二次元ゲル電気泳動（2DE）は、広範囲の試料のプロテオームを比較することができ、強力かつ簡単な方法である可能性が高い。また、も識別し、さらに質量分析によって分析するために複雑な混合物からタンパク質を単離するための強力な方法。 （IEF）を等電点電気泳動による等電点（pI）に係る1）タンパク質分離：この技術は、本質的に2つの連続するステップからなる。より正確には、電位がpH勾配の中でイモビアクリルアミドストリップに印加され、次いでタンパク質は、それらのグローバルネット電荷の関数に移動し、決定されたpIに焦点を当てる。 2）等電集束タンパク質が変性しており、それによって負にその第1の構造体中のタンパク質をSDS-P....

Protocol

1。均質化およびヒトおよびマウス脳組織からの全タンパク質の抽出

1. 脳組織の均質化。 （ヒトサンプルについて）、ポッターガラスまたはマウス（サンプルの）テフロンホモジナイザーを用いて脳組織を10％（w / v）の8 M尿素、2 Mチオ尿素およびw / vのSDS緩衝液（UTS）を1％均質化する。全組織の崩壊^13、14のための0.5秒を適用する超音波発生器と60 Hzの30パルスで超音波処理。
   1. 標準としてBSAを使用して、Bradfordアッセイでタンパク質濃度を決定します。これは、バッファ抽出限り溶解物が過熱カルバミル^15を避けてはならないように1次元のSDS-PAGEと完全に互換性がありますUTS。
   2. アンバーの（w / v）の1％を加え、室温で10分の間に穏やかに混合しながらインキュベートする。その後、0.22μmのシリンジフィルターにフィルター処理し、最終的に尿素/チオ尿素溶液にSDSを加える。このステップは、equilibrである尿酸およびイソシアン酸の量を低減溶液中の尿素でIUMとその分解を促進する。
2. クロロホルム/メタノールタンパク質沈殿。 11センチメートルIPGストリップのための蛋白質の100〜150μgの18センチのもの（独立IEFを実行するために選択されたpH範囲での）のために1〜1.5ミリグラムの間で沈殿させる。
   1. 氷上または4℃で、すべての手順を実行します。沈殿手順....

Results

理想的な緩衝液は、タンパク質の100％、特に膜結合又は細胞骨格タンパク質を回収するために存在しないので、脳組織に対するプロテオミクスは依然として厳しい。実験の最初のセットは、タンパク質の大きなパネルを回復することができますつのアプローチと互換性の適切な溶解バッファーの検索に焦点を当てた。したがって、3つの溶解緩衝液は、最も適切なものを決定するためにアッセイした。第一に、それは1％の10mM（w / v）のSDS（図1A）に共通の生化学および分子生物学のトリス-HCl緩衝液^20を用いた。さらに、トリス-HClポリアクリルアミドおよびアガロースゲル電気泳動のためのバッファとして堅牢なアプリケーションを有している。他の2の溶解バッファは、UTS（図1B）と2DE 1だった。トリス-SDS高いスポット分離、無distorsionとFA UTSで観察したプロファイルと比較した（図1B）悪い解像度が得られるし、スポットの数が大幅に低下したrは良好タンパク質の回収（図1B）が観察された。この点は.......

Discussion

タンパク質の病理学的な発現変化を発見、バイオマーカー探索および薬理学的標的の可能性経路の調節がneuroproteomicsの目的の一つであるが³⁰に^近づく 。新興のツールの中で、2DEフィールドが有望予想されているものが追加されます。それにもかかわらず、コンセンサスがばらつきを最小限にし、実験で再現性を高めるために、到達されるべきである。このアイデアの行に2D-DIGEを実行するための標準化されたプロトコルのモノ次元イムノブロット法と完全に互換性が、ヒトとマウスの脳組織のために（ 図2）とその後の2DEのイムノブロット（ 図3）は 、本明細書に詳細に記述されている。

プロテオミクスにおける最大のジレンマの一つは、可溶化バッファーの選択である。それはIEFと完全に互換性があるので、異なるアプローチの間での再現性を高めるためには、UTSを選択した。また、UTS抽出緩衝液はPELLEを生じなかっTまたは12,​​000×gで遠心分離した後、実際にわずか1（4℃で、SDS沈降と.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval/size
IPG Buffer, pH X-X	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval desired
AMBERLITE IRN-150L Mixed Bed Resin 1	GE Healtcare	551797N
Drystrip カバー フルイモビリン 1 * 1 l	GE Healtcare	17-1335-01
キットボックス IPG 1 * 1 キット	GE Healtcare	28-9334-92	受動的な水分補給を行うためのプラスチックボックス
MILLEX GS Filter	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)	Bio-Rad		関数の参照
IPGphor III アイソエレクティング フォーカシング ユニット	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix 大型電気泳動システム	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm	ゲル	カンパニーP2D1.5