安定同位体標識するための還元ジメチル化を用いた定量的プロテオミクス

Summary

還元ジメチル化（REDIラベリング）によるペプチドの安定同位体標識は、正確な質量分析に基づく定量的プロテオミクスのための迅速、安価な戦略である。ここでは、ほぼすべてのサンプルタイプに適用することができるのRediアプローチを使用してタンパク質混合物の調製および分析のためのロバストな方法を示す。

Abstract

還元ジメチル化（ラベリングのRedi）によるペプチドの安定同位体標識を正確に質量分析を使用して試料間のタンパク質発現の差異を定量化する方法である。 REDI標識は、各フリーアミンに2個のメチル基を追加するために、ホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムを定期的に（光）または重水素化（重）の形式のいずれかを使用して実行されます。ここでは、REDI標識および複雑なタンパク質混合物の定量的な比較のための堅牢なプロトコルを示しています。比較のためのタンパク質試料を光や重いメチルタグ、混合し、LC-MS/MSによって共同で分析のいずれかを実行するために標識されたペプチドの中に消化される。タンパク質の相対存在量は、全MSスペクトルから抽出された成分ペプチドの重鎖及び軽標識バージョンのイオンクロマトグラムのピーク面積を比較することにより定​​量される。ここで説明する方法は、塩基性のpH REVによる逆相固相抽出によるサンプル調製、ペプチドのオンカラムREDIラベル、ペプチド分画を含んでいるersed相（BPRP）クロマトグラフィー、およびStageTipペプチド精製。当社は、安定同位体の組み込みのための他の方法に関してREDIラベルの利点と制限について説明します。我々は、サンプルのほぼすべてのタイプの中のタンパク質の存在量を比較するために、高速で安価な、そして正確な方法としてREDIのラベリングを用いた新規のアプリケーションを強調表示します。

Introduction

複雑なサンプル間の多くのタンパク質の濃度差を測定するプロテオミクスにおける中心的な課題である。ますます、このことは、異なる同位体タグを各試料中のタンパク質を標識するサンプルを結合し、濃度差を定量化するために質量分析法を用いて行われている。いくつかの方法がタンパク質およびペプチドの安定同位体標識のために存在しています^。15 N標識の¹やSILAC ² ICAT ^3、のiTRAQ ^4、還元ジメチル化^5は、タンパク質の抽出および消化後に安定同位体タグを追加する一方で、 生体内で代謝的に同位体標識を導入。これらの方法の中でも、還元ジメチル化（ラベリングのRedi）は、サンプルのほぼ任意のタイプのタンパク質濃度の違いを定量化するための安価な、再現性のある方法として人気を集めている。

REDI標識は、その後減少するシッフ塩基を形成し、ホルムアルデヒドとペプチドを反応させることを含むシアノ水素化による。この反応は、N-末端およびリジン側鎖およびmonomethylates N-末端のプロリンに遊離アミノ基をdimethylates。ここで説明するプロトコルは、重水素化ホルムアルデヒドとシアノ水素化ホウ素（ 図1）を使用して、「重い」のラベルとの天然の同位体分布とサンプル2の水素原子を有する試薬を使用した「光....

Protocol

注：この方法は、以前に^12を説明した。

1。タンパク質の単離

好ましくは、フレンチプレス、ビーズビーティング、または超音波のような物理的方法により、細胞を溶解することによって細胞タンパク質1mgを準備します。酵素は、質量分析の測定を混乱されますので、リゾチーム媒介細胞溶解を避けてください。

タンパク質の2。TCA沈殿

タンパク質を沈殿さ10分間氷上で4倍量のタンパク質と寒さに1ボリュームトリクロロ酢酸（TCA）を追加します。 4℃で5分間、12,000×gで遠心分離し、上清を取り除く。 4℃で5分間、12,000×gで氷冷アセトン及び遠心分離機の1ml中にペレットを再懸濁上清を除去し、15分間、ペレットを乾燥させるためにベンチにチューブを反転させる。 -80℃での店舗タンパク質ペレット

3。変性タンパク質ジスルフィド結合を還元

リタンパク質をサスペンド500μlの変性および還元緩衝液中で約2 mg / mlの（50mMのHEPES pH8.5で、5mMのDTT中4 M尿素または3％SDSのいずれか）である。任意選択で、緩衝液中のプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。室温で10分間、続いて56℃で30分....

Results

私たちは、Saccharomyces cerevisiaeを使用して正確さ、精度、およびREDIラベルの再現性を評価し、 クロストリジウムは、全細胞溶解物をphytofermentans。まず、CのミックスのRediの標識効率を定量化セルロース（重ラベル、H）とグルコース（光ラベル、L）の培養物からタンパク質溶解物をphytofermentans。 1％ペプチド偽発見率に濾過する場合、このサンプルは、98％のRediの標識効率と11194のユニークなペプチド配列を含有していた。未分画S.セレビシエタンパク質溶解物は、同様に、HまたはLの試薬 ​​で標識された様々な比率で混合し、そして分析した。タンパク質発現の違い_（2）（中央値MS1ピーク面積を記録）再現性H及びLサンプルは比（ 図3）を混合するの広い範囲にわたって混合した時の比を反映する。具体的には、タンパク質の99％の倍率変化を、1:1の混合試料に対して1.6倍よりも小さいようにして測定した。で1:10〜10時01分試料、.......

Discussion

安価な標識試薬（試薬はサンプルあたり1ドル未満のコスト）、速い反応速度（〜10分）、副生成物が存在しない場合、高：いくつかのポイントが還元ジメチル化を使用して、ペプチドの安定同位体標識（REDIラベリング）定量的プロテオミクスのための魅力的な方法を作る再現性（ 図3、図4）、安定した反応生成物、任意のプロテアーゼを使用する能力、および標識されたペプチドのイオン化効率が高い。それは、特定のアミノ酸栄養要求性または合成培地上で増殖した株又は細胞系を必要としないためのRediによる化学的標識はまた、代謝標識に有利相対的である。このように、いくつかのRediは、変異株は他の¹⁵のうち¹³およびヒト幹細胞¹⁴入手可能な新規な微生物¹²を含むタンパク質試料のほぼ任意のタイプに適用することができる。

REDIラベルの制限は、OTと比較したサンプルを多重化する低機能ですこのような現在までの8つのサンプルを同時に^16を定量化することができるため同重体標識（.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
トリクロロ酢酸	Sigma-Aldrich	T9159	タンパク質沈殿
アセトン	Sigma-Aldrich	650501	タンパク質沈殿
デシル硫酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	71736	変性、タンパク質
酸化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S8045	変性、タンパク質
DL-ジチオスレイトール	を減少させるSigma-Aldrich	43816	性、還元、アルキル酸タンパク質
プロテアーゼ阻害剤コンプリートミニカクテル	ロシュ	4693124001	変性、タンパク質
ヨードアトアミド	させる Sigma-Aldrich	I6125	アルキル酸タンパク質
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	再懸濁、抽出、標識タンパク質
塩化カルシウム	Sigma-Aldrich	C5670	タンパク質の再懸濁
リジルエンドプロテアーゼ	和光ケミカルズ	129-02541	タンパク質消化
シーケンシンググレード トリプシン	プロメガ	V5111	タンパク質消化
酢酸	Sigma-Aldrich	320099	タンパク質消化
トリフルオロ酢酸	Sigma-Aldrich	299537	逆相ペプチド抽出
tC18 Sep-Pak C18 カートリッジ	ウォーターズ	WAT054960	相ペプチド抽出
抽出マニホールド	ウォーター	ズWAT200609	逆相ペプチド抽出
アセトニトリル	Sigma-Aldrich	14261	各種
ホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	252549	"ライト」ペプチド標識
シアノ水素化ホウ素	Sigma-Aldrich	71435	"ライト」ペプチド標識
水素化ホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	492620	"重い"ペプチド標識
シアノホウ素添加	ナトリウムCDN同位体	D-1797	」重い"ペプチド標識
MES	Sigma-Aldrich	M3671	ペプチド標識
C18-HPLC カラム (4.6 x 250 mm, 5 µm 粒子サイズ)	Agilent	770450-902	塩基性 pH 逆相クロマトグラフィー
ギ酸	Sigma-Aldrich	399388	さまざまな
C18 エンポア ディスク	3M	14-386-3	ステージのヒント
メタノール	Sigma-Aldrich	494437	STAGEのヒント