Juxtasomalビオシチン標識は、個々の皮質ニューロンの構造機能相関を研究するために、

Summary

神経回路網の構造を理解するために、個々のニューロンの機能的および形態学的特徴付けが必要である。ここで、我々はまだ、細胞内で樹状および軸索建築の事後再構築のために、ニューロンを標識する能力を維持し、細胞外の構成で電気生理学的記録を可能にするjuxtasomalビオシチンラベルを示しています。

Abstract

大脳皮質は、一緒にネットワークとしての意思決定、感覚誘導動作やメモリなど、多くの高次認知機能に関与している複数の層と、多くの異なる細胞型を特徴としている。このような複雑な神経ネットワークは、このようなタスクを実行する方法を理解するために、重要なステップは、動物は、関連する認知タスクを実行しているときに優先的に、ネットワーク内の個々の細胞型の関数（または電気的活性）を決定することである。さらに、それは逆の皮質ネットワークを設計できるように、ネットワークの解剖学的構造と個々の神経細胞の形態学的なアーキテクチャを決定することも同様に重要である。今日利用可能な技術的なブレークスルーは、記録されたニューロンを特定事後の貴重なオプションを動物に行動する、覚醒中の細胞の活動を記録可能にする。ここでは、アクション·ポテンショを記録することを含むjuxtasomalビオシチン標識法を実証らは、従来のパッチピペットを用いて細胞外（またはルーズパッチ）の構成でスパイク。 juxtasomal記録構成は、麻酔をかけ鎮静、覚醒頭固定、さらには自由に動く動物を含め、行動条件にわたって比較的安定であり、適用されます。したがって、この方法は、個々のニューロン、最終的には、全体の皮質微小回路の復興に動物の行動の間に細胞型特異的活動電位スパイクを結ぶことができます。このビデオの原稿では、juxtasomal構成内の個々のニューロンが事後同定と形態学的再構成のためのウレタン麻酔ラットでビオサイチンで標識することができる方法を示しています。

Introduction

神経回路網は、非常に特異的形態学的および生理学的特性^1-7が特徴複数の細胞型で構成されます。その結果、個々の細胞型は（例えば参照Gentet ら ⁸とBurgalossi ら ^9）は、ネットワーク内の特殊なタスクを実行します。私たちは、神経ネットワークを介して細胞種特異的な機能を理解し始めていると多くは発見されて残っている。このために、多くのラボでは、生理的パラメータが^1,10-15を得られているのと同じニューロン集団の形態学的特性の分析を可能実験的なアプローチを実施しています。ここでは、ビオシチンで記録されたニューロンのエレクトロポレーションと組み合わせて、細胞外（したがって、非侵襲的）な構成で従来のパッチピペットを用いて電気生理学的記録を必要とするjuxtasomal標識法^16,17を示しています。ザ·このアプローチの主な利点は、非侵襲的な性質は個々のニューロンの活動電位スパイク（ 例えば 、透析）細胞の細胞内含有量を変化させることなく記録されることを保証することである。エレクトロポレーションに続いて、juxtasomalアプローチは、構造（形態）にする機能（生理学）をリンクするための事後セル識別と復興のオプションを提供します。典型的には、形態学的再構成は、脊椎および/または神経繊維末端濃度の定量又は電子顕微鏡を用いてナノメートル分解能での神経形態であっても再構成に拡張することができ、樹状および軸索形態の再構成を伴う。ほとんどの研究は、マウスまたはラットのような小型げっ歯類での技術を適用しているがjuxtasomal記録技術は、皮質層を横切るまたは種の範囲内の皮質下領域における種々の細胞型のインビボでの記録のために使用することができる。我々の研究は、神経細胞を記録し、ラベルに焦点を当てていますラット一次体性感覚野（S1）から、記録したニューロン¹⁸の視覚的同定を含む、標準化された基準フレーム内の正確な位置合わせと組み合わせた樹状再建は、細胞種特異的ローカル特徴づけるために皮質ネットワーク^4,19および軸索アーキテクチャの詳細な再構築をリバースエンジニアリングする長距離投影は^20を対象と^しています。

覚醒ヘッド固定^23、あるいは自由に動く動物^9に 、別のインビボ記録技術（細胞内または全細胞）と比較して、juxtasomal録音は比較的安定であり、したがって、麻酔をかけ^21,22を含む行動状況を横切って適用することができる^、14鎮静。我々は選択の多くの製剤にこの技術の一般的な適用性を強調したがここでは、ウレタン麻酔したラットのS1でjuxtasomalラベルを示しています。

Protocol

1。動物の作製

全ての実験手順は、VU大学アムステルダム、オランダで現地の倫理委員会のオランダ法に基づいて、評価後に実施されています。

1. 腹腔内注射（0.9％のNaCl、1.6〜1.7グラム/ kgの20％）ウレタンイソフルラン（酸素2-3％）で、続いてWistar系ラット（P25-P45、♂/♀）を麻酔。ピンチ撤退、まぶた反射神経、および鼻毛の動きを監視することによって、麻酔の深さを評価する。
2. 場合には、ウレタンの追加用量（初回用量の10％）を投与する動物は、十分な麻酔の深さに達していないか、鼻毛単収縮は、実験の過程の間に観察されるときはいつでも。
3. 加熱パッドを装備した定位フレームに麻酔をかけた動物を置き、直腸温度プローブを挿入し、加熱パッドにより37.5±0.5℃で、動物の体温を維持。
4. 定位フレームに動物の頭を置き、目に見える肌をレンダリングするためにハサミを使って頭の上に毛をトリミング。
5. 作業現場での局所麻酔用皮下（0.9％NaCl中）を100μlの1％リドカインを注入し、3〜5分待ちます。尾側から頭側方向に切断することにより、頭蓋骨の表面を覆う皮膚を除去し、残りの組織を清掃してください。
6. 0.9％NaClおよび吸収性綿棒で広範囲頭蓋骨を清掃します。
7. （：2.5ミリメートルの後部とブレグマ横5.5ミリメートル、一次体性感覚野（S1）の場合）左半球上のターゲット領域の座標を決定。外科皮膚マーカーペンで頭蓋骨上の位置をマークします。
8. 骨が透明になり、血管がはっきりと見えるようになるまで、関心領域から歯科用ドリルでそっと骨を削り取る。
9. 硬膜への損傷を回避し、外科用メス（＃11）を用いて薄くなった頭蓋骨切断窓、0.5ミリメートル×0.5ミリメートルの開頭術を行うや血管。オプション：可視性を向上させるために外科皮膚マーカーペンを使用して開頭のエッジをマークします。
10. 開頭術を囲む浴（ すなわち録音室）を構築するために、乾燥頭蓋骨、その後歯科用セメントに瞬間接着剤の薄層を適用します。
11. ウィスカ包から正確に5ミリメートルに反対側のウィスカートリム。オプション：黒マスカラでトリミングウィスカーを強調表示します。

2。 Juxtasomal記録とビオシチンラベリング

1. 3-5MΩ抵抗を有する電極を得るために、〜1μmの内側先端径とホウケイ酸ガラスのパッチピペットを作る。注：juxtasomal記録のための理想的なピペット形態は徐々に細いテーパ、低円錐角、および約1μmの先端（ 図1）。
2. （軟膜表面に対して）、記録深さに応じて、記録電極のテーパー寸法が調整されるべきである。非常に重要なことtがある彼は、直径が記録領域への機械的な損傷やストレスを避けるために、脳内のエントリーの時点で75μm未満である必要があり先細り。比較的深い皮質層からの記録は最大外で再び、1,500-1,800程度の長いテーパーを必要とするのに対し、これは表面的な皮質記録のために、最大限に75μmの外径が300〜500程度のテーパーが（ 図1A）が必要であることを示しています（電極先端から1800程度で）75μmの直径。
3. 2％ビオシチンを補足し、正常なラットリンガー（NRR）でパッチピペットをロード（ソリューションおよび試薬については表1を参照）、マイクロマニピュレータに固定されたヘッドステージにパッチピペットをマウントします。
4. 特にラットS1のD2の列をターゲットに矢状面に対して34°の電極ホルダーの角度を設定します。
5. ブリッジモード（電流クランプ）内のアンプにヘッドステージを接続します。
6. パッチを配置します開頭に近接してピペット。 0.9％NaClで風呂に記入し、正の電流注入（1 nAの、オン/オフ200ミリ秒）で正方形のパルスを印加することによって評価MΩ、3〜5の間であるべきである電極抵抗を決定する。
7. 矩形パルス（1 nAの、オン/オフ200ミリ秒）などの正の電流を印加しながら、100〜150ミリバールの過圧を確立し、1ミクロンのステップでパッチピペットを進める。硬膜との接触を確立すると堅牢な抵抗変化を監視します。この時点で、正確な深さ測定を可能にするために 'ゼロ'にマイクロマニピュレータの座標を設定する。
8. パッチピペットは、電極抵抗の急激な低下によって示さ硬膜を貫通するまで、1ミクロン、ステップ·モードで進める。ピペットの保持圧力を取り除く。
9. 1以下の手順で進めながら、単一のユニットを検索します。オン/オフのパルスに200ミリ秒を適用することにより、継続的に電極抵抗を監視します。電極抵抗のtypicの増加同盟国は、単一のニューロンの近接性を示している。正の活動電位（AP）〜2 mVの波形が（ 図2Aおよび図2B）が記録されるまで、電極を進める。
10. オプション：ニューロンの自発的なスパイクパターンを記録し、ウィスカ誘発尾側の圧電素子^18を使用して3.3°の角度で200ミリ、個々のウィスカーを偏向、たとえばによるスパイクを決める。
11. 抵抗値が25〜35MΩで、スパイクはjuxtasomal充填の最適な条件を得るために3-8 mVの振幅を持つまで、電極を進める。正の電流（1 nAの、オン/オフ200ミリ）の矩形パルスを印加することにより、juxtasomal充填を開始します。 AP波形と周波数（ 図2Aおよび2B）を監視しながら、ゆっくりと徐々に0.1 nAのステップで電流を増加させる。
12. ブロックパルス（ 図2Cのオンフェーズ中にAPの頻度が明らかに増加のような膜の開口部を監視する）。充填時のスパイク波形が増加幅と縮小後の過分極（ 図2Cおよび2D）を示している。追加のパラメータが増加し、ノイズや小さな（1-5 MV）負のDCシフトが含まれています。
13. 安定したビオシチン注入を維持するために充填しながら、現在の（1 NA）を増加または減少。例えば、ナトリウムイオンなどの細胞外イオンの過剰流入によって毒性を回避するために、APの周波数の急激な増加に応じた電流パルスを減らすか、または停止します。注：すべてのニューロンが標識化パラメータは、個々の記録条件に応じて調整する必要が電流注入とjuxtasomalに対して異なって応答する。
14. 密接に電流注入を停止した後の信号を監視します。充填セッションの後のスパイク波形は通常広がり、強く過分極後に減少を示している。スパイク波形が（元の特性のために、すなわち存在を返したときに明らかであるニューロンの回復を待つ通常のアフター過分極、 図2）。
15. 改善された染色の品質のためビオシチン負荷が増大するため、ニューロンの完全な回復の後にセッションを充填ビオサイチン繰り返します。
16. スパイク振幅が細胞に機械的なストレスを減少させるために低下するまで1μmの段階でパッチピペットを後退させる。密接に動物の体温や呼吸を監視しながら、細胞内に拡散するビオサイチンために少なくとも1時間待ってください。

3。動物を灌流し、脳を削除する

1. 灌流セットアップを準備し、すすぎ、0.9％NaClでチューブをプリロード。
2. 外科トレイに動物を置き、標準ラベルテープで固定します。麻酔の十分な深さを確保するため、足のピンチとまぶたの反射神経は存在しなければなりません。
3. ただ胸郭の下の腹壁を通して切開（大人5〜6センチ）、横方向及び胸骨を露出させ、後方、前方方向に進行するように内側を作る。前方胸骨を引っ張り、慎重に横隔膜から肝臓を分離する。
4. 横隔膜の小さな切開を行い、下肋骨を切断し、心臓を露出さ腹腔の全長に沿って切開を続ける。
5. 心膜を取り除く。
6. 左心室に針を挿入し、右心房の切開部を作る。肝臓の脱色が完了するまでに、0.9％NaCl（約8 ml /分）で灌流する。
7. 足前部の剛性まで、4％パラホルムアルデヒド（PFA）に注入を切り替えて、下顎が明らかである。
8. ハサミを用いてラットの首を切る
9. 残りの首の筋肉を外し、完全に頭蓋骨を公開します。
10. 背側の脳幹内のはさみを置き、背位を維持し、矢状縫合糸に沿って丁寧に骨を切った。
11. 鉗子を用いて脳を露出するように矢状縫合の両側から骨を除去します。慎重にDを避けるために硬膜を削除amage。
12. 慎重に脳の腹側に鈍いへらを差し込んで、静かに脳を取り出します。
13. 4℃のPFA中脳全体の一夜をポスト修正4℃での0.05 Mリン酸緩衝液（PB）およびストアに脳を切り替える

4。タンジェンシャルセクションで脳をスライスする

1. 0.05 M PBから脳を取り、前方に直面したろ紙の上に置く。前頭面に沿って、小脳を遮断し、ミッド矢状平面で切断して半球を分離するために鋭利なカミソリの刃を使用してください。
2. 取り付けプラットフォームに瞬間接着剤を適用し、前方右に向けて、その矢状面上の左半球をマウントします。ビブラトーム上45°の角度で取り付け作業台を固定し、0.05 M PB中の脳を沈める。
3. ビブラにカミソリの刃を固定し、脳表面との最初の接触は、半球の前後面の真ん中にあることを確認してください。 24は100μmを切るセクション0.05 M PBを含有する24ウェルプレート中でそれらを収集する。

5。組織学的手順

1. 以前に記載された方法²⁵に従って、チトクロームオキシダーゼ染色²⁴とアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ法についての組織学的なプロトコルを実行します。オプション：蛍光アビジン/ストレプトアビジン-Alexaの複合体を用いてビオサイチン視覚化。これは、さらに逆行または順行レーシング技術で二重染色することができます。
2. S1の層4で樽を視覚化するチトクロームオキシダーゼ染色（L4）のための洗浄、0.05M PBでのセクション5×5分と3、3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（DAB）を調製含有溶液（溶液については表2を参照してくださいと試薬）。 37℃で30〜45分間予熱した溶液中のPIAからのセクション6-12インキュベート
3. 6×5分間、0.05 M PBで切片をすすぎ、3％H ₂内のすべてのセクションをインキュベートすることにより内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチ O _2。
4. 5×10分間、0.05M PBでのセクションを洗浄します。 4℃で一晩（溶液および試薬については表3を参照）、ABC-溶液中でのセクションをインキュベート
5. （溶液および試薬については表4を参照）5×10分間、0.05M PBでのセクションをすすぎ、ビオシチンで満たされたニューロンを可視化するために、DAB-溶液を調製する。室温で45〜60分間ろ過した溶液中でのセクションをインキュベートする。
6. 5×10分間、0.05M PBでのセクションを洗浄します。のMowiolと顕微鏡スライドとカバーガラスのマウント部分（ソリューションおよび試薬については、表5を参照）。
7. 光学顕微鏡を用いてラベルの品質を決定する。

Results

個々のニューロンの三次元構造に関する詳細な知識は、神経ネットワークの組織的な原則を解明するために重要です。我々の方法は、それによって、 事後のニューロンの分類及び樹状と高解像度での単一ニューロンの軸索アーキテクチャの詳細な再構築を可能にする、in vivoでの準備から、高品質のビオシチンラベルを達成するためのパイプラインが含まれます。 juxtasomalラベルの品質に応じて、神経細胞はかすかから非常に正確に記録位置^19,26に対応する位置に強烈なDAB信号の範囲の異なるDAB-強度で回収される。私たちの研究室では、訓練された実験者は、ウレタン麻酔げっ歯類30〜40％で成功率で動作します。 、脳内に満たされた1）のみ1ニューロン、2）優れたラベル品質：これは1ニューロンは3次の基準を満たしている実験のうち1樹状および軸索再生のために選択されていることを示し3）ビオシチン信号が軸索投射に沿って一定であると遠位語尾に減少しない、4）のCyt C対比は、ニューロンの登録、および組織中の脳のスライスに5）損傷なしを許可するように成功している。制限要因は、すべての実験（麻酔および/または起...

Discussion

juxtasomal方法はビオシチン標識し事後細胞型の分類および/ ​​または3D再構成のための記録されたニューロンをするオプション（麻酔をかけ、目を覚ましヘッド固定または自由行動）行動条件にわたって、単一のユニットから生体内の活動電位スパイクの記録ができます。主な利点は、細胞外（従って、非侵襲的）構成における生理学的パラメータを得ることで、まだ、ビオシチン^16,17,32と細胞内のニューロンを標識することができる。ビオシチン標識に加えて、この技術は、DNA、RNA、タンパク質、または蛍光色素^33,34を有するニューロンを注入するために使用することができる。このアプローチの最も明らかな欠点は、おそらく標識品質の視覚的制御の欠如、したがって、実験中の標識の品質をチェックするのno手段である。しかし、記録条件、特に、活動電位の形状は、標識手順の成功を評価するために使用することができる。不安定のため電流パルスの間のスパイク頻度が劇的に増加するとNCE、密なビオシチン-DABラベルでニューロンを回復する可能性は後の過分極と活動電位波形の広がり（ ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SM-6 制御システム	Luigs Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 マニピュレーターブロック X2
Lynx-8 アンプ	Neuralynx
Axoclamp-2B アンプ	Axon Instruments
長田モデル EXL-M40	長田
圧電デバイス	Physik Instrumente	PL140.10
LabView	National Instruments, Austin, TX, USA		LabView取得ソフトウェア
Ntrode Virtual Instrument	R.ブルーノ、コロンビア大学、ニューヨーク
スギ吸収剤スワブ	ケッテンバッハ	30601
馬の心臓からのシトクロムC	シグマ	C2506
ウシの肝臓からのカタラーゼ	シグマ	C9322
DAB	シグマ	D5637
H2O2	Boom	7047
ベクタステイン標準ABCキット	ベクトル	PK6100
トリトンX100	シグマ	T9284
レタン	シグマ	U2500
イソフルラン	Pharmachemie	45.112.110
ドカイン	シグマ	L5647
プレックス急速歯科用セメント	Kemdent	ACR308 / ACR924
バイオシチン	モレクラ	36219518
PFA	メルク ミリポア	8187151000
トリズマ ベース	シグマ	T4661
モヴィオール 4-88	アルドリッチ	81381
分析グレード グリセロール	フルカ	49767
HEPES	シグマ	H3375
NaCl	シグマ アルドリッチ	31434
KCl	Sigma Aldrich	60130
CaCl	Sigma Aldrich	22,350-6
MgCl2	Fluka	63072