C型肝炎ウイルスの複製を分析するためのプロトコル

Summary

C型肝炎ウイルス(HCV)は、肝硬変や癌を含む肝障害を引き起こす主要なヒト病原体です。HCV感染性細胞培養システムは、HCV複製の分子メカニズムを理解し、新しい治療法を開発するために不可欠です。ここでは、HCV複製サイクルのさまざまな段階を調査するためのプロトコルについて説明します。

Abstract

C型肝炎ウイルス（HCV）は、世界の人口の3％に影響を及ぼし、慢性肝炎、肝硬変、および肝細胞癌を含む重篤な肝疾患を引き起こす。 HCVは、 フラビウイルス科に属するエンベロープRNAウイルスである。現在の治療は、十分に有効ではなく、有害な副作用を引き起こす。利用可能なHCVワクチンはありません。このように、継続的な努力は、ワクチン、より良い治療法を開発するために必要です。 HCV細胞培養系は、ウイルスの侵入、ゲノム複製、パッケージング、および出口を含むHCV増殖の様々な段階を研究するために重要である。提示現在の手順では、野生型intragenotype 2aのキメラウイルス、FNX-HCV、およびウイルス複製を研究するために、 ウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子を担持する組換えFNX-Rlucをウイルスを使用した。ヒト肝癌細胞株（ホ-7ベースの） インビトロでのトランスフェクションのために使用したのHCVゲノムRNAを転写した。無細胞培養上清を、タンパク質溶解物およびtotal RNAは、HCVの増殖を評価するために、トランスフェクション後様々な時点で採取した。 HCVゲノムの複製の状態は、定量的RT-PCRおよびHCVの存在を可視化する二本鎖RNAにより評価した。 HCVタンパク質の発現は、HCV NS3およびNS5Aタンパク質に特異的な抗体を用いてウェスタンブロットおよび免疫蛍光アッセイによって確認した。培養上清およびウイルス力価に感染性HCV粒子を放出するRNAトランスフェクトされた細胞を測定した。ルシフェラーゼレポーターアッセイはHCVの複製レベルと感染性を評価するために利用した。結論として、我々は、HCVの複製サイクルの異なる段階を特徴付けるための種々のウイルス学的アッセイ法を提示する。

Introduction

C型肝炎ウイルス（HCV）は、肝硬変および肝臓癌を引き起こす。それは35万人が毎年^1-3死んで全世界1.7億人々に影響を与えます。 HCVは、9.6kbのゲノムサイズを有するプラス鎖RNAウイルスである。 HCVゲノムは、タンパク質分解的に10ポリペプチドに様々な細胞およびウイルスのプロテアーゼによって切断され〜3,000アミノ酸残基の単一ポリタンパク質として翻訳される。 HCVはヘパシウイルス属に原型ウイルスで、 フラビウイルス科 ⁴に属しています。暴露されると、HCVは、個人の80％に慢性感染を確立します。感染は、診断が肝劣化を防止する治療的介入を可能にすることができる主に無症候性かつタイムリーである。現在の治療は、部分最適で、ワクチンは^5,6ありません。

C型肝炎の病因は1989年⁷に記載した。HCVの複製を研究するC型肝炎ワクチンおよび治療 ​​の研究のために重要であるが、それがあった長い効率的なウイルス培養系の欠如によって妨げ。 HCVの分子クローンは、肝内接種⁸時チンパンジーにおける感染であることが示された。続いて、HCVサブゲノムレプリコンは、細胞培養系^9,10におけるウイルスゲノムの複製段階を分析させ、これについて説明した。遺伝子型2aのHCVの発見は、JFH-1（日本劇症肝炎-1）を単離、細胞培養に感染する....

Protocol

プロトコルの概要を図1に示されている。

1。細胞

1. 10〜15％ウシ胎児血清（FBS）、10 mMの非必​​須アミノ酸、10mMのHepes、ペニシリン（100単位/ ml）、ストレプトマイシン（100 mg / ml）を、および2mM L-グルタミンを含有する完全増殖培地を調製する。
2. C型肝炎ウイルスの複製サイクルのインビトロ分析のための上記のサプリメントを含む完全な増殖培地中でホ- 7.5.1細胞の^13を維持する。
3. 5％のCO _2、37℃で指定された補足の増殖培地とホ- 7.5.1細胞で培養したウイルス株。

2ウイルスやプラスミド構築

1. HCV RNAの相補DNA（cDNA）の形態を生成し、遺伝子操作を容易にするためのプラスミドベクターにクローニングする。注：日本の劇症肝炎1の発見は、JFH-1（遺伝子型2aのHCV）、HCVの研究のための批判的とされている単離主にHCVの複製サイクル^{11から13を}研究するために使用。 JFH-1のHCVに基づく間およびintragenotypicキメラウイルスは、一般的に、研究^14〜18で使用されています。合成intragenotype 2aのキメラウイ....

Results

C型肝炎ウイルスはRNAウイルスである。このように遺伝子操作の目的のために、HCVゲノムcDNAを、細菌プラスミドベクターにクローニングされている。 T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列は、HCVゲノムの5 '末端の直前に導入した。 HCV分析ワークフローの概要を図1に示す。正確な3 '末端とHCVゲノムRNAを生成するために、プラスミドを含むHCVゲノムは、XbaI制限酵素で切断され生成した一本鎖オーバーハングは、マングビーンヌクレアーゼ消化で平滑化した。線形化されたHCVプラスミドの品質は、アガロースゲル電気泳動（ 図2B）により評価した。 HCV DNAは、インビトロ転写により媒介されるT7 RNAポリメラーゼを施し、得られたRNAは、9.6キロベース（ 図2C）で単一の生成物を得た。

我々はintragenotype 2aは、HCV（ 図の成長速度をテスト60、3）。許-7.5.1細胞は、野生型（W.......

Discussion

この図は、C型肝炎ウイルス複製サイクルを分析するための方法を記載している。 HCVはヒトの病原体であり、所定の生物学的安全性プロトコルは、必ず守っていただきます。感染性HCV細胞培養系は、以前に^11-13,16,17記載されている。示されたプロトコルを以下のときに我々が実装し、いくつかの重要なポイントがあります。まず、下流の研究のために無傷の完全長ウイルスゲノムRNAの良好な品質を有することが非常に重要である。ウイルスcDNAを運んで入力プラスミドを直線化し、慎重に平滑化する必要があります。のXba Iオーバーハングを鈍らするために採用緑豆ヌクレアーゼは、非特異的なヌクレアーゼで、長時間のインキュベーションは、ウイルスゲノムの3 '末端の損傷や劣化が発生します。ヌクレアーゼは、フェノール - クロロホルム抽出、または陰イオン交換カラム精製によって指定された30分間のインキュベーションの直後に除去されなければならない。ヌクレアーゼ処理したDNAのゲル抽出のように、推奨されない場合があります酵素は、ゲル電気泳動プロセスの間アクティブである。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ダルベッコ修正されたイーグル」Fisher	Scientific	10-017-CV
非必須アミノ酸	Fisher Scientific	MT25025CI
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red	Life Technologies	11058-021
Huh-7.5.1	スクリプス研究所		細胞株は、フランシス・チサリ博士からアルムガスワミ博士に提供され、スクリプス研究所とシダーズ・サイナイ医療センター・
プラスミド(pFNX-HCV、pFNX-HCV Pol null、pFNX-Rluc、pFNX-Rluc Pol null)	シダーズ・サイナイ医療センター		HCVプラスミドは、アルムガスワミ博士によってオーバーラップするオリゴヌクレオチドを用いて合成されました。
XbaI	ニューイングランドバイオラボ株式会社	R0145S
緑豆ヌクレアーゼ	New England Biolabs Inc.	M0250S
T7 RiboMAX Express 大規模 RNA 生産システム	Promega	P1320
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
エレクトロポレーションキュベット (4 mm)	Bioexpress	E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System	Bio-Rad	165-2660
マウスモノクローナル抗dsRNA抗体J2	日本語 &サイエンティフィックコンサルティングKft.
ヤギ抗ウサギ IgG アレクサ フルーア 488	ライフテクノロジー	ズ A11008
ヤギ抗ウサギ IgG アレクサフロー 594	ライフテクノロジー	ズ A11020
PVDF メンブレンパッケージ	バイオ・ラッド	162-0263
ブロッティンググレードブロッカー ノンファット ドライミルク	バイオ・ラッド	170-6404XTU
Tween-20	バイオ・ラッド	170-6531XTU
抗 C 型肝炎ウイルス NS3 抗体 [8 G-2]	Abcam	ab65407
抗 C 型肝炎ウイルス NS3 抗体 [H23]	Abcam	ab13830
ヤギ抗マウス IgG と西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) を結合	ジャクソン免疫研究所	115-035-003
アマシャムECLプライムウェスタンブロッティング検出試薬	GEヘルスケアライフサイエンス	RPN2236
SUPERSCRIPT III RT	ライフテクノロジー	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX ROX 付き	ライフテクノロジー
ViiA 7 リアルタイム PCR システム	ライフテクノロジー	ズ NA
レニラ ルシフェラーゼアッセイ システムキット	プロメガ	E2810
RNase-フリー DNase	プロメガ	M6101
GloMax-マルチ検出システム (ルミノメーター)	プロメガ