方法論記事

薄層クロマトグラフィー（TLC）分離および植物抽出物のバイオアッセイは、抗菌化合物を同定するために

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DOI：

10.3791/51411

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2014年3月27日

 , 
1Forage-Animal Production Research Unit, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

この記事について

サマリー

方法は、植物抽出物の薄層クロマトグラフ（TLC）分離および抗菌性代謝物を同定するためのコンタクトバイオオートグラフィーのために記載されている。方法は、ウシ第一胃にネイティブ過剰のアンモニア産生菌（HAB）を阻害レッドクローバーフェノール化合物のスクリーニングに適用される。

要約

植物の抗微生物化合物のための共通の画面（ 例えば 、真菌又は細菌ブロスまたは寒天）、微生物のための時間には成長させる微生物の懸濁液にクロマトグラムを露出させる、紙又は薄層クロマトグラフィー（PC又はTLC）によって植物抽出物を分離することから成り湿った環境、無微生物の増殖のゾーンを可視化する。バイオオートグラフィーとして知られているこのスクリーニング方法の有効性は、クロマトグラフィー分離の品質および微生物の培養条件で撮影されたケアの両方に依存する。本稿では、酸発酵菌アミノための新しいアプリケーションと、TLCおよびコンタクトバイオオートグラフィーのための標準的なプロトコルについて説明します。抽出液を可撓性（アルミニウムで裏打ち）シリカTLCプレート上で分離し、バンドを紫外線（UV）光下で可視化する。ゾーンは、試験微生物を接種した寒天上に切り出し、表面を下にインキュベートする。阻害バンドは寒天プレートを染色することによって可視化されるsのテトラゾリウム赤。この方法は、レッドクローバー（ アカツメクサ品種 。Kenland）フェノール性化合物およびクロストリジウムsticklandii、ウシ第一胃にネイティブなハイパーアンモニア生産菌（HAB）に対する活性のための彼らのスクリーニングの分離に適用されます。 TLC法は、（好気性または嫌気性）、ならびに菌類植物抽出物及び他の細菌種の多くの種類に適用される培養条件は、種の成長要件に適合するように変更された場合に、試験生物として使用することができる。

概要

植物中の抗菌性化合物をアッセイすることは、植物抽出物の成分を分離するこれらのコンポーネントに試験微生物を露出し、微生物の増殖が化合物のいずれかによって阻害されるかどうかを決定する必要である。多くの化合物は、平坦な表面上で分離することができるので、紙又は薄層クロマトグラフィー（PC又はTLC）による分離が便利である。分離は、いくつかの化合物が吸着剤（パソコンの場合には、セルロース、およびTLCの場合、吸着剤の品種）に強固に結合し、他の1未満の移行で、極性に基づいています。 図1の相対位置の例を示していますシリカTLCプレート上で分離した後、極性および非極性のフェノール化合物。

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図1。シリカ薄層クロマトグラフィー（TLC）プレート上の分離後に異なる極性の化合物の分布を示す図。アカツメクサ（ トリフォチモシー L.）のフェノール化合物は、実施例として使用される。パーティションより容易なclovamideなどの極性化合物、シリカのような極性の吸着剤への強い親和性を有し、原点（OR）の近くに残っている、そのような溶媒先端（SF）に近い3イソフラボンなどの極性の低い化合物、しばらく、溶剤へ（水、酸、または塩基が含まれている場合を除き、シリカよりも極性である）と、遠くプレートまで移動する。

TLCプレート上で抽出物を分離した後、試験微生物は、このように抽出物2の活性成分の同定を迅速化、プレート上の全ての化合物に暴露することができる。真菌や細菌培養がクロマトグラムにさらされている場合は、微生物の増殖は、成長阻害剤を用いた領域上を除いてどこでも発生しますYの化合物。真菌細胞を生きた4により低減又は加水分解されたときに色を変更する化合物を噴霧することにより3または適用された場合に阻害ゾーンは、その後、菌糸体の成長および増殖を含まない領域とのコントラストを観察することによって視覚化することができる。抗菌性アッセイのための紙又は薄層クロマトグラムの使用は、第5の抗生物質及び殺菌剤3,6に適用したが、植物抽出物は、現在、頻繁に、しばしばバイオオートグラフィーと称されるこの方法では、抗菌性化合物についてスクリーニングされる。ここに記載されたプロトコルは、薄層クロマトグラムのバイオオートグラフィーに適用されます。それは比較的迅速であり、異なる吸着剤（ 例えば 、シリカ、デンプン、アルミナ）、ならびに良好な解像度及び感度1を提供することで行うことができるので、TLCが広く用いられている。

植物抽出物は、多くの方法でTLCのために調製することができる。一般的な方法は、ALCで抽出植物材料を含むそのような可能性の酸または塩基9を添加し、80％エタノール、7,8、等ohol -水の混合物である。彼らは最小容量のTLCプレートに適用することができるように、いくつかの水を含んでいて、おそらく酸性または塩基性であり、このような溶媒中で抽出後、抽出液を濃縮する必要があります。アルコール-水抽出物の濃度は、水非混和性有機溶媒8または例えば酢酸エチル-エチルエーテル（1:1、v / v）の10,11のような溶媒の混合物を分割することによって達成することができる。異なる植物代謝産物は、その極性に応じて、異なる有機溶媒中に抽出される。その植物有機酸または塩基がこの段階で有機溶媒中に抽出されるように、アルコール - 水抽出物のpHを上昇またはその後であり、それらの非解離形へと解離した分析物を変換するための水溶性の酸または塩基を低下させることができる中性有機溶剤に可溶で9。有機相をEすることができます減圧下、または窒素下でvaporatedとTLC用所望の容量に調整した。抽出液のpHを中性溶剤、小さな最終容量、および分離前にTLCプレート上の抽出物の蒸発への検体のパーティショニングによるバイオアッセイの微生物に対して致死的になることはほとんどありません。

真菌および細菌の両方は、植物抽出物2のバイオオートグラフィーの試験微生物として使用される。栄養溶液中でプレート上に噴霧し、数日3湿潤環境でインキュベートした場合などクラドスポリウムククメリヌムなどの一部の真菌の胞子は、TLCプレート（別に阻害化合物を用いた地域からの）上で発芽する。 Cの暗い菌糸非阻害性のゾーンにククメリヌムは菌糸成長のフリーゾーンに鋭い対照を提供しています。細菌は、同様に4,12薄層クロマトグラフィー（TLC）プレートに適用されてきたが、細菌はまた、TLC上に注ぐ寒天オーバーレイ中の板面13,14。例えば、 カンジダ·アルビカンス（Candida albicans）などの酵母は、、ならびに14寒天オーバーレイを適用することができる。あるいは、TLCプレート10,15は、細菌または酵母8、コンタクトバイオオートグラフィー2として知られている方法で接種した寒天上にフェイスダウンで載置することができる。

私たちは、レッドクローバー（ アカツメクサ品種 。Kenland）から抗菌フェノール化合物をスクリーニングするために、コンタクトバイオオートグラフィーのための方法が記載されている。試験微生物は、 クロストリジウム·sticklandii、第一胃ハイパーアンモニア生産菌（HAB）で、嫌気性菌を義務づける。使用分離は抽出物のすべてのコンポーネントを解決しないが、彼らはこのように可能な抗菌性化合物のプールを狭め、抗菌活性のゾーンの識別を容易にする。プロトコルは、TLC 1のための標準的な手順を利用しています。プロトコルは、培養obliに必要な技術のいくつかを説明このようなアッセイのためのゲート嫌気性菌、生細胞2,4を染色するテトラゾリウム塩、接触バイオオートグラフィー15と可視化手法の利用。

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プロトコル

1。植物エキスの調製

  1. アカツメクサの CVからのフェノール化合物の抽出にケーガンとFlythe 10を参照してください。 Kenland。
  2. 他の植物に他の化合物を抽出するために、（多くは説明されている）植物または代謝固有の抽出方法のための植物化学物質の分析資料を確認するか、ワイドで多くの化合物を分離するようなKhurram ら 7,8のもののようなプロトコルを探す極性の範囲。

2。薄層プレートの作製

  1. 現像所のゾーンから吸着された汚染物質を移動させるために、1種以上の極性、中性溶媒中で現像したクリーンTLCプレート。
    1. ドラフト内で、十分な洗浄溶剤を作製し（酢酸エチル-メタノール2:1、例えば 15〜100ミリリットル、v / v）でTLC現像室の底部、並びにTLCプレートの下縁組覆うようにチャンバー内。
    2. 商業を使うcially可能なガラスTLCは、箔で覆われたパイレックスビーカーや保存瓶（蓋で利用可能なさまざまなサイズ、）チャンバを開発する。
    3. アルミニウムまたは利用可能な現像室に合わせて、様々なサイズ（20センチのX 20センチメートル以下）に来るプラスチック担保（フレックス）シリカゲルプレートを、カットするはさみを使用してください。 （注意：吸入するとシリカは、肺の損傷を引き起こす可能性シリカに皮脂が出るのを避けるためにドラフト内で作業し、手袋をTLCプレートを処理します。）
    4. チャンバ壁に立てかけトップスと、チャンバー内にプレートを挿入します。プレートは互いに接触しないようにしてください。室内をカバーし、溶媒を毛細管現象によって、プレートを上に移動してみましょう。
    5. 溶媒をプレートの上部に到達したときに、チャンバからプレートを取り外し、溶媒が蒸発するまでヒュームフード内で起立位置​​に配置する。
    6. 不純物が目に見えるの下に黄色の帯を探すことによって、TLCプレートの上部に移動したかどうかを確認します光、紫外線（UV）光下での蛍光バンド（「不純物前」または図2BのIFを参照してください）。プレートの大部分は依然として黄色味を有する場合に、洗浄工程を繰り返す。
    7. チャンバーからTLCプレートを除去した後、溶剤を捨てる。残留溶媒は、プロトコル2用のチャンバーを使用する前に完全に蒸発することができます。
    8. シリカ上の化合物16の移動に影響を与えることができる残留水分を除去するために、100°C（19センチ×20センチ板10〜15分間、7センチメートル×10cmプレートで5分間の乾燥オーブン中で直立板を支える）。
    9. 100℃の乾燥炉を使用できない場合は、より低い温度（60℃、 即ち 40分）でのより長時間熱板。
    10. プレートが乾燥した後、それらをロードする前に、周囲温度まで冷却してみましょう。

3。抽出分離のためのチェンバースを開発する準備

  1. 少しチャンバ高下の濾紙、幅約半分のチャンバ周囲をカットするはさみを使用してください。本論文では、このように分離1の再現性を向上させる、チャンバ壁を溶剤および溶剤蒸気とのチェンバーを飽和描く芯として機能します。
  2. ドラフト内で、（この研究のための酢酸エチル - メタノール4:1、体積/体積）の溶媒を混合する。チャンバー内に混合溶媒を注ぎ、カバーしています。全体芯が溶媒で濡れになるまでチャンバー内にプレートを入れて、チャンバー飽和を示す、待ちます。

4。 TLCプレートのロードと開発

  1. 軽く鉛筆で起源をマーク。 TLCプレートの吸着剤は柔らかく、容易に破損している場合は、エッジにマークを作る。 TLCプレートをチャンバー内に挿入されたときの化合物は、現像溶媒の表面上にあるべきである。
  2. 代わりに濁っの濃縮溶液を持つように十分な有機溶剤（この場合は、メタノール）での抽出物を溶解させるサスペンション。
  3. プレートの側面に1cmのボーダーを残しマイクロシリンジまたはキャピラリーマイクロピペットと狭帯域などの負荷サンプルと標準。バンドは（ドラフト内でプレートをあおるか、それをロードすることができます）乾燥させます。
  4. サンプルの高い濃度は、乾燥したバンドで再度サンプルをロードすることによって、プレート、「overspot」に必要な場合。
  5. ピンセットやトングで、飽和TLC室内プレート（複数可）を設定します。それはこのように、化合物の移行のパスを変更すること、接触点でプレートに溶剤を提供する可能性があるため、プレートを芯に触れないようにしてください。室内をカバーし、プレートを開発してみましょう。

5。バイオアッセイ用プレートの作製

  1. 溶媒先端がプレートの最上部に到達する前に、TLCタンクからプレートを取り外して、鉛筆で溶媒先端の​​高さをマーク。ドラフト内でプレートを乾燥させる。
    1. GEと同じTLCチャンバー内に残っているTLCプレートを開発閉じたままかどう全体の日のnerally使える。チャンバ内の溶媒の量が顕著に減少した場合TLCチャンバーのための溶媒の混合物を作り直す。
  2. プレートが乾燥した後、可視光または紫外光の下でバンドを可視化し、鉛筆でバンドを描く。ポータブルUVランプで表示する室は、ランプが254ナノメートル（短波長紫外線）と365 nmの（長波長紫外線）の両方で化合物を検出することができる場合は特に便利です。
    注：この時点で、または次の工程の後に、プレートをホイルで覆い、プラスチックラップでラップすることができ、-20℃で保存最大蓄積時間は、化合物の安定性に依存している。シリカは中立的ではないので、いくつかの化合物は、TLCプレート上でしばらく低下することがあります。
  3. 写真やプレートを描く。
    1. オーバーヘッドUVおよび/または可視光を搭載した1が利用可能な場合はゲルphotodocumentationシステムを使用しています。
    2. 商用photodocumentationシステムが使用できない場合、暗い紙や布を敷いた箱の内部写真プレート、ウィスコンシン州三脚にカメラをセットし、携帯用のUV光を17番目のリングスタンドにクランプ。全く蛍光指示薬を持っていないプレートを撮影すると、バンドの外観17を改善するためにカメラのレンズを介して青色光フィルターを使用しています。
  4. 特徴付けるバンドを助けるために、化合物および溶媒先端が移動した距離を測定し、後者（ 図2A）によって、前者を分割して保持係数（R f）の値を計算する。

6。細菌培養およびアッセイ

  1. 準備し、嫌気的条件下でメディアを接種する。この場合に使用される文化は、ジェームズ·B.ラッセル、コーネル大学、ニューヨーク州イサカの培養コレクションから得られたクロストリジウムsticklandiiひずみSR、だった。
    1. Flytheとケーガン13とHABの媒体の説明のための材料のリストを参照してください。
  2. 指数関数的または定常期に文化を育てる。無菌嫌気techniquを使用ES嫌気性微生物を扱う。
  3. 60℃未満まで減少した寒天（V / Wの0.75％）の温度が溶融寒天に（1％v / v）の培養物に接種穏やかに混合し、すぐに注ぐた ​​めに嫌気性チャンバー（HABメディアの95％がCO 2 -5％H 2雰囲気）に持ち込む。
  4. 15ミリメートル×100ミリメートルのプラスチックペトリ皿に注ぎ、固化することを可能にする。
  5. はさみで、目的のバンドを含有するゾーンにTLCプレートをカット。バンドは、TLCプレート上に元の方向を追跡するために、バッキングプレート上にマーキングバンドを、寒天プレート上に下向きに横たわっ。コントロールとして寒天プレート上に未使用のTLCストリップを置く。
  6. 嫌気性チャンバー（24時間、39℃）で、ダウン寒天プレートをインキュベートし、寒天側。

7。バイオアッセイ寒天プレートの可視化

  1. 彼らは嫌気室にいる間鉗子で、寒天プレートからバンドを削除します。
  2. 1％の追加（w / v）のテ水中で調製trazolium赤は、寒天プレートの表面に滴下した。色は、少なくとも20分間開発できるようにするか、制御板は、嫌気性チャンバーから取り外す前に、完全に赤に変わるまで。嫌気性細菌はすぐに嫌気槽から取り出し、実行可能性を失い始めますが、色は24以上の時間安定している。
  3. 可視光下で撮影しています。

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結果

レッドクローバー（ アカツメクサ品種 。Kenland）抽出物、フェノール化合物を含有する、の代表的なシリカTLC分離は、 図2に示されている。酢酸エチル-ヘキサン中レッドクローバー抽出物の分離は（9:1、v / v）で、8.5を超えるセンチメートル、5つのバンド、不完全原点から解決一方（ 図2A）をもたらした。しかし、 図2（b）は、レッドクローバーエキス（同じ品種、同じ農場で別々のプロットで栽培さ）の異なるサンプルはより長い距離にわたって分離（15センチメートルの代わりにしたときの約2倍の多くのバンドが明らかにされたことを示している8.5センチメートル）と異なる溶媒系における2つの連続発展とともに。次いで、酢酸エチル-ヘキサン中で最初に開発された図2Bのクロマトグラム（9:1、v / v）を、乾燥させ、酢酸エチル-メタノールで分離（78:22、v / v）であった。これらの結果は、溶媒系（溶媒又は複数の一連のプレートサイズと選択の両方ystems）クロマトグラム上で分離した化合物の...

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ディスカッション

このプロトコルは、化合物の部分集合に抽出分離し、接触バイオオートグラフィーにより、これらのサブセットを分析するための簡単​​な方法を説明します。この方法は、淋病を引き起こす細菌に対する阻害植物代謝をスクリーニングするChomnawang ら 15によって使用されるものとよく似ています。抗菌植物化合物をスクリーニングするために使用されるバイオオートグラフィーのタイプは、試験微生物、実験のセットアップ、およびバイオアッセイを行う人（S）の好みを含む多くの要因に依存します。コンタクトバイオオートグラフィー、本研究で用いた方法は、接種されたメディア12内に拡散する化合物の能力に応じてのために批判されている。成長が透析物下の寒天中に発生した場合に、低濃度での化合物の上阻害、またはメディア内に拡散するために少し機能を備えたのゾーンは、検出できないことがあります。また、一つのバンドが作成した阻害ゾーンは、バンドの初期を超えて広がる可能性があります境界は、従って、おそらく、隣接化合物14で作成された阻害ゾーンをマスクする。しかし、コンタクトバイオオートグラフィーを使用す...

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開示事項

記事の商号または商用製品に関する記述は、特定の情報を提供する目的のためだけで、米国農務省による推奨や保証を意味するものではありません。著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

謝辞

私たちは、私たちは、この研究のために彼の赤いクローバーのプロットからサンプルを使用できるようにするための、ケンタッキー大学遅く博士ノーム·テイラー、専攻植物や土壌学に感謝。このプロジェクトは、米国農務省によって資金を供給された。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
シリカF254 TLCプレート、アルミニウム裏打ち、厚さ0.2 mm、20 cm x 20 cmEMDケミカルズ5554/7これらのプレートは、254 nmで蛍光を発するインジケーターを含むシリカでコーティングされています。 その波長で吸収する化合物は、蛍光グリーンの背景で暗く見えます。 その他の情報源には、Analtech、Selecto Scientific、Flukaなどがあります。 シリカ以外の吸着剤が必要な場合があります。 使用する溶剤によっては、プラスチックで裏打ちされたプレートが適している場合があります。 
鋭利で頑丈なはさみ Fiskars 175800-1002に類似した縫製供給会社TLCプレートの切断用 刃が鋭利なペーパーカッターも使えます。 シリカ粉塵を吸い込まないでください。
100°Cの乾燥オーブン。C(機械的対流)Thermo ScientificPR305225MQuincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com);Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)
TLC chamberKimble Chase416180-0000代替ソース: オールドリッチ。Pyrexビーカーまたは保存瓶は、小皿(つまり、5 cm x 10 cm)に使用できます。 アルミホイルで覆います(ジャー容器の蓋には、溶剤蒸気によって抽出可能な材料が含まれている場合があります)。
50 マイクロ;l フラットニードルチップ付きシリンジハミルトン80965標準またはサンプルの負荷量が5-10を超える場合 µl. 代替ソースは同等です。
マイクロピペットDrummond2-000-001少量の標準品またはサンプルのロード用 代替ソース: VWR. また、パスツールピペットは、ブタントーチを使用してより細い直径に伸ばすことができます。 
ろ紙(#1グレード)Whatman1001 917チャンバー芯として機能します。 他のグレードの濾紙はOKです。このサイズは、20 cm x 20 cmのプレートを保持するチャンバー用にトリミングできます。    
ビーカートングフィッシャーサイエンティフィック15-186大きなTLCチャンバーにプレートを出し入れするため。 代替ソース: VWR 
フラットエッジ鉗子フィッシャーサイエンティフィック10-275小さなチャンバーにプレートを出し入れするため。代替ソース: VWR
短波および長波UV光照明用の4Wまたは6W電球を備えた小型ポータブルUVランプ (それぞれ254nmと365nm)紫外線 製品95-0271-01代替ソース: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)
ハンドヘルドUVランプで使用するためのビューイングキャビネット紫外線製品Chromato-Vue C-10EUVアクティブバンドは、ここにプレートをセットできると、丸で囲まれやすくなります。 代替ソース: Spectronics Corporation. 
オーバーヘッドUVランプと可視ランプを備えたフォトドキュメンテーションシステムKodakGel Logic 200 代替ソース:紫外線製品(www.uvp.com). 自家製の代替品については、プロトコルを参照してください。
嫌気性チャンバー、タイプA、ビニールコイ7150000このチャンバーは、説明されているように、Clostridium sticklandiiのような嫌気性細菌に適しています。  ただし、成長条件は、アッセイで使用される生物に合わせて調整する必要があります。病原性生物を使用する場合は、バイオセーフティキャビネットやその他の予防措置を講じる必要があります。その他の情報源:Anaerobe Systems、BioRad、Plas Labs、その他 
テトラゾリウムレッドSigma-AldrichT8877代替供給源: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar
Ingredients for HAB media
>Pyridoxamine · 2HClSigma-AldrichP9380この表の他のすべての試薬については、代替供給源は同等です。
リボフラビンSigma-AldrichR4500
チアミンHClSigma-AldrichT3902
ニコチンアミドSigma-AldrichN3376
カルシウムD-パントテン酸Sigma-AldrichC8731
リポ酸 Sigma-AldrichT5625
p-アミノ安息香酸 Sigma-AldrichA9878
葉酸Sigma-AldrichF8798
ビオチンSigma-AldrichB4639
コバラミン Sigma-AldrichC3607
ピリドキサールHClSigma-AldrichP9130
ピリドキシンSigma-AldrichP5669
EDTASigma-AldrichE6758
硫酸鉄 & ミッドドット 7H2OSigma-AldrichF8263
硫酸亜鉛 &ミッドドット 7H2OSigma-AldrichZ0251
塩化マンガン & middot; 4H2OSigma-AldrichM8054
ホウ酸Sigma-AldrichB6768
塩化コバルト · 6H2OSigma-AldrichC8661
塩化銅 & middot; 2H2OSigma-Aldrich
塩化ニッケル · 6H2OSigma-Aldrich203866
モリブデン酸ナトリウム · 2H2OSigma-Aldrich331058
Trypticase(カゼインの膵臓消化物)サーモフィッシャーB11921
リン酸カリウム一塩基性無水サーモフィッシャーP284
炭酸ナトリウム & ミッドドット;H2O サーモフィッシャーS636
寒天モフィッシャー50841063
硫酸マグネシウム & 6H2Oサーモフィッシャー7791-18-6
塩化カルシウム & 2H2OサーモフィッシャーBP510
システイン HClサーモフィッシャー19464780
カリウムリン酸塩二塩基性無水サーモフィッシャーP290
ナトリウムサーモフィッシャーBP358
459097サー塩化

参考文献

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