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方法論記事

から電気生理学的記録

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DOI:

10.3791/51355

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2014年2月26日

 ,  , 
1MCDB, Yale University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、 ショウジョウバエにおいてlabellar味覚ニューロンによって発射活動電位応答の細胞外記録を記述する。

要約

昆虫の周辺味覚応答は強力な電気生理学的手法を用いて調査することができます。ここで説明する方法は、昆虫の神経系は、その環境における味覚刺激から受ける感覚入力を反映して、研究者が直接かつ定量味覚応答を測定することができます。このプロトコルは、この手法を実行中のすべての重要なステップの概要を説明します。このように必要な機器や記録に適した環境の選択などの電気生理学リグの組み立ての重要なステップは、線引きされています。我々はまた、適切な参照と記録電極を行うことで、記録のために準備する方法について説明し、味物質のソリューション。我々は、詳細に口吻を固定するために、フライにガラス参照電極を挿入することによって昆虫を調製するために使用される方法を記載している。私たちは、砂糖と苦味化合物に反応して味覚ニューロンによって発射電気インパルスの痕跡を示している。プロトコルの態様は、トンであるechnically挑戦し、我々はそのような信号や、システム内の過度のノイズがないこと、および潜在的な解決策として、発生する可能性のあるいくつかの一般的な技術的な課題の広範な記述が含まれています。そのような技術は、時間的に複雑な刺激を送達する送達を刺激する直前に発射背景を観察する、または都合よく水不溶性の味覚化合物を使用できないなどの制約を有する。これらの制限にもかかわらず、（プロトコルで参照マイナーバリエーションを含む）は、この技術は、化合物を味わうために、ショウジョウバエのニューロンの応答を記録するための広く受け入れられた手順の標準です。

概要

味覚は、昆虫は、可溶性の化学物質の広大な範囲を検出することを可能にし、栄養価の高い物質の受け入れに重要な役割、または有害または有毒1の拒絶を果たしている。味はまた、フェロモン1-5を検出することにより、配偶者選択において役割を果たしていると考えられている。これらの重要で多様な機能は、感覚系、環境手がかりを、関連する行動出力に変換する方法に昆虫味覚系調査の説得力のある目標ました。

キイロショウジョウバエの味覚系の主要ユニットは味の毛、または感覚子である。分子は、その先端2,6の細孔を経由して感覚子を入力してください。感覚器は唇弁、脚、翼マージン、および咽頭6に見られる。唇弁に、感覚器の数と位置がステレオタイプされている。ロング（L）、中間（I）、ショート（S：3形態的長さに基づいて、感覚器のクラスがあります。 ）7,8を感覚器。各感覚子は2（Iタイプ）または4（L-およびSタイプ）味覚受容ニューロン（GRNs）9のいずれかが含まれます。異なるGRNsは味覚刺激の異なるカテゴリに対応：苦い、砂糖、塩および浸透圧7,10および味覚受容体8,11-13の異なるサブセットを発現する。唯一のIとSタイプの感覚器は苦い応答GRNs 8,10が含まれています。食道下神経節（SOG）へGRNsプロジェクトと味分子によるそれらの活性化は、行動反応6で、その結果、復号化のために、より高い中枢神経系に中継される。ニューロンの比較的少数の分子と行動分析への従順は、 ショウジョウバエの味覚系一般的な味覚システムの調査のための優れたモデルにする。システムは、遺伝的変異またはGAL4-UAS発現システムを介して操作することができる相対的な容易さにも貴重なツール14,15として機能します。

ontent ">これらの感覚器は唇弁の表面から突出しているので、それらは電気生理学のための優れた標的となる。GRNsの焼成は、細胞外記録を用いてモニターすることができる。歴史的には、中に挿入さガラス電極を使用して側壁記録方法ニューロンの活動を記録する感覚子、26が用いられていたが、この方法は実行するのに技術的に困難であり、それは各調製物から長い間記録することが困難であり、その電極と神経細胞の応答を測定する先端記録方法、同時に味物質を提供し、以来、選択肢9,16の方法になっている。これは、 キイロショウジョウバエ 8,10,17,18の味覚系だけでなく、他の昆虫種19〜23の数を調査するために利用されてきた。それが持っている大幅に補償することによって、先端記録方法の主要な欠点​​の一つを克服tastePROBE増幅器の開発により容易化されてGRN活動電位が過剰に増幅やフィルタリング24ずに記録されることを可能にする基準電極と昆虫感覚子との間に大きな電位差が、。もう一つの重要な開発は、記録電解質25としてtricholineクエン酸を使用することであった。 TCCは浸透圧モル濃度の影響を受けやすいGRNからの応答を抑制し、25を分析する方がはるかに簡単苦いと砂糖味物質によって生成された応答を作り、塩感受性GRNを刺激しない。

ここでは、 ショウジョウバエ labellar感覚器の先端記録は現在、カールソンの実験室で行われている方法を説明します。このプロトコルは、ハエを準備する方法は、適当な電気生理学リグを構築する方法を説明しますと、味の録音を実行する方法。我々はこれを使用する際に遭遇する可能性があるショウジョウバエの感覚器のサブセットから録音したいくつかの代表的なデータだけでなく、いくつかの一般的な問題と解決策をも提示テクニック。

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プロトコル

次のプロトコルは、エール大学のすべての動物保護ガイドラインに準拠しています。

1。試薬および器具の準備

  1. 録音機器のセットアップ（ 図1A）。
    1. 温度や湿度の大きな変化が無く、また冷蔵庫や遠心分離器などの電気的、機械的ノイズの発生源から分離されているリグのセットアップのための部屋を選択してください。
      figure-protocol-1
      図1。 （A）記録リグセットアップの概要。実体顕微鏡（a）から（b）の参照電極ホルダー（c）の防振プラットフォーム上に搭載されているが、マイクロマニピュレーターを介して、ヘッドステージの（d）とは反対側のプラットフォームに搭載されている。ハエの調製に向け加湿空気流を送出する出口プラスチックチューブ（e）はまた、Tに搭載されているプラットフォーム彼。ヘッドステージは、PC（時間）に接続されているデジタル収集システム（DAS）から（g）に接続され、増幅器（f）は、接続されている。 （B）の電極および出口管の構成：左の参照電極は、右側の電極と、フライの準備に向け空気流出口管を記録拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
    2. 除振台またはプラットフォームの中心にマウント実体顕微鏡。
    3. 磁気スタンドを使用して、それぞれ、顕微鏡の左右に参照電極/昆虫準備とヘッドステージ/記録電極用マニピュレーターを取り付けます。
    4. チューブ開口は、フライプレップの位置の方を向いているように配向顕微鏡の後方（ 図1B参照 ）、第3マイクロマニピュレーターにマウント·出口プラスチックチューブ。
    5. で、可撓性プラスチックチューブを用いてタコメータ出口プラスチックチューブ部分的に水で満たされた真空フラスコへ。フライに向けた出口プラスチックチューブを通して加湿した空気流を発生させる、フラスコ内の水を介してバブル空気に小さな水槽のポンプを接続します。
    6. 直接調製下記のホワイトカード一枚の紙を介して光を反射させて製剤を照明するために出力を向ける振動台オフ実装光ファイバー光源。光源は、テーブル上に置かないようにしてください。注：ペーパーディスク上に光源を反射するの利点は二つある：それは視覚化する感覚器やすくなり、コントラストが向上し、直接光から生じる製剤の加熱を防止する。
    7. 供給業者のマニュアルに従ってパーソナルコンピュータにデジタル取得システム（DAS）、およびDASへのプラグtastePROBE増幅器。フットペダルトリガを電源に接続し、ワークスペースの下に配置します。注：電気的に絶縁された壁のアンプ用のソケットおよびDASは非常DESIRですでき。
    8. 電気ワニ口クリップ、絶縁電線や電気テープの長さを使用してテーブルに金属部品を接続することにより、顕微鏡、マイクロマニピュレータ、および光源を接地してください。電気的に電源プラグを介して接地される接地またはDASを構築するに接続することによって、金属プラットフォームを粉砕した。
    9. パソコン上で選択したDASのための適切な収集ソフトウェアをインストールします。注：デジタル取得ドライバーは、PC上のオペレーティングシステムと互換性があることを確認してください。
    10. ソフトウェア増幅（100×10）を構成し、信号フィルタリング、およびサンプリング·レート（少なくとも10キロヘルツ）（典型的には、ベッセルバンドパスフィルタは、100Hz-3、000ヘルツから設定）。注：味覚ニューロンからの信号振幅が0.5 mVの範囲で、典型的であるので、表示スケールは、その視覚化を容易にするように設定されている。注：100 Hzフィルタは無関係な電気ノイズを除外するのに役立つが、それはスパイクの形状を変化させ、高度なスパイクソーティング形態素を行うことができE挑戦。あるいは、1 Hzフィルタを使用することができる。
    11. 必要に応じて、ファラデーケージは、全振動テーブルの周りに設定することができます。しかしながら、アルミニウム箔の小さなシートは、通常、外部環境又は調査者によって生成されたノイズを低減するのに十分である。
  2. ガラス電極の準備
    figure-protocol-2
    図2を参照し、記録電極（A）と、基準電極に引き込まガラスキャピラリーの倍率下で破断（B）チップのない写真、及び記録電極（C）。白いバーが2ミリメートルを表しています。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
    1. リファレンスを引くピペットプラー器具を用いてガラス毛細管から電極。注：ピペットプラープログラムの正確な設定は、機器から機器へ変化します。非常に長い緩やかなテーパーを達成しよう。しかし、十分なために許可しないであろう、電極のテーパー長さの直径はいずれも薄すぎることを確認してください。先端がフライの準備（ 図2Aおよび2B）の前に切断されますので、先端の孔の大きさは重要ではない味覚神経細胞に損傷を与えたり、唾液腺を破裂できた唇弁の固定化、また大きすぎる。
    2. ピペットプラー装置を使用して、フィラメントとホウケイ酸ガラスキャピラリーからの記録電極を引き出します。参照電極に比べて浅く、テーパ、そして約10〜15ミクロン（ 図2C）28の孔径を達成しよう。
  3. 味物質のソリューションの準備
    1. ビードル - ヴィラエフルシリンガーソリューションを使用してください参照電極電解質としてのTiON（B＆E）。 B＆Eの1リットルを作るために、7.5グラムのNaCl、0.35グラムのKCl、および0.279グラムの塩化カルシウムを溶解させる2∙超純水1リットル中の2H 2 O。 -20℃で、より少量を保存する
    2. 苦味や糖GRN応答が測定される場合、記録電極電解質と味物質溶液25の溶媒として、30mMのクエン酸溶液tricholine（TCC）を使用。水セルの応答が測定される場合に代替的には、1〜3 mMの塩化カリウム溶液を用いることができる。
    3. 味物質溶液を作製するためには、粉末状で味物質の適切な量を計量し、初期ストック濃度を作るために、TCCに追加する。テストのための所望の濃度を得るために、この最初のストックから、連続希釈液を作るために使用します。注：味物質は、水に容易に溶解しない場合は、エタノールなどの他の溶媒は、初期ストック濃度を作製するために使用することができる。味物質なしのTCCと溶媒の適切な制御ソリューションこの場合に使用されるべきである。
    4. -20℃での店舗ずつ長期的味物質の化学的特性に応じて、最大で一週間使用を記録するために、4℃で味溶液の1の作業分量に保管してください。

2。 ショウジョウバエの準備

figure-protocol-3
図3。記録ハエの作製。ハエの背側胸部に参照電極の（A）の挿入位置。白矢印は、基準電極を示す。 （B）参照電極の中間位置は：首と頭を通って前進、口吻はまだ拡張されていない。 （C、D）唇弁内側電極の先端部と、口先で最終位置に参照電極とフライ完全に拡張した。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

  1. 温度と湿度が管理された条件下で増殖させた手入れの行き届いたフライ培養から記録するため、新たに孵化ハエを収集し、記録する前に、それらを新鮮な培養バイアル中の5-10日を熟成。
  2. フライを準備する前に、15〜30分間氷上で顕微鏡プレートを冷やす。
  3. このような脊髄針と1ミリリットルの注射器のような直径0.5mmの長い、薄いプラスチックの針を用いて、B＆Eの溶液を用いて埋め戻しガラス参照電極、ゆっくり気泡をタップします。ピンセットを用いてオフチップの少量を破壊し、解剖顕微鏡下で観察し、組織に残りのすべての気泡を引き出す毛細管現象を使用しています。
  4. スライドB＆気泡を導入しないように注意しながら、基準電極ホルダーのワイヤ上に基準電極をE-満たした。
  5. 吸引物は、構築されたフライアスピレーターを使用して、P200のピペットチップに飛ぶチューブ、メッシュ、およびピペットチップから、30〜60秒間、アイスバケットと寒さでの29場所。
  6. 、氷から顕微鏡プレートを取り外し水分を拭き取り、顕微鏡下に位置。優しく顕微鏡プレートにピペットチップの外に飛んでタップします。
    注意：ハエは十分に簡単に操作するために、固定化されるべきである。
  7. 鉗子の他のペアで胸部に安定を保持しながら、低倍率で、優しく、鉗子の1対の前足を削除します。背側を上に向け、その腹側にフライを置きます。注：常に機械的損傷を最小限にするための準備プロセス中にすべての回でピンセットで唇弁に触れないように注意してください。
  8. 鉗子の1対の場所にフライを保持した状態で、後部背側胸部の正中線に参照電極を挿入します。エントリの推奨角度は、ヘッド（ 図3A）の方向に約45度である。
  9. 参照electrodを確保フライは、高倍率での顕微鏡下に見えるように粘土とEホルダー。二対の鉗子を用いて基準電極ホルダーに向かってフライをスライドさせて、首と頭を介してガラス電極を操縦角度。注意：すぐにはなくスムーズに動作します。ハエがまだ冷たい（ 図3B）からの固定化されている間は、この手順を完了する方が簡単です。
  10. ガラス参照電極のさらに下に飛ぶをスライドさせながら、電極の先端が唇弁の中にあると口吻が完全に（ 図3Cおよび3D）に拡張されるまで、慎重に、鉗子の1対の口吻を拡張します。注：これは、ハエを損傷および/または神経細胞を味わい、記録品質に影響を与える可能性がある、口吻組織のどの部分に穴をあけたり、参照電極と唇弁のエッジを膨張しないように注意してください。

3。 Labellar感覚器からの​​記録

figure-protocol-4
図4。高倍率の下、右の接触のために整列記録電極を使用して左側のフライの準備のハエからの記録。（A）唇弁。 （B）は記録電極と高倍率の下で接触している唇弁上の単一感覚子は、。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

  1. 常に前に記録プロセス中の任意の機器に触れると除振台またはプラットフォームの金属面に触れて身体の静電気を！注：それは回路を損傷することができますようにヘッドステージに静電荷を提供していない非常に重要です。
  2. recordinのエアテーブルに搭載されたマイクロマニピュレータへの安全基準電極ホルダーGリグ。ビューの顕微鏡分野では、高倍率（典型的には少なくとも140X）の下で、加湿空気流に沿った唇弁の位置1のローブ。
  3. 加湿された空気流、コンピュータ、DAS、およびアンプの電源をオンにします。オープンな収集ソフトウェア。
  4. すすぎ、希望する味物質のガラス記録電極を埋める。
    1. 少なくとも10倍管を通って少量の水を引くために、シリンジ、プラスチックチューブ28を用いて超純水でガラス記録電極をリンスする。
    2. 味物質と、少なくとも5回の記録電極を洗浄します。約3分の1の味物質との中間にフル記録電極を記入し、チューブから外します。気泡が存在する場合は、リリースまたは単に電極を補充するためにタップします。
    3. 気泡を導入しないように迅速かつスムーズにヘッドステージの銀線上に電極をスライドさせます。
  5. 味物質で満たされた記録電極を持つ単一感覚子を刺激する。
    1. micromanipuを使う興味のある感覚子と整合記録電極を持ってレギュレータ。
    2. アンプの取得モードをトリガするためにフットペダルを押してください。
    3. それは感覚子と記録が開始の先端と接触するまで、慎重にマイクロマニピュレータの微調整つまみで記録電極を進める。
    4. 1〜2秒後に、電極を取り外します。
    5. 必要に応じて、他の感覚器とステップ3.5を繰り返します。注：同じ感覚子にプレゼンテーションの間に、少なくとも1分待ってください。長時間にわたって単一の味物質で録音した場合、味物質溶液が乾くこととチップ​​内の溶液をさらに濃縮さになることがあります。これは、穏やかに毛管作用によって少量の液体を除去するために滑らかな紙でガラス電極の先端を接触させることによって改善することができる。
  6. 他の味物質への応答を記録するために、新たな味物質を繰り返しステップ3.4と記録電極をすすぎ、負荷。注：徹底的に味物質間の電極を洗浄することはABSである交差汚染を避けるためにolutely不可欠。
  7. 日付、遺伝子型、および味物質等の情報を識別して、定期的にデータファイルを保存します。注意：これは、データ分析のためのセッションを記録中に味物質の記録文書や各プレゼンテーションの感覚子アイデンティティを保つことが重要です。

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結果

図5Aは 、砂糖、ショ糖がL感覚子の応答を示している。同じ感覚子は苦味化合物、ベルベリンに応答しません。 図5Bは苦い応答ニューロンが含まれているI型の感覚子は、ショ糖に反応してベルベリンに応じて、より大きな振幅スパイクと、小さな振幅のスパイクが表示されていることを示しています。私はTCCに実質的に応答します（ 図5）が表示されていない感覚器ながらLは、溶媒対照、TCCへの最小限のバックグラウンド応答を表示する感覚器。 labellar GRNsの塩と水の応答の詳細については、広井10をご参照ください。

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ディスカッション

Labellar感覚器は、形態学的および解剖学的、組織の違いに記録容易性が異なる。時には感覚子は、任意の味物質に正の応答を誘発することが知られている一つでも応答しない。これが発生する頻度は感覚子種類によって異なります。 L個の感覚器は、最も一貫して応答し、その長さのためにアクセスすることが比較的容易である。一般的には、Sの感覚器は、一​​貫して応答するが、その短い長さや唇弁上の位置は、良好な接触を難しくする。しかしながら、それらはより頻繁に無反応であり、Iは、製剤の角度に応じて、より容易にアクセスすることができる感覚器。任意のフライの準備で、私は感覚器の大部分は、LまたはS感覚器よりも応答しない場合があります。遺伝的背景は、同様に味覚応答の一貫性に影響を与えることができる。導入遺伝子は、GEに影響を与えると推定されるため、たとえば、いくつかのトランスジェニックハエは、野生型より少ない一貫した応答が表示される場合がありますハエのネラール健康。変異型ハエは特にから録音に挑戦している-私たちは、ワットことを観察した。

一つの一般的な技術的な問題は、スパイクが（ <...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

この作品は、JCに（対RD）NRSA博士号を取得する前の補助金1F31DC012985によっておよびNIHの補助金によって支えられ

私たちは便利技術的なアドバイスのための数値をコンパイルする助けのための原稿、博士ライアンヨセフに有益なコメントを博士リネアワイスに感謝し、博士フレデリックマリオン-POLLだろう。また、4のレビューの有益なコ​​メントに感謝したい。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
実体ズーム顕微鏡オリンパスSZX12 DFPLFL1.6倍 PF接眼レンズ WHN10x-H/22~150倍倍、長作動距離 テーブルマウントスタンド
防振 テーブルキネティックシステムBenchMate2210
マイクロマニピュレーター成重NMN-21
マグネティックスタンドENCOモデル #625-0930
参考電極ホルダーハーバード装置ESP/W-F10N5mlの血清ピペットに取り付けることができ、拡張範囲
シルバーワイヤーワールド精密機器AGW1510直径0.3-0.5mm
レトルトスタンドジェネリック
アウトレットプラスチックチューブジェネリック、直径1cm
のフレキシブルプラスチックチューブNalgene8000-0060VIグレード内径1/4 
500 ml コニカルフラスコ汎用、サイドアーム付き
水族館ポンプアクアティックガーデンエアポンプ 2000
光ファイバー光源Dolan-Jenner IndustriesFiber-Lite 2100
ホワイトカード/ペーパーWhatman1001-110
デジタルアクイジションシステムSyntechIDAC-4代替品: National Instruments NI-6251 
HeadstageSyntechDTP-1Tasteprobe
Tasteprobe AmplifierSyntechDTP-1Tasteprobe
Alligator ClipsGrainger1XWN7Any brand is fine 絶縁
電線汎用
金 コネクタ ピンワールド Precision Instruments5482
パソコンDellVostroデジタル集録システムおよびソフトウェアとの互換性を確認します
集録ソフトウェアSyntechAutospikeAutospike は IDAC-4 で動作します。または、LabView を NI-6251
アルミ フォイルやファラデー ケージ電磁ノイズ シールド
ホウケイ酸ガラス キャピラリーWorld Precision Instruments1B100F-4
ピペットプーラーサッター機器会社モデル P-87 フレーミング/ブラウン マイクロピペット プーラー
ビードルとエフルシ リンガー ソリューションプロトコル セクションのレシピを参照してください
クエン酸トリコリン、65% シグマT0252-100G
実体顕微鏡リンパスVMZ 1x-4x10-40倍の倍率が可能
アイスバケツ一般的な
p200ピペットチップ一般的な
脊椎針テルモSN * 2590
1mlシリンジベクトン・ディッケンソン301025
フライアスピレーターP1000ピペットチップ、柔軟なプラスチックチューブ、メッシュモデリング
粘土汎用
鉗子ファインサイエンスツールから11252-00#5SF(超微細チップ)
10mlシリンジベクトン-ディキンソン301029
プラスチックチューブタイゴンR-3603
の と組み合わせて使用します。オ組み立てられたデュモン

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