の組織化学的染色<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;二次細胞壁の要素

サマリー

植物細胞壁の組成は組織タイプによって異なり、リグニン、セルロース、ヘミセルロース、ペクチンを含むことができます。細胞種レベルでの違いを可視化するために、さまざまな染色技術が開発されてきました。この論文は、一般的に使用される細胞壁染色技術をまとめ

たものです。

要約

シロイヌナズナは、植物のさまざまな細胞プロセスを理解し操作するために一般的に使用されるモデル生物であり、二次細胞壁形成の研究に広く使用されてきました。二次細胞壁の堆積は、一次細胞壁が敷設された後に発生し、これは血管組織や繊維組織を形成する細胞などの特殊な細胞によってのみ実行されるプロセスです。ほとんどの二次細胞壁は、セルロース(40〜50%)、ヘミセルロース(25〜30%)、およびリグニン(20〜30%)で構成されています。二次細胞壁生合成に影響を与えるいくつかの突然変異が単離されており、対応する変異体は、これらの突然変異が代償性応答によって隠される可能性があるため、明らかな生化学的組成の変化または視覚表現型を示す場合と示さない場合があります。染色手順は、歴史的に細胞ベースで違いを示すために使用されてきました。これらの方法は、分析の視覚的な手段のみです。それにもかかわらず、迅速かつ批判的な分析における彼らの役割は非常に重要です。コンゴレッドとカルコフルオロホワイトは多糖類の検出に使用される染色剤ですが、モイレとフロログルシノールはリグニンの違いを決定するために一般的に使用され、トルイジンブルーOは多糖類とリグニンの鑑別染色に使用されます。切片作製、染色、イメージングという一見単純な技術は、初心者にとっては難しいものです。この研究では、A. thalianaモデルを使用したサンプル調製から始めて、植物の二次細胞壁における細胞および組織組織の観察のために簡単に実施できるさまざまな染色方法のプロトコルについて詳しく説明します。

概要

リグニン、セルロース、ヘミセルロース（キシラン、グルクロノキシラン、キシログルカン、アラビノキシラン、混合連鎖グルカン、またはグルコマンナン）、およびペクチン：植物細胞壁は、その様々な構成要素内の情報の過多を保持している。組織学的技術は、組織および細胞レベルでの二次細胞壁の中の違いを研究する上で重要な視覚的な手がかりを提供する。様々な組織学的技術が開発されており、文献に記載されていますが、これまでに利用可能な場合、単純な視覚的な指示に非常に詳細なプロトコルはめったにないため、これらの技術は、初心者のために挑戦し、時間がかかる場合があります。本研究の目的は、高品質の画像を得るために組織学的染色技術のための簡単​​なガイドラインを提供することである。

茎組織を区画すると、細胞壁と細胞形状の可視化の最初のステップです。ハンドカットのセクションでは、安価であり、準備する時間がかからないが、ビブラトームを使用すると、一貫性を提供し、高品質の画像が得られる。ビブラトームを使用すると、シャープな画像を生成するのに役立ち、著しく単純悪い試料調製に起因するサンプル間の不正確な差を生成するリスクを低減し、同じ厚さであってもセクションを生成することにより、より良好なデータ品質を製造することができる。新鮮な標本を修正するために樹脂を使用すると、初心者のための挑戦することができますし、分析を迅速に行う必要があるときもまだ専門家のために、時間がかかる場合があります。また、それは、樹脂中に埋め込まれたとき....

プロトコル

1。埋め込みステム

1. 水中の0.7％アガロース溶液（蒸留水100ml中の電気泳動グレードアガロース7 g）を作る。 20分間、または最低強度（ 例えば 、1250ワットのマイクロ波を10％の強度）で20分間マイクロ波処理することによりオートクレーブでアガロースを溶解する。
2. プラスチックバイアルを使用した茎埋め込むための手作りの金型を準備します。
   1. カミソリの刃を使用して、2ミリリットルスクリューキャップマイクロチューブ（A部）の円錐底を切り落とした。注射針と、埋め込むべき幹の直径よりも僅かに大きいチューブキャップに穴を穿刺する。次に、0.6ミリリットルのマイクロ遠心チューブ（パートB）の下部から0.5cmにカット。
   2. プレカット2ミリリットルの微量遠心チューブに0.6ミリリットルマイクロチューブのカットオフ0.5センチメートル部分を追加します。パラフィルム（ 図1）を使用して、二つの部分を密封する。注意：チューブの底部は、アガロースが固化した後に埋め込まれたサンプルの除去を容易にするために切断される。 T彼は、キャップの穴は茎をアガロースに埋め込まれている場合、安定ステムを保持するのに役立ちます。金型は、アガロースを保持し、埋め込む際に、ステムストレートを保持するのに役立つでしょう。アガロースが設定され、ステムが埋め込まれるまで、パラフィルムは、二つの部分A及びBを保持する。
   3. カミソリの刃を使用し....

結果

埋め込みと分割幹：
埋め込 ​​むための自家製のプラスチック金型の使用は、アガロース迅速かつ簡単に（ 図1）であることが判明した7％で生じる。二つの部分（AとB、 図1）組み込みバイアルシステムのは、それが簡単な、容易にクリーンなシステムを維持し、アガロースが不活性であるバイアル部分に付着しないようにアガロース中に埋め込 ​​まれた茎を解放すること。バイアルは何年も複数回再使用することができる。埋め込まれた茎を格納する利便性にも次のステップが容易になります。茎組み込み、同様の、いつか節約するために切片化のため、単一の切片板の上に（3まで）にグループ化することができます。

UV下で芳香族化合物の観察：
幹切片をガラススライド上に蒸留水に搭載され、UV光の下で観察した。細胞中のリグニンを含む芳香族化合物は、UV光の下で、それらの自己蛍光により可視化することができる。木部（XY）とfasciclesの間の繊維（FI）リグニン、芳香族ポリマーは、二次細胞壁の生合成の間に堆積されているので、UV照射.......

ディスカッション

シロイヌナズナステム部が広く二次細胞壁中の細胞の組織化を研究し、定性的に、野生型およびトランスジェニック植物の間の差を調べるために使用される。標本を区画するために一般に使用される技術は、直接手で切っている。標本はアガロースまたは固定液に埋め込まれたとき、または、切片をビブラトームまたはミクロトームで行うことができます。手の切断とは対照的に、最後の二つは、単にサンプルと凹凸面との間の厚さの違いに起因する不良試料調製に起因するサンプル間の不正確な差を生成する危険性を低減することを可能にする。これらのメソッドはすべて、彼らの長所と短所を持っている。私たちは、ビブラトームを使用して切片化した後、アガロース中に埋め込むことを選んだ、と次のような理由でそのようにした：新鮮な組織の複雑な処理が不要に埋め込むのしやすさと時間アガロースを使用して過ごした。また、私たちの手作りの金型を作るのは簡単で安価である、目を保持することができますEストレートステム、長年にわたって使用することができ、混乱を行わずに試験片の容易なリリースでは助けることができます。高割合のアガロースを溶解し、均一な溶液（分厚い顆粒を形成することなく、100ミリリットル.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロー	EMD	MERC2125	CAS番号:9012-36-6
Phloroglucinol	Sigma	P 3502	1,3,5-トリヒドロキシベンゼン[CAS番号:108-73-6]
塩酸	EMD	HX0603-75	CAS番号:7647-01-0
水酸化アンモニウム	EMD	AX1303-6	CAS番号:1336-21-6
Toulidine Blue O	Sigma	T3260	塩化ブルテン、塩化トロニウム[CAS番号92-31-9]
過マンガン酸カリウム	Sigma	223468	CAS番号 7722-64-7
エタノール190プルーフ	KOPTEC	V1401	CAS番号:64-17-5
コンゴレッド	シグマ	C6277二	ナトリウム3,3'-[[1,1'-ビフェニル]-4,4'-ジイルビス(アゾ)]ビス(4-アミノナフタレン1-スルホン酸)[CAS番号573-58-0]
蛍光増白剤28 /カルコフローホワイトステイン	シグマ	F3543	4,4'-ビス[[4-[ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-6-アニリノ-1,3,5-トリアジン-2-イル]アミノ]スチルベン-2,2'-ジスルホン酸[CAS番号4404-43-7]
バイブレーター	ライ	カライカ振動ブレードミクロトームVT1000S	http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
カミソリ	アメリカの安全カミソリ会社	アイテム#60-0139-0000	ステンレスダブルエッジブレード(ペルソナスーパー)
スクリューキャップ微量遠心チューブ(2 ml)	VWR	16466-044
微量遠心チューブ(0.6 ml)	Axygen Scientific	MCT-060-C
ミット	ベルアート	380000000	SCIENCEWARE ホットハンドプロテクターミット
ティッシュ接着剤	テッドペラ株式会社		で4°C または 20 °C 3ヶ月以上保存可能
	電子レンジ パナソニック	NN-SD762S	PELCO Pro CA 44 インスタントティッシュ接着剤
メカニカルシャッターなしのCCDチップ付きカメラ	浜松	C4742-95
ハイスピードカラーカメラ	QImaging	MicroPublisher 5.0 RTV
カメラソフトウェア	Molecular Devices	MetaMorph version 7.7.0.0
解析のイメージ	アドビ	Photoshop CS4
マイクロカバーメガネ、スクエア、No. 1	VWR	48366-067	22 x 22 mm(7/8 x 7/8 ")-カバーメガネは耐腐食性があり、均一に厚くて平らです。No.1の厚さは0.13〜0.17mmです。
つや消しマイクロスライド、1 mm	VWR	48312-003	75 x 25 mm - 1 mm
パラフィルム M	アルカン包装	BRNDPM998
TX2 フィルターキューブ	ライカ	11513851/11513885	560/40 のバンドパスでコンゴの赤の分析に使用されます。

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