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方法論記事

捕獲化合物質量分析 - 小説のc-ジ-GMPエフェクタータンパク質を同定するための強力なツール

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DOI:

10.3791/51404

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2015年3月29日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum of the University of Basel, 2Proteomics Core Facility, Biozentrum of the University of Basel

この記事について

サマリー

ユビキタスなセカンドメッセンジャーc-di-GMPは、多くの細菌の成長と行動を制御します。私たちは、ほぼすべての細菌種におけるc-di-GMP結合タンパク質を生化学的に同定し、特性評価するための新しいCapture Compound Mass Spectrometry技術を開発しました。

要約

かなりの進歩は、第二メッセンジャーc-ジ-GMPの合成（ジグアニルシクラーゼ）及び分解（ホスホジエステラーゼ）に関与する酵素の同定および特徴に向けた最後の十年の間に行われている。これとは対照的に、ほとんど情報がこのシグナル伝達分子は、細胞プロセスの多様な範囲を規制を通じて分子機構と細胞成分に関する利用可能です。知らエフェクタータンパク質のほとんどは、ピルツファミリーに属するか、触媒作用をあきらめているとエフェクター機能を採用しているジグアニルシクラーゼ又はホスホジエステラーゼを縮退している。したがって、より良い細菌実験方法の広範囲の細胞c-ジGMPネットワークを定義することは失敗するインシリコ予測における信頼性のあるもののための新規のエフェクターを識別し、検証する必要がある。

我々は最近の強力なツールとしての新規捕獲化合物質量分析法（CCMS）に基づく技術を開発しました生化学的にc-ジ-GMP結合タンパク質を同定し、特徴づける。この技術は、以前に生物1の広い範囲に適用可能であることが報告されている。ここでは、我々はそのようなシグナル伝達成分を調べるために利用するプロトコルの詳細な説明を与える。例として、 緑膿菌 、c-ジ-GMPが病原性とバイオフィルム制御に重要な役割を果たしている日和見病原体を使用しています。 CCMSは、c-ジ-GMPネットワークの既知または予測コンポーネントの74パーセント（51分の38）を同定した。この研究は、詳細にCCMS手順を説明し、小分子のシグナル伝達に関与する新規成分を同定するための強力で汎用性の高いツールとしてそれを確立します。

概要

c-ジGMPは、その成長と行動の様々な側面を制御するために、ほとんどの細菌によって使用される重要なセカンドメッセンジャーである。例えば、c-ジGMPは、細胞周期進行、運動性およびエキソポリサッカライド及び表面アドヘシン2-4の発現を調節する。このようなプロセスのc-ジ-GMPの協調を通じて、バイオフィルム形成、病原菌5の範囲の慢性感染症に関連付けられているプロセスを促進する。 c-ジ-GMPは、触媒GGDEFドメイン4を保有するジグアニルシクラーゼ（DGCs）と呼ばれる酵素によって合成されている。いくつかのDGCsはダウンc-ジ-GMP結合の際シクラーゼ活性を調節阻害部位を有する。 c-ジ-GMPの劣化は、触媒EALまたはHD-GYPドメイン6,7のいずれかを保有するホスホジエステラーゼの二つの異なるクラス（偏微分方程式）によって触媒される。

直接c-ジGMPに結合する既知のエフェクタータンパク質の大部分は、タンパク質の唯一の3つのクラスに属する：触媒を同盟国、非アクティブGGDEFまたはEALドメインとピルツドメイン、c-ジ-GMPが8と結合すると立体構造変化を受ける小さな分子スイッチ。 DGCs、偏微分方程式とピルツタンパク質が十分に特徴付けされ、そのドメインは比較的安全にin silicoで予測することができる。特に関心は現在c-ジ-GMPエフェクターの新しいクラスの識別に焦点を当てている。別の結合モチーフを有するいくつかのc-ジ-GMPのエフェクターは、 バークホルデリアcenocepacia中のCRP / FNRタンパク質ファミリーBcam1349またはPにおける転写調節因子FleQとして最近、記載された緑膿菌 9,10。また、c-ジGMP特異的リボスイッチは、最近同定され、c-ジGMP依存性の様式11に遺伝子発現を制御することが示された。異なるエフェクターのc-ジ-GMPが結合モチーフはわずかしか保存されたようなタンパク質の生物情報学の予測を困難にしている。この問題に対処するために、我々は、c-ジGMPのSPEの使用に基づく生化学的方法を開発cific捕獲化合物は、質量分析法1,12,13と組み合わせる。

我々は最近、（CDG-CC、 図1）は、新規三価のc-ジ-GMPの捕獲化合物を設計しています1。 、c-ジ-GMP結合タンパク質を捕捉するために餌として使用1）c-ジGMP部分結合したタンパク質にCDG-CCをリンク交差するために使用する2）紫外線光活性化反応基と：この化学足場はで構​​成されている3）ビオチンは、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを用いて捕捉されたタンパク質を単離する。 CDG-CCは、直接かつ特異的に細胞溶解物のような高分子の複雑な混合物からc-ジGMPエフェクターを捕捉するために使用することができる。捕獲化合物系、化学プロテオミクスに基づくアプローチは、以前は、広範囲の生物に適用可能であることが報告されており、 例えばカウロバクターcrescentus、サルモネラ·エンテリカ血清型ネズミチフス菌およびP.緑膿菌 1,14。

この方法論の論文では、我々は、P。の抽出物を使用してCCMS手順の深さの説明で提供例として緑膿菌 。この研究は、生化学的に、小分子のシグナル伝達に関与する新規成分を同定するための強力で汎用性の高いツールとしてCCMSを確立します。

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プロトコル

1.溶解物の準備

  1. P.を育てる希望ODにLBにおける緑膿菌細胞 。
    注：ガイダンスについて：対数期の培養のための固定相培養のため≈100ミリリットル文化/サンプルと≈500ミリリットルのcultur /サンプル（OD 600nmが = 0.5）を使用します。
  2. 5000のx gで20分間の遠心分離によってペレット。
  3. 同様に1ミリリットルの溶解緩衝液（6.7 mMのMES、6.7 mMのHEPES、200mMのNaCl、6.7 mMのKAC、DDTを1mM、pH7.5）中、およびプロテアーゼ阻害剤を追加し（EDTAを含まない完全なミニ）でペレットを再懸濁0.5〜1グラムDNアーゼIとして。
  4. 溶解20,000psiでフレンチ圧力セルを通じて3継代によって細胞、（材料リストを参照してください）​​。
  5. 超遠心機で4℃で1時間、100,000×gで細胞溶解物。
  6. 上清を保存します（ステップ2に進み）。
  7. ピペッティングにより溶解バッファー1×1ミリリットルとのペレットを洗浄。
  8. 4℃で1時間100,000×gで超遠心機。
  9. ペレットをフラッシュ凍結膜タンパク質の捕捉に使用するまで-20℃で液体窒素や店舗（ステップ3を参照）。

c-ジ-GMP無料と他のヌクレオチドの2の除去（可溶性画分のみ）

  1. 冷溶解緩衝液10mlをPD10脱塩カラム（参照物質一覧）を洗浄する。
  2. ヌクレオチドを​​除去するために、PD10上に上清（≈1ミリリットル）を注ぐ。
  3. 4mlで溶出する冷溶解緩衝液（500μlのステップ）。
  4. Bradfordアッセイによって決定されるように最も濃縮画分を選択し、それらをプールする。

3.ペレットの再懸濁および可溶化（膜画分のみ）

  1. （界面活性剤なし）1×捕捉緩衝液の500〜1000μlの中にペレットを再懸濁した（ 表1を参照のこと）。
    注：ペレットが再懸濁することは困難である。大体うまく解決策を均質化する注射器27のGを使用するように、その後、ペレットを再懸濁するために、ITをピペットで第一ピペットアップにとダウンをお勧めします。
  2. 1％を加える（w / v）のn-ドデシルβ-D-マルトピラノシド（DDM）。
  3. 回転ホイール上に少なくとも2時間（またはO / N）、4℃でインキュベートする。
  4. 4℃で1時間100,000×gで超遠心機。
  5. 上清を収穫。

4.タンパク質濃度測定

  1. （膜画用のBCAアッセイによる）ブラッドフォードアッセイによりタンパク質濃度を測定します。
  2. 10 mg / mlの総タンパク質濃度を設定する。

5.キャプチャ

  1. GDP、GTP、ATP、CTPの1 mMの、そして5倍キャプチャバッファ（100mMのHEPES、250 mMのKAC、50 mMのMgAc、5％グリセロール、pH7.5）を（ 表1）の20μlのタンパク質300μgのを混ぜる。 H 2 Oで100μlに反応容量を調整
    注：総ボリュームは（ステップ5.3および表2を参照）競合制御の場合のCDG-CC及びc-ジ-GMPのボリュームが含まれています。
    注：全ての実験は、200で行った＃181; L 12-チューブPCRストリップ（サーモサイエンティフィック）。
    注：膜画分のために、常に8 M尿素（ステップ7.1）中のタンパク質可溶化工程まで、臨界ミセル濃度（w / vの0.01％）を上回るDDM濃度を維持することを確認してください。
  2. 回転ホイール上で30分間、4℃でインキュベートする。
  3. 10μMのCDG-CC（最終濃度）を追加します。
    NOTE：（ 表2参照）（「ビーズ制御」という）CDG-CCない対照、および1mM c-ジGMP（「競合制御」）を補充した制御を含む。
    注：CDG-CCの濃度は1〜10μMに調整することができる。
  4. 暗闇の中で、回転ホイール上に少なくとも2時間（O / Nのための膜画分）、4℃でインキュベートする。
  5. 短いスピンした後、架橋CDG-CCの反応性部分の活性化により4分間のUV光で、CaproBoxを使用して（λ= 310 nmの放射照度≥10ミリワット/​​ cm 2で、光源からの距離、物質一覧を見る= 2センチ）。注：ストリップ架橋前の蓋を外す。
  6. 優しく均質化、25μlの5倍の洗浄緩衝液（5MのNaCl、250 mMトリス、pH7.5）を、よく再懸濁ストレプトアビジン磁気ビーズ50μlのを追加。
  7. 回転ホイール上で1時間4℃でインキュベートする。

6.洗浄ステップ

注：（マグネット：材料リストを参照してください）​​。磁石を用いたPCRストリップ蓋の磁気ビーズの捕獲、始めます。その後、次の洗浄溶液を含む新しい1によりPCRストリップを交換してください。磁石を外し、ビーズを再懸濁し、2分間インキュベートする。スピンダウンし、新鮮な蓋によって蓋を交換してください。

  1. 洗浄工程（のみ可溶性画分）
    1. 200μlの1×洗浄バッファーで6回洗浄する。
    2. 200μlのHPLCグレードH 2 Oで一度洗浄する
    3. 洗浄液200μlの80％アセトニトリル中の6回。
    4. 200μlのHPLCグレードH 2 Oで2回洗浄
  2. 洗浄ステップ（membraNE画分のみ）
    1. + 0.1％DDM200μlの1×洗浄緩衝液で5回洗浄する。
    2. 200μlの1×洗浄緩衝液+ 0.05％DDMに2回洗浄する。
    3. + 0.025％DDM200μlの1×洗浄緩衝液で一回洗浄する。
    4. 200μlの1×洗浄緩衝液+ 0.0125パーセントのDDMに一度洗ってください。
    5. 200μlの100mMのABCで3回洗浄し（炭酸水素アンモニウム、NH 4 CO 3）+ 2 M尿素。

7. MSサンプル調製

  1. 20μlの100mMのABC（膜分画用の100 mMのABC + 8 M尿素）で（直接蓋）ビーズを再懸濁し、1.5mlチューブに移す。
  2. 膜画分は、500 rpmで振盪し、5分間60℃でインキュベートする。
  3. 0.5μlの200 mMのTCEP（トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン）を添加し、500 rpmで振盪、1時間60℃でインキュベートする。 25℃に冷却する。
  4. 揺れ、ヨードアセトアミド新たに調製された400mmの0.5μl添加し、30分間25℃でインキュベート500回転数トン、暗所で。
  5. 0.5μlの0.5 M のN -アセチルシステインを追加し、500 rpmで振盪、10分間25℃でインキュベートする。
  6. 膜画のみ：1μLのLys-Cを追加し、37℃、O / Nでインキュベートする。
  7. 2μgのトリプシンを追加し、500回転（乾燥を防ぐためにパラフィルムでラップ）で振とうし、37℃でO / Nインキュベートする。
    注：サンプルは、この段階で-20℃で保存することができる。
    注：メンブレン分のみ：トリプシンの添加の前に<2 Mに尿素濃度を調整するために100 mMのABCを追加します。
  8. 簡単に言えば、チューブをスピンダウンし、磁石でビーズを収集します。
  9. 新しい1.5 mlチューブに上清を移し（ビーズが残っている場合は、この手順を繰り返します）。
  10. 5μlの5％TFA（トリフルオロ酢酸）+ 1μlの2 M塩酸（膜分画のための15μlの5％TFA + 5μlの2 M HCl）を追加します。
  11. 条件C18をMicroSpinカラム150μlのアセトニトリル（ネストグループ、MA、USA）（2400 rpmで20秒スピン）。
  12. エクイ150μlの0.1％TFA（スピン20秒、2400 RPM）でC18カラムを2回librate。
  13. サンプルをロードし、2分、2000rpmでスピン。
  14. カラムにフロースルーをリロードし、紡糸工程（2分、2000 rpm）を繰り返します。
  15. 150μlの0.1％TFA、5％アセトニトリル（20秒、2400回転）で3回洗浄する。
  16. 新しいチューブに取り、150​​μlの0.1％TFA、50％アセトニトリル（2分間、2000 rpmで）で2回溶出する。
  17. スピードバック中のペプチドを乾燥させる。
  18. 40μlの98％H 2 O、2％アセトニトリル、0.15％ギ酸に再懸濁。
  19. 超音波処理20秒（パルス周期0.5、振幅100パーセント、物質一覧を参照）、5秒、回転数12,000rpm（ベンチトップ遠心機）をスピンダウン。ボルテックス10秒、及び5秒、12,000rpmでスピンダウン。 LC-MS / MS分析のためにHPLCバイアルに移す。
  20. -20℃で凍結する。
    注：サンプルは、この段階で-20℃で保存することができる。

8. LC-MS / MS分析

  1. ナノLCを実行します（ナノLCシステム）equippRP-HPLCカラム（75ミクロンインチx 37 cm）のC18樹脂を充填したと編（マジックC18 AQ3μm）を、95％溶媒A（0.15％ギ酸、2％のアセトニトリル）、5％の溶媒Bの直線勾配を使用して（ 0.2μlの/分の流速で60分間かけて35％溶媒B 98％アセトニトリル、0.15％ギ酸）。
  2. LC-MS / MS（エレクトロスプレーイオン源に接続されたデュアル圧力LTQ-オービトラップVelos質量分析計）を用いてペプチドを分析する。
    注：データ収集モードは、MSが20の最も強いイオンを線形イオントラップにMS / MSスキャン、続い6万FWHMの分解能で質量分析計のFT部分をスキャンつの高解像度が得られるように設定した。 MS / MSの試みの効率を高めるために、荷電状態スクリーニング様式が割り当てられていない除外することが可能と単独イオンを充電した。前駆体は100イオン数を超えると共謀誘起解離がトリガされました。動的排除時間を30秒とした。イオン蓄積時間は300ミリ秒（MS）と50に設定したミリ秒（MS / MS）。

9.データベース検索

  1. P.をダウンロード緑膿菌 NCBI-データベースNCBIのホームページを経由して（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ）。
  2. MassMatrix変換ツール（使用してマスコットジェネリックファイルにMS生のスペクトル（MGF）に変換http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.pyを ）。
  3. P.に対してMASCOTバージョン2.3を使用してこのMGFファイルを検索フォワード含む緑膿菌 NCBIデータベースと逆デコイタンパク質のエントリ。
  4. （プロリンが続く限り）2が完全にトリプシンペプチドで切断を逃し耐えリジンとアルギニンの後シリコトリプシン消化で実行します。
  5. 固定修飾などのシステイン残基の変数の修正及びカルボキシアミドメチル（57.021464ダ）として酸化されたメチオニン（15.99491 DA）を可能にするために、データベースの検索パラメータを設定します。 MASCOTは私たちを検索するための高解像度スキャンをる、15 ppmまで前駆質量許容値を設定し、0.6 DAにフラグメント質量許容値を設定。最後に、1％タンパク質FDRを設定します。
  6. P.のマスコット検索をインポート足場（Proteomesoftware、バージョン3）に緑膿菌 CCMS実験は、1％のタンパク質FDR近くを取得し、合計スペクトルカウントを抽出するためのパラメータを設定する。
  7. 本稿の代表的な結果のために、我々は競合制御と実験を比較するために対応のあるt検定を使用し、0.1以下のp値のみと考え安打、及び2以上のスペクトルカウント比（スペクトルカウント/競合制御スペクトルを試すカウント）。
  8. データは、さらなる分析のために任意の表計算ソフトにエクスポートすることができる。

10.ラベルフリー定量

  1. Progenesis LC-MSソフトウェア（非線形力学、バージョン4.0）にRAWファイルをインポートします。
  2. デフォルトセッティにおけるLC-MSアライメントおよび特徴検出を行うNGS。
  3. Progenesis LC-MSからMGF形式でデータをエクスポートします。
  4. NCBI P.に対してMASCOTを使用して、MS / MSスペクトルを検索するフォワード含む緑膿菌データベースと逆デコイタンパク質のエントリ。
  5. Progenesis LC-MSへのデータベースの検索結果をインポートし、MS1機能へのペプチドの識別をマップします。
  6. （0.1以下のq値 、2上記のスペクトルカウント比閾値）データ評価（有意レベルの計算、倍変化を比）がSafeQuantのProteinSQAnalysisスクリプトが使用された。

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結果

P.における新規c-ジ-GMPのエフェクターを同定するために、 緑膿菌我々は体系的にPの可溶性および膜画分を分析するためにCCMSを使用対数期培養（OD 600 = 0.5）から緑膿菌菌株 PAO1。ここでは、この釣りの遠征の代表的な結果を要約し、議論する。四つの独立した生物学的なレプリカが使用された。各実験のために二つの異なるCDG-CC濃度（5μMおよび10μM）を用いた。特異性を探索するために、実験は、競合他社と、最後に、ビーズコントロール（ すなわち CDG-CC無し）（ 表1）のように1 mMのc-ジGMPの存在下または非存在下で行った。

（ 図2）上で詳細に記載された方法に従うとき、我々は、足場形式で捕捉されたタンパク質のリストを生成した。そうな汚染物質を除去した。これは、リボソームタンパク質、ストレプトアビジン、トリプシン、血清アルブミン、ケラチンおよび他のヒトタンパ​​ク質を含んでいた...

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ディスカッション

特別な注意は、プロトコルのいくつかのステップで撮影する必要があります。タンパク質濃度は10 mgの濃度の重要なパラメータである/ mlの細胞が特定の増殖条件（ 例えば、バイオフィルムまたは小型コロニー変種）で増殖させたときに到達することが困難である。従って、ペレットの再懸濁を溶解緩衝液の少量で行われるべきである。タンパク質濃度は8mg / mlまで減少させることができる。 Nesper らによって公表された方法と比較して1は、ヌクレオチド結合タンパク質の非特異的な取り込みを最小限にするために捕獲反応に様々なヌクレオチドを加えた。ヌクレオチドの付加は、特異性を改善しているが、同時に同じ部位で異なるヌクレオチドに結合するタンパク質の取り込みを防止することができる。例えば、最近、ATPおよびc-ジ-GMP 18を結合することが示されたエフェクターFleQはではなく、もはやDで、私たちの前の実験1におけるATPの非存在下では、具体的釣ったアタATPの過剰の存在下で、ここに提示した。

CD...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

私たちは、緑膿菌のCCMS条件を最適化するための彼の仕事に対して、アルベルト・レインダースに感謝します。また、P. aeruginosaタンパク質のアノテーションを提供してくださったPablo Manfredi氏にも感謝します。この研究は、スイス国立科学財団(SNF)のSinergia助成金CRSII3_127433の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
caproBoxcaprotec bioanalytics1-5010-001 (220 V)のための冷却96プレート冷却ブロックに結合
、c-di-GMP caproKitcaprotecバイオアナリシスこのキットには、c-di-GMPキャプチャーコンパウンド、c-di-GMP(コンペティションコントロール用)、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズ、キャプチャバッファー、および洗浄バッファーが含まれています
ディスポーザブルPD-10脱塩カラムGE Healthcare17-0851-01 
12チューブPCRストリップThermoScientificAB-1114
UIS250v超音波発生器、VialTweeterヒールシャー超音波技術UIS250vおよびVialTweeter
ミニチュアフランス圧力セルThermo Electron CorporationFA-003
UVランプは、CCMSスターターキットに含まれる光活性化caproMag caprotecバイオアナリシスされています ご要望に応じてをピペッティングせずに磁性粒子を簡単に取り扱うことができます

参考文献

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