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方法論記事

の組織化学的染色

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DOI:

10.3791/51381

⸱

2014年5月13日

 , 
1Feedstocks Division, Joint Bioenergy Institute, 2Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

この記事について

サマリー

植物細胞壁の組成は組織タイプによって異なり、リグニン、セルロース、ヘミセルロース、ペクチンを含むことができます。細胞種レベルでの違いを可視化するために、さまざまな染色技術が開発されてきました。この論文は、一般的に使用される細胞壁染色技術をまとめ

たものです。

要約

シロイヌナズナは、植物のさまざまな細胞プロセスを理解し操作するために一般的に使用されるモデル生物であり、二次細胞壁形成の研究に広く使用されてきました。二次細胞壁の堆積は、一次細胞壁が敷設された後に発生し、これは血管組織や繊維組織を形成する細胞などの特殊な細胞によってのみ実行されるプロセスです。ほとんどの二次細胞壁は、セルロース(40〜50%)、ヘミセルロース(25〜30%)、およびリグニン(20〜30%)で構成されています。二次細胞壁生合成に影響を与えるいくつかの突然変異が単離されており、対応する変異体は、これらの突然変異が代償性応答によって隠される可能性があるため、明らかな生化学的組成の変化または視覚表現型を示す場合と示さない場合があります。染色手順は、歴史的に細胞ベースで違いを示すために使用されてきました。これらの方法は、分析の視覚的な手段のみです。それにもかかわらず、迅速かつ批判的な分析における彼らの役割は非常に重要です。コンゴレッドとカルコフルオロホワイトは多糖類の検出に使用される染色剤ですが、モイレとフロログルシノールはリグニンの違いを決定するために一般的に使用され、トルイジンブルーOは多糖類とリグニンの鑑別染色に使用されます。切片作製、染色、イメージングという一見単純な技術は、初心者にとっては難しいものです。この研究では、A. thalianaモデルを使用したサンプル調製から始めて、植物の二次細胞壁における細胞および組織組織の観察のために簡単に実施できるさまざまな染色方法のプロトコルについて詳しく説明します。

概要

リグニン、セルロース、ヘミセルロース（キシラン、グルクロノキシラン、キシログルカン、アラビノキシラン、混合連鎖グルカン、またはグルコマンナン）、およびペクチン：植物細胞壁は、その様々な構成要素内の情報の過多を保持している。組織学的技術は、組織および細胞レベルでの二次細胞壁の中の違いを研究する上で重要な視覚的な手がかりを提供する。様々な組織学的技術が開発されており、文献に記載されていますが、これまでに利用可能な場合、単純な視覚的な指示に非常に詳細なプロトコルはめったにないため、これらの技術は、初心者のために挑戦し、時間がかかる場合があります。本研究の目的は、高品質の画像を得るために組織学的染色技術のための簡単​​なガイドラインを提供することである。

茎組織を区画すると、細胞壁と細胞形状の可視化の最初のステップです。ハンドカットのセクションでは、安価であり、準備する時間がかからないが、ビブラトームを使用すると、一貫性を提供し、高品質の画像が得られる。ビブラトームを使用すると、シャープな画像を生成するのに役立ち、著しく単純悪い試料調製に起因するサンプル間の不正確な差を生成するリスクを低減し、同じ厚さであってもセクションを生成することにより、より良好なデータ品質を製造することができる。新鮮な標本を修正するために樹脂を使用すると、初心者のための挑戦することができますし、分析を迅速に行う必要があるときもまだ専門家のために、時間がかかる場合があります。また、それは、樹脂中に埋め込まれたときに試料に任意の生物学的活性を測定することができなくなる。アガロース及び自家製の金型を用いたOne簡単な手法は、幹組織を包埋するのに役立ち、それはまた、軟組織の切開を必要とする他の用途に利用することができる。樹脂中に包埋標本を比較すると、この方法は、生きている組織を維持し、サンプル操作を低減するという利点を有する。ビブラトームを経由して組織を切片化することは、非常に正確であるとhomogenを生成研究の目的に応じて、組織単位（OU）のセクションでは、次に、いくつかの異なる染色技術と共に使用することができる。

リグニンおよび他の芳香族化合物を可視化するための最も簡単な方法は、紫外線（UV）光を使用する。 UV光による芳香族系分子の励起は古い技術であるが、それはまだリグニンの可視化のための最速の方法の一つです。 UV光は、他の芳香族化合物を励起するので、UV可視化は、実際にはリグニンを検出するための理想的ではない。 1-3：リグニンは、主に以下の3つのビルディングブロック、モノリグノール（コニフェリルアルコール、シナピルアルコール、およびp-クマリルアルコールhydroxycinnamylアルコール）で構成されている。フロログルシノール染色は木部に存在シンナムアルデヒド、繊維、および気管組織4の範囲で手がかりを提供することができます。フロログルシノールは、一般的なシンナムアルデヒドの良好な指標であり、シンナムアルデヒド、その他の芳香族化合物を区別することができます。シナピルアルコールモノマーは検出することができるとマウレ染色を使用して分化した。トルイジンブルーO多色性染料であり、したがって異なる色5,6における細胞壁の異なる要素を染色する能力を有する。トルイジンブルーOの主な用途は、ペクチンとリグニン5,6を検出することである。トルイジンブルーOを使用する利点は、細胞壁の多くの要素は、単一のステップで可視化することができることである。カルコフロールホワイトおよびコンゴーレッドの両方を作成すると処理が容易であり、セルロースを可視化するために使用することができる。 ·ホワイト汚れセルロース、カロース、および他の非置換または弱置換されたβ-グルカン6-9、コンゴレッド汚れが直接、特に10,11-β（1→4） -グルカンとセルロースにするのに対し。この研究の目的は、A.より高品質の画像を得るために、前述の染色技術を使用するための簡単なガイドラインを提供することであるシロイヌナズナの茎 。

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プロトコル

1。埋め込みステム

  1. 水中の0.7％アガロース溶液（蒸留水100ml中の電気泳動グレードアガロース7 g）を作る。 20分間、または最低強度（ 例えば 、1250ワットのマイクロ波を10％の強度）で20分間マイクロ波処理することによりオートクレーブでアガロースを溶解する。
  2. プラスチックバイアルを使用した茎埋め込むための手作りの金型を準備します。
    1. カミソリの刃を使用して、2ミリリットルスクリューキャップマイクロチューブ（A部）の円錐底を切り落とした。注射針と、埋め込むべき幹の直径よりも僅かに大きいチューブキャップに穴を穿刺する。次に、0.6ミリリットルのマイクロ遠心チューブ（パートB）の下部から0.5cmにカット。
    2. プレカット2ミリリットルの微量遠心チューブに0.6ミリリットルマイクロチューブのカットオフ0.5センチメートル部分を追加します。パラフィルム（ 図1）を使用して、二つの部分を密封する。注意：チューブの底部は、アガロースが固化した後に埋め込まれたサンプルの除去を容易にするために切断される。 T彼は、キャップの穴は茎をアガロースに埋め込まれている場合、安定ステムを保持するのに役立ちます。金型は、アガロースを保持し、埋め込む際に、ステムストレートを保持するのに役立つでしょう。アガロースが設定され、ステムが埋め込まれるまで、パラフィルムは、二つの部分A及びBを保持する。
    3. カミソリの刃を使用して、関心領域（第1の幹節間の例えば中央）からステム部をカット。注：理想的には、茎はちょうど脱水による破壊を避けるために埋め込む前に切断する必要があります。あるいは、ステムは、一時的に水で湿らせた濾紙を含むプレートに格納することができる。このプレートは、組織の脱水や変形を防止するために埋め込まれる準備ができるまで氷上に配置することができる。高水分のない30分よりも長い期間、ステムを格納すると、茎が乾燥させます。
  3. 低強度で電子レンジでアガロースを溶かす。注意：アガロースを含むボトルが高温になる場合があります。ボトルを拾うためにミットを使用しています。溶けたアガロースSをしましょう（20°Cと25°Cの間）室温でTANDは、約50℃に冷えるまで
  4. ゆっくりバイアルを充填する既成のプラスチック金型にアガロースを5mlピペット。注：確かに、金型内に気泡がないことを確認します。気泡がアガロース金型内でのギャップの原因となりますし、完全に、最終的には、サンプルのセクションの不均一な切断につながる幹のサンプルを、カバーしていません。
    1. アガロースは半固体になるための30から60秒間クールダウンしましょう​​。それが浸透し、アガロース中で、浮い立ち上がるが、できないことを確認しながら、小さな爪楊枝でテストします。注：ステムが配置されている場合は、アガロースがまだ熱いときには、細胞形態を破壊し、ステムをshrivelingすることにより、試料を損傷します。
    2. このアガロースに満ちたバイアル中で茎を配置します。茎がまっすぐに留まることを確認してください。茎の先端がキャップによって保持されるように穴のあいたキャップを置きます。ねじ式キャップを回転させないでください。いつか（一種類の）複数の幹がembeすることができます単一バイアルにdded;が、その特定のケースでは、キャップを使用しないでください。注：ねじ式キャップがオンになっている場合、幹がねじれてしまいます。
  5. それが凝固するまで、10から30分間、室温または4℃でバイアルのままにしておきます。
  6. 優しくチューブの外にスライドさせて、金型を削除します。パラフィルムを開きます。ガラス顕微鏡スライド上にパートAから固化したアガロースを解放するために親指で軽く金型のパートBの下を押してください。
  7. 長さ1.2センチ3ほぼ等しいピースにアガロース埋め込ま茎を切った。アガロースではなかった茎の部分を切り取って、それを捨てる。
    1. 埋め込まれたアガロース、これらの情報を格納するセクションへの準備が整うまで4℃での暗箱に気密2ミリリットルの微量遠心チューブに由来する。代わりに、1週間に最大4℃でチューブを保管してください。注：ストレージは可能ですが、実験者は、組み込み茎がまだ生きていると、実験に依存ことに注意する必要があります、成果物は潜在的に導入することができる。

2。セクステム

  1. 注意：慎重にビブラトームマニュアルを読み、すべての安全手順に従ってください。
  2. 試料ディスクを（任意の固体または液体の自由）清潔で完全に乾燥していることを確認します。実験前から残留接着剤を除去し、水で洗浄するかみそりの刃で試料ディスクをクリーニングします。その後、紙タオルで乾燥させます。注：これは、接着剤がうまく機能し、アガロース片に結合することが保証されます。この工程が適切に行われない場合には、試料は、ディスクに付着しない可能性があり、保存試料を切片中にディスクから落下させることが可能である。
    1. 柔らかい紙は検体を含むアガロースブ​​ロックから任意の水分を除去するワイプを使用します。
    2. 試料ディスク上の組織接着剤の小滴を配置します。ストリーク接着剤ボトルの先端を用いてプレートの中央にある領域をカバーするための接着剤が不足しています。迅速場所アガロースブ​​ロック試験片は、それぞれに対して垂直または横方向または縦方向の断面用プレートと平行になるようにのいずれかである。接着剤は10から30分間、室温または4℃での試料ディスクにサンプルを固定することができます。注：これは時間に敏感なステップである。
  3. バッファトレイまたはトラフ上の所定の位置に試料ディスクを固定します。セクションを持つアガロースブ​​ロック/ Sは、かみそりの刃と平行になる必要があります。サンプルが完全に水没するまで室温で蒸留水を用いてバッファトレイを埋める。
  4. 半分にカミソリの刃を切断し、ブレードが完全に平らに留まるように頑丈なハサミで端をトリミングします。ナイフホルダーにプレカットカミソリの刃の2分の1を取り付けます。
    1. 50ヘルツ（ビブラトーム上の位置5）に0.90ミリメートル/秒（ビブラトーム上の位置8）と周波数を、84℃にナイフホルダーの速度を角度を設定。 100ミクロンの厚さの部分をカット。連続モードを使用してください。 NOTE：この厚さは組織染色プロトコルのいくつかで使用される様々な酸および塩基の治療に耐えることができることを確実にするために選択した。切片化のためのウィンドウを設定し、セクションにビブラトーム約1.2センチアガロースブ​​ロックのための連続モードで15〜20分を許可する。
  5. バッファトレイに切片中に使い捨てのプラスチックピペットを用いてのセクションを収集します。代替的に、切片をガラスビーカーにバッファトレイから転送され、透明なペトリ皿にすることができる。 2.0ミリリットルのマイクロ遠心管にいくつかのセクションを転送します。注：それは、透明な背景のセクションを見ることが容易であるため、バッファトレイは次の検体のために準備することができるので、試験片をペトリ皿から収集されます。
  6. 切片は、30〜60分間、4℃で50mlチューブに格納したり、回収し、1.5〜2ミリリットルの微量遠心管に記憶することができる。注：長期間のセクションを格納すると、低画質になります。

イメージングのための設定3。顕微鏡とカメラ

  1. 顕微鏡でのケーラー照明を調整します。目的を選択してください。最初の試料に焦点を当てています。半分以下に光強度をもたらす。視野絞り（FD）と絞り（AP）を閉じるか、その特定の目的に可能な限り低い設定にそれを持って来る。
    1. 倍率が高いほど、より大きなリングになります。として急速に可能な限りフィールドアイリスを集中するコンデンサー焦点ノブを使用しています。
    2. ゆっくりとコンデンサーセンタリングノブ（コンデンサーを取り巻くピン形状のネジ）を使用して、中央にフィールドアイリス（六角形の小さなリング）のイメージを持って来る。ゆっくりとフィールドアイリスがエッジに到達したことを、振動板（FD）は、このような増加。フィールドアイリスがエッジを通過した直後のFDを増やす停止します。
    3. ゆっくりとコントラストを調整し、開口（AP）を増やします。必要に応じて光の強度を調整します。 NOTE：ケーラー照明は、すべてのoには調整される必要があるbjective、すべての実験日。その日のために調整した後に得られる数値に注意してください。これらの数字は、目的は、その特定の日の前後に切り替えられるたびに再利用されます。
  2. アパーチャ、強度、露光時間、ゲイン、 表1に記載したようにフィルタを調整し、この情報は、あくまでも目安として使用されるべきである。
  3. 蛍光画像をキャプチャするために機械的なシャッターを大判インターラインCCDチップで高解像度のデジタルカメラを使用してください。明視野画像の高解像度、高速カメラ。
  4. 標準的なソフトウェアを使用してスライドを処理します。ソフトウェアをロードします。 「取得」をクリックして "設定したカメラ/ボード」をして、使用するカメラを選択します。 「OK」をクリックし、続いて「取得」をクリックして "[色]タブ。」の「[色]タブ、"選択 "バイエル法」に続いて「平均4。」を示唆ゲイン（赤、緑、青）のあちこちに追加M 表1。「セーブ·セット」タブを選択し、画像を格納するディレクトリをクリックしてください。 表1の候補から「露出時間」を設定します。 "1"で「ビニング」を設定し、「ライブビニング"関心領域の「1。」焦点にし、をクリックして「ライブ保存します。"
  5. カメラのソフトウェア上の出力画像は、「TIF」形式になっています。細胞型の組織化学のために画像を分析。プレゼンテーションと出版物の下流で使用する場合は、標準的なコンピュータ·ソフトウェアを使用してください。

4。紫外線明視野イメージング

  1. のセクションでは、簡単にピペットでできるように、ピペットチップカットで1ミリリットルピペットを使用してください。そっとピペットのセクションチップ内に、顕微鏡のスライドに上。カバーガラスでのセクションをカバーしています。紫外光または明視野照明下のセクションを観察します。

5。フロログルシノール -塩酸（ウィーズナー）染色12

  1. 3％のフロログルシノールの溶液を調製し10ミリリットルの無水エタノール中のフロログルシノールを0.3g溶解する。エタノール3％フロログルシノールの2ボリュームに濃HCl（37 N）の1量を混ぜる。このソリューションは、フロログルシノール、塩酸（pH塩酸）またはウィーズナー染色である。注：このソリューションは、染色の日に新しく作らなければ、溶液が時間の経過とともに低下しますので、保存することができず、染色は無効となりますです。注意：HClを腐食性が高いので、Phは塩酸染色の処理中に細心の注意を払ってください。
  2. 2.0ミリリットルマイクロ遠心チューブにステム部分を転送します。セクションを含むチューブにPhは塩酸溶液1mlを加え、Phは塩酸染色中のHClは腐食性が高いので、すぐにキャップ。静かにすべてのセクションが染色されることを保証するためにチューブを移動します。このステップの代わりには、pH-HCl溶液を上下にピペッティングすることができるように、好ましくは、秒を乱すことなく、オープンチューブキャップを維持することですtions。注：これは、それらのセクションを傷める可能性がありますので、ピペットチップにセクションをピペットないように注意してください。
    1. のセクションでは、損傷を与えることなく、容易にピペットで可能なようにピペットチップカットで1ミリリットルピペットを使用してください。そっと先端に、顕微鏡スライド上のセクションをピペット。カバーガラスでのセクションをカバーしています。明視野照明下のセクションを観察します。 NOTE：Ph-でHCl溶液を試験片の劣化を引き起こす、5〜10分で乾く。そのため、撮像はその期間内に完了しなければならない。

6。マウレ染色13,14

  1. 0.5％過マンガン酸カリウム溶液を調製し、40 mlの蒸留水に過マンガン酸カリウム0.2gを溶解する。 7日間の最大室温で暗瓶の中に保管してください。
    1. 9ミリリットルの蒸留水（1:10）に1ミリリットル濃HCl（37 N）を追加することにより、3.7％塩酸溶液を調製する。新鮮な3.7％塩酸溶液を調製実験の日。使用されている37規定塩酸原液が古すぎるではないことを確認してください。濃縮水酸化アンモニウム溶液（14.8 M）が減少するから、飽和溶液のモル濃度を防ぐために4℃で保存すべきである。
  2. 2.0ミリリットルマイクロ遠心チューブにステム部分を転送します。セクションを含むチューブに0.5％過マンガン酸カリウム溶液1mlを加える。
    1. 好ましいのセクションを乱すことなく、静かに上下に0.5％の過マンガン酸カリウム溶液をピペット。 2分間インキュベートし、ピペッティングを繰り返します。すべてのセクションが落ち着くまで、マイクロチューブが放置。注：セクションでは、破損する可能性があるピペットチップにセクションをピペットないように注意してください。それは解決策が暗いように茎の節を参照して、その試験管立てのセクションでチューブを保持し、それらを2分のために解決することを可能にするのは難しいかもしれません。
    2. の1mlピペットを使用して、0.5％過マンガン酸カリウム溶液の700μLを引き出す。過マンガン酸カリウム溶液をすすぐために蒸留水700μLを加える。水溶液が透明のままになるまで3〜4倍を繰り返すか。
    3. 水を捨てます。深い茶色の色が部分から排出されるまで急速に3％塩酸1ミリリットルを加える。これは3〜5分以内に発生する可能性があり、または5分間ずつの2回の洗浄が必要な場合があります。すべての3％HCl溶液をピペットで、すぐに次のステップに進みます。
    4. 濃水酸化アンモニウム溶液1mlを加える。のセクションでは、損傷を与えることなく、容易にピペットで可能なように先端カットで1ミリリットルピペットを使用してください。そっと先端に、顕微鏡スライド上のセクションをピペット。カバーガラスでのセクションをカバーしています。明視野照明下のセクションを観察します。注意：水酸化アンモニウムは非常に腐食性があるので、それは顕微鏡やレンズのステージに腐食を起こす原因にもなりますので、余分なケアと注意が必要です。 NOTE：水酸化アンモニウムフュームが困難試料を観察すること、カバースリップを曇ることができ。そのため、カバースリップを追加する前に余分な注意が必要です。ソリューションは、5〜10分で乾くので、撮影がその期間内に完了する必要があります。

7。コンゴレッド染色11,15

  1. 0.5％コンゴー赤色溶液を調製し、蒸留水100mlにコンゴーレッドを0.5g溶解する。
  2. 2.0ミリリットルマイクロ遠心チューブにステム部分を転送します。チューブに0.5％コンゴーレッド溶液1mlを加える。そっと0.5％コンゴレッドソリューションをピペット上下のセクションを乱すことなく。注：これはセクションを損傷する可能性があるピペットチップにセクションをピペットないように注意してください。
    1. 10分間室温でインキュベートし、ピペッティングを繰り返します。室温でのインキュベーションの別の3分に従ってください。
    2. 0.5％コンゴーレッド溶液を700μLを引き出すために1ミリリットルピペットを使用してください。コンゴ赤色溶液をすすぐために蒸留水700を添加する。洗浄液まで洗浄3〜4倍を繰り返し明らかである。
    3. のセクションでは、損傷を与えることなく、容易にピペットで可能なように、先端カットで1ミリリットルピペットを使用してください。そっと先端に、顕微鏡スライド上のセクションをピペットし、カバーガラスでそれらをカバーしています。 40分の560のバンドパスのフィルターを使用した青色励起下で顕微鏡スライド上のサンプルを観察します。注：水は10から30分でコンゴレッドを洗い流すよう、電子顕微鏡による分析の前に長い間水にセクションを保管しないでください。

8。·ホワイト染色9

  1. 0.2％の原液を準備するために蒸留水を10ミリリットル中に蛍光増白28（·ホワイトM2R）の0.02グラムを溶解する。 0.2％溶液を4℃の暗瓶で6ヶ月間保存することができる蒸留水で0.2％の原液を10倍に希釈して0.02％のワーキング溶液を調製します。
  2. 2.0ミリリットルマイクロ遠心チューブにステム部分を転送します。 0.02％calcofのチューブ1ミリリットルに追加白ソリューションluor。優しく上下に0.02％·ホワイトソリューションをピペット。注：これはセクションを損傷する可能性があるピペットチップにセクションをピペットないように注意してください。
    1. 5分間室温でインキュベートし、ピペッティングを繰り返します。室温でさらに3分間のセクションをインキュベートします。注：セクションでは、それが簡単にセクションを損傷することなく、ソリューションをピペットするために、チューブの底部に沈殿させる。
    2. 0.02％·ホワイト溶液を700μLを引き出し、蒸留水700μlのを追加して1ミリリットルピペットを使用してください。 ·ホワイトソリューションをすすぐために5分間待ちます。ウォッシュ3〜4倍を繰り返します。のセクションでは、損傷を与えることなく、容易にピペットでできるような方法などでのピペットチップカットで1ミリリットルピペットを使用してください。
    3. そっと先端に、顕微鏡スライド上のセクションをピペットし、カバーガラスでそれらをカバーしています。 UV光下のセクションを観察します。

9。トルイジンブルE O染色16,17

  1. 0.02％の溶液を調製し、100 mlの蒸留水に0.02グラムのトルイジンブルーOに溶解する。 NOTE：トルイジンブルーO溶液を室温で暗所瓶で2週間保存することができる。
  2. 2.0ミリリットルマイクロ遠心チューブにステム部分を転送します。チューブに0.02％トルイジンブルーO溶液1mlを加える。優しく上下に0.02％トルイジンブルーOソリューションをピペット。その後、5分間室温でインキュベートし、一回ピペッティングを繰り返します。注：これはセクションを損傷する可能性があるピペットチップにセクションをピペットないように注意してください。のセクションでは、落ち着くまではマイクロチューブが静止してみましょう。これにより、ソリューションが暗いように、参照のため、試験管立てに関するセクションを含むチューブを保持し、それらを室温で2分間沈降することを可能にするのは難しいかもしれません。
    1. 0.02％トルイジンブルーO溶液を700μLを引き出すために1ミリリットルピペットを使用してください。トルイジンブルーOゾルをすすぐために蒸留水を700μl加えution。 3〜4倍を繰り返したり、洗浄溶液が透明になるまで。セクションは、それらを損傷することなく容易にピペッティングすることができるような方法でピペットチップカットながら1 mlピペットを使用する。
    2. そっと先端に、顕微鏡スライド上のセクションをピペットし、カバーガラスでそれらをカバーしています。明視野照明下のセクションを観察します。

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結果

埋め込みと分割幹：
埋め込 ​​むための自家製のプラスチック金型の使用は、アガロース迅速かつ簡単に（ 図1）であることが判明した7％で生じる。二つの部分（AとB、 図1）組み込みバイアルシステムのは、それが簡単な、容易にクリーンなシステムを維持し、アガロースが不活性であるバイアル部分に付着しないようにアガロース中に埋め込 ​​まれた茎を解放すること。バイアルは何年も複数回再使用することができる。埋め込まれた茎を格納する利便性にも次のステップが容易になります。茎組み込み、同様の、いつか節約するために切片化のため、単一の切片板の上に（3まで）にグループ化することができます。

UV下で芳香族化合物の観察：
幹切片をガラススライド上に蒸留水に搭載され、UV光の下で観察した。細胞中のリグニンを含む芳香族化合物は、UV光の下で、それらの自己蛍光により可視化することができる。木部（XY）とfasciclesの間の繊維（FI）リグニン、芳香族ポリマーは、二次細胞壁の生合成の間に堆積されているので、UV照射...

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ディスカッション

シロイヌナズナステム部が広く二次細胞壁中の細胞の組織化を研究し、定性的に、野生型およびトランスジェニック植物の間の差を調べるために使用される。標本を区画するために一般に使用される技術は、直接手で切っている。標本はアガロースまたは固定液に埋め込まれたとき、または、切片をビブラトームまたはミクロトームで行うことができます。手の切断とは対照的に、最後の二つは、単にサンプルと凹凸面との間の厚さの違いに起因する不良試料調製に起因するサンプル間の不正確な差を生成する危険性を低減することを可能にする。これらのメソッドはすべて、彼らの長所と短所を持っている。私たちは、ビブラトームを使用して切片化した後、アガロース中に埋め込むことを選んだ、と次のような理由でそのようにした：新鮮な組織の複雑な処理が不要に埋め込むのしやすさと時間アガロースを使用して過ごした。また、私たちの手作りの金型を作るのは簡単で安価である、目を保持することができますEストレートステム、長年にわたって使用することができ、混乱を行わずに試験片の容易なリリースでは助けることができます。高割合のアガロースを溶解し、均一な溶液（分厚い顆粒を形成することなく、100ミリリットル...

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開示事項

著者らには開示すべき金銭的紛争はない。

謝辞

我々は編集支援のためのセービンラッセルに感謝しています。この作品は、ローレンス·バークレーとの間の契約DE-AC02-05CH11231を通じてエネルギー省合同バイオエナジー研究所（http://www.jbei.org）米国エネルギー省でサポートされている、科学局、生物環境研究局の一部であった国立研究所と米国エネルギー省。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガローEMDMERC2125CAS番号:9012-36-6
PhloroglucinolSigmaP 35021,3,5-トリヒドロキシベンゼン[CAS番号:108-73-6]
塩酸EMDHX0603-75CAS番号:7647-01-0
水酸化アンモニウムEMDAX1303-6CAS番号:1336-21-6
Toulidine Blue OSigmaT3260塩化ブルテン、塩化トロニウム[CAS番号92-31-9] 
過マンガン酸カリウムSigma223468CAS番号 7722-64-7 
エタノール190プルーフKOPTECV1401CAS番号:64-17-5
コンゴレッドシグマ C6277二ナトリウム3,3'-[[1,1'-ビフェニル]-4,4'-ジイルビス(アゾ)]ビス(4-アミノナフタレン1-スルホン酸)[CAS番号573-58-0]
蛍光増白剤28 /カルコフローホワイトステインシグマF3543 4,4'-ビス[[4-[ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-6-アニリノ-1,3,5-トリアジン-2-イル]アミノ]スチルベン-2,2'-ジスルホン酸[CAS番号4404-43-7] 
バイブレーターライカライカ振動ブレードミクロトームVT1000Shttp://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
カミソリアメリカの安全カミソリ会社アイテム#60-0139-0000 ステンレスダブルエッジブレード(ペルソナスーパー)
スクリューキャップ微量遠心チューブ(2 ml)VWR16466-044
微量遠心チューブ(0.6 ml)Axygen ScientificMCT-060-C
ミットベルアート380000000SCIENCEWARE ホットハンドプロテクターミット
ティッシュ接着剤テッドペラ株式会社で4°C または 20 °C 3ヶ月以上保存可能
電子レンジ パナソニックNN-SD762SPELCO Pro CA 44 インスタントティッシュ接着剤 
メカニカルシャッターなしのCCDチップ付きカメラ 浜松C4742-95
ハイスピードカラーカメラ   QImagingMicroPublisher 5.0 RTV
カメラソフトウェア  Molecular DevicesMetaMorph version 7.7.0.0
解析のイメージ アドビ Photoshop CS4
マイクロカバーメガネ、スクエア、No. 1VWR48366-06722 x 22 mm(7/8 x 7/8 ")-カバーメガネは耐腐食性があり、均一に厚くて平らです。No.1の厚さは0.13〜0.17mmです。
つや消しマイクロスライド、1 mmVWR48312-00375 x 25 mm - 1 mm
パラフィルム Mアルカン包装BRNDPM998
TX2 フィルターキューブライカ11513851/11513885560/40 のバンドパスでコンゴの赤の分析に使用されます。
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参考文献

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