直接の系譜 - 再プログラミングのための脳常駐細胞を標的とすることは、脳の修復のための新たな視点を提供しています。ここでは、成人の大脳皮質から脳常駐周皮細胞について濃縮文化を準備し、転写因子Sox2のとASCL1のレトロウイルス媒介発現によって誘導神経細胞にこれらを変換する方法のプロトコルについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
誘導された神経細胞（INS）への非神経細胞の直接系譜再プログラミングは、神経発生の基礎となる分子メカニズムへの洞察を提供し、in vitroでのモデル化や病気の脳を修復するための新たな戦略を可能にすることができる。 INSへの直接変換の影響を受けやすい脳常駐非神経細胞型、 すなわち損傷した脳組織の中に、 その場でこのようなアプローチを起動可能にするかもしれません識別する。ここでは、この前提を満たすヒト成人脳由来の細胞を同定する試みで開発されたプロトコルを記述します。このプロトコルは、含まれます。成人の脳生検から得た大脳皮質からのヒト細胞の（1）を培養し; （2）in vitroでの拡大（約2〜4週間を要する）と、免疫細胞による文化の特性評価およびフローサイトメトリー; （3）（FACS）を蛍光活性化細胞ソーティングによる濃縮を、抗PDGF受容体-βおよび抗CD146抗体を用いた;（4）神経原性転写因子SOX2とASCL1とレトロウイルス媒介形質導入を。 （5）、最後に免疫細胞化学（レトロウイルス形質導入後8週間〜14日間）による結果の周皮細胞由来の誘発性神経細胞（PdiNs）の特徴付けを。この段階では、INSは、パッチクランプ記録により、その電気的特性のためにプローブすることができる。このプロトコルは、機能的なヒトINSに脳常駐周皮細胞のin vitro系統の変換のため、再現性の高い手順を説明します。
概要
次に、分化能の過多に恵まれている人工多能性幹細胞（iPS細胞）中に体細胞の再プログラミングとは対照的に、直接再プログラミングは、他に一つの特定の細胞型の直変換を目指す。疾患モデリングおよび電位細胞ベースの治療の文脈におけるそれらの適用に関しては、両方の再プログラミングのアプローチは、特定の利点及び欠点を有する。 iPS細胞に再プログラミング（i）は、細胞の事実上無限の源を提供する; （II）遺伝子工学を可能にし; （III）は、ほぼ無限の分化能を賦与。これらの細胞は細胞ベースの治療のために使用される場合は、iPS細胞の主要な欠点は、未分化細胞（ インビボでのテラトーマ形成）の腫瘍形成性および ex vivo培養およびその後の移植の必要性の危険性を伴う。逆に、直接の系譜再プログラミングは、所望の細胞の低収量によって制限されている出発集団の標的とされた細胞の数と直接相関するが、系統再プログラムされた細胞は、移植の1,2に何ら腫瘍形成のリスクを示さないように見える利点を有している。さらに、直接の再プログラミングにも従って、移植の必要性を回避する、 すなわち、これらの細胞が必要とされる器官内の、 その場で達成することができる。
これを念頭において、私たちの研究室では、神経変性疾患の細胞ベースの治療に向けた新たなアプローチとして、INSに、系統再プログラミング脳常駐細胞の可能性を追求してきた。脳常駐系統再プログラミングのための細胞標的は大膠細胞（アストロサイト、NG2細胞およびオリゴデンドロサイト）の異なるタイプを含むように、潜在的に考慮することができる細胞、小膠細胞、および微小血管に関連する細胞（内皮細胞および周皮細胞）。私たちは、脳CORのアストログリアのin vitro再プログラミングの可能性を徹底的に研究している生後初期のマウス3-5の TEX。成人の脳内での直接の系統再プログラミングについても同様に適切な細胞源を求めて、我々が正常にインと周皮細胞の展示ホールマークに再プログラムすることができる細胞集団を検出しました。ここでは、拡張し、in vitroでこれらの細胞を豊かにし、最終的に成功してに（25から30パーセントの範囲）これらのin vitro増殖した細胞のかなりの割合を再プログラムするために、成人の脳生検から、これらの細胞を採取する方法のプロトコルを記述INS。再プログラミングは、2つの転写因子、およびSOX2 ASCL1の同時レトロウイルス媒介性の同時発現によって達成することができる。これらPdiNs、反復活動電位発火の能力を獲得するためにニューラルネットワークへの統合の彼らの能力を示す他のニューロンのためのシナプス標的として役立つことが分かった。我々のプロトコルは、INSに成人のヒト脳ペリサイトを単離および系統変換のための簡単な手順を説明します。
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プロトコル
1。単離と成人の脳細胞の培養
ヒト組織を含む実験は、研究目的のためにヒトの材料の使用に関するすべての関連する政府や機関の規制に従って行われるべきである。この議定書は、LMUミュンヘンの医学部の倫理委員会とすべての患者から書面によるインフォームドコンセントの承認に基づいて開発されました。
成人の大脳皮質の準備文化のこのプロトコルは、側頭葉てんかんや他の根深い非外傷性、非悪性病変に苦しんで雌雄の患者の標本を使用して確立されています。外科室から得られた組織は、排他的に脳病変へのアクセスチャネルを構成されるため、健康的と考えられている。患者の年齢範囲は19から70歳であった。
- 熱不活性化ウシ胎児血清を添加して増殖培地を調製グルタを有するDMEM高グルコースから（FCS）、20％FCSの最終濃度を得た。 500ミリリットルの成長培地の合計に5ミリリットルペニシリン/ストレプトマイシンを追加します。この、適切な層流フード内で無菌培養条件を必要とするすべての後続の手順を実行します。
- 処理まで氷上でHEPES（10mMの最終濃度）を含む塩化カルシウムとのハンクス溶液中の手術室から得た成人の脳生検及びMgCl 2（HBSS）メディアを保管してください。できるだけ速やかに処理を開始する。
- 単一細胞に解離を開始するには、2の滅菌使い捨てメスを使って、小さな断片に65ミリメートルペトリ皿とミンチに組織を移す。酵素消化のために15ミリリットルの円錐管中で3〜6ミリリットルのTrypLEを使用し、水浴中で37℃で15〜30分間インキュベートする。
- 解離を促進するために温めておいた増殖培地の1容量を加え、穏やかに最初の使用して上下に組織片を含む溶液を粉砕する細胞懸濁液の均質化するまで、ガラスパスツールピペットを用いて、続いて5ミリリットル使い捨てピペット。一般的には、主に白質からなるいくつかの残存組織片は、サスペンションのままになります。
- 5分間157×gでスピンダウンし、成長培地の適切な量（コーティングされていないT75培養フラスコ当たり10ミリリットル）でペレットを再懸濁します。サイズが5〜10mmの直径の生検に対して1つのT75培養フラスコを使用し、より大きな標本の場合には、このから外挿する。
- 5％CO 2および5％O 2、37℃のインキュベーター内に細胞を置く。
- 細胞がコンフルエントに達するまで3〜4日ごとに培地の半分を交換してください。これは通常、二週間（継代0 [P0]と呼ぶ）まで行われる。
成人の脳細胞の2。 インビトロ増殖および特性評価
- インビトロ増殖中 。
- 培養培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、室温tに保っemperature、3ミリリットルののTrypLEを追加する前に。
- ほとんどの細胞が分離するまで5〜10分間37℃でインキュベートする。優しく細胞の持ち上げを容易にするために、フラスコをタップ。成長培地の3倍量の添加後に15mlのコニカルチューブに細胞を移し、5分間、157×gでスピンダウンし、成長培地の適切な量で細胞を再懸濁する。
- 流路新しいT75細胞培養フラスコに最適な歩留まりのための1:3の割合の細胞。
注意：我々は、削減、再プログラミング効率の兆候なしに、P5まで、これらの細胞を継代しています。 P0での培養は、内皮細胞（CD34発現により評価される）のかなりの部分を含んでいるが、その後の継代ではその数は無視できるようになる。
- 成人の脳の文化の特徴付け：
- 免疫細胞化学：
- ポリ-D-リジンコートガラスカバーの上に細胞、種子〜60,000細胞の特徴のために、500μlの新鮮な増殖mediuでスリップ24ウェル組織培養プレート中mおよび5％CO 2および5％O 2、37℃でインキュベートする。
- 培養ヒト脳細胞の免疫細胞化学的分析のために培地を除去し、1mlのPBSで3回洗浄する。
- 室温で15分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド500μlの添加によって細胞を固定する。
- ガラスカバーは、適切な染色加湿チャンバーに移し、スリップ80μlのPBSを室温で1時間3％ウシ血清アルブミン（BSA）および0.5％トリトンX-100を含有するブロック。
- 同じ溶液で希釈した一次抗体を追加する（希釈因子は、特定の試薬および装置の表を参照）と4℃または室温で1時間で一晩インキュベートする。
注：培養のこの段階で細胞の実質的な画分は変化させることなく、血小板由来増殖因子受容体β（PDGFRβ）、分化146（CD146）のクラスター、NG2コンドロイチン硫酸プロテオのために免疫反応性であるグリカン、および平滑筋アクチン（SMA）、微小血管関連周皮細胞の特性すなわちマーカー。少数のみ（<1％）のアストログリアマーカーグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）およびS100βを発現する。さらに、この段階では文化が神経マーカーβIII-チューブリンを発現する任意の細胞を欠いている必要があります。異なるマーカーの同時標識のために複数の一次抗体の組み合わせを使用してください。グリア細胞、神経細胞、内皮細胞および周皮細胞マーカーの発現のさらなる確認は、逆転写および（このプロトコールに記載されていない）、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応により得ることができる。 - 一次抗体とのインキュベーション後、1mlのPBSで3回洗浄し、染色溶液（適切な希釈において）対応する二次抗体を添加し、暗所で室温で1時間インキュベートする。細胞をPBSで3回洗浄します。必要に応じて、取り付け前には部屋で5分間DAPIで染色を含める温度。
- 封入剤を使用し、退色防止エピ蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡を用いてカバースリップを分析。
- フローサイトメトリー：
- フローサイトメトリーによる表面マーカー発現の分析のために、コーティングされていないT25又はT75細胞培養フラスコ中でコンフルエントになるまで細胞を増殖させる。
- PBS + 0.5％BSAからなる染色溶液に再懸濁する前に記載したようのTrypLEを用いて細胞を剥離。染色反応あたり、染色液100μlに10〜20万細胞を再懸濁。使用した抗体ごとに単一の染色反応（CD146-FITC、抗CD140b-PE、CD34-APC、CD13-FITC、それぞれのアイソタイプコントロール抗体）を準備します。
- 直接細胞懸濁液に（希釈は特定の試薬や機器の表を参照）、各染色液に蛍光色素標識抗体を加え、暗所で30分間、4℃でインキュベートする。
- 500μlのPBSで細胞を3回洗浄し、それぞれの間にスピンダウン5分間157×gで洗浄工程。
- FACSチューブにセルストレーナー（70ミクロン）を介して0.5〜1ミリリットル染色溶液および転送細胞で細胞ペレットを再懸濁する。光への暴露からサンプルを保護します。
- 前FACS装置に置くことに渦のサンプル。
- 生きた細胞を分析し、破片や細胞集合体、FSC-AおよびSSC-Aのゲートを除外します。細胞デュプレットは、特にFSC-AとFSC-Wでゲートアウトされています。それぞれの蛍光色素に結合させアイソタイプ一致抗体コントロールでゲートを設定する細胞表面マーカーのための右のゲート条件を決定する。その後、抗体結合細胞の割合を決定する。
- 免疫細胞化学：
3。蛍光による周皮細胞由来細胞の濃縮には、活性化細胞選別
- FACSは、70μmのノズルを用いてソーティングを介して形質導入前に（増殖培地中に再懸濁させ）、周皮細胞集団を精製する。 C言語との組み合わせで、CD34-APCを使用D140b-PEおよびCD146-FITCは、周皮細胞を選択した。 CD34陰性、抗CD140b-、およびCD146陽性細胞のソート。
- 24ウェル組織培養プレート中にスリップポリ-D-リジンコートカバーガラス上に増殖培地プレートで選別された細胞を収集し、5％CO 2および5％O 2、37℃でインキュベートする。
- ソート後の48時間は、新鮮な増殖培地で培地を交換し、プロトコル4で説明したように伝達を行う。
4。レトロ周皮細胞由来細胞の形質導入およびリプログラミング誘導された神経細胞に
注意：レトロウイルス粒子を扱う地元のバイオセーフティのガイドラインを参照してください。ドイツでは、ここで使用されるレトロウイルスの使用は、生物学的安全性レベル2を必要とする。レトロウイルス粒子の産生がプロトコル6を参照してください。再プログラミングのために使用されるレトロウイルス構築物について、Karow らを参照してください。（2012年）。レトロウイルスは、VSV-G（水疱性口内炎ウイルス糖で偽だったタンパク質）5。生産のためにGavrilescu ら 6を参照してください。
- 従来のポリ-D-リジンコーティングガラスカバー上にレトロウイルス形質導入種子〜60,000細胞に24時間、24ウェル組織培養プレートに500μlの新鮮な増殖培地中にスリップし、5％CO 2および5％O 2、37℃でインキュベートする。 。
- 翌日、500μLの新鮮な、あらかじめ温めておいた増殖培地で増殖培地を交換し、レトロウイルス粒子を含むそれぞれの集中上清を1μlを追加します（特に、研究室でのプロトコルを確立する時に、制御のためのpCAG-IRES-DsRedを ）のpCAG-ASCL1のpCAG-SOX2-IRES-GFP-IRES-DsRedを 。
- 1日後、細胞からのウイルス粒子を含む培地を除去し、新鮮な1ミリリットルを加え、グルタマックス49ミリリットルDMEM高グルコースと1ミリリットルのB27の無血清サプリメントで構成される、B27-分化培地を予め温め。 5中、37℃で培養中の細胞を維持する％のCO 2とINSが成熟するにつれて、繰り返しの媒体の変化が有害になる等の媒体を変更することなく、4〜8週間で5％のO 2。
免疫細胞により誘導された神経細胞の5。キャラ
- （抗体およびそれぞれの希釈のために、特定の試薬の表を参照して、形質導入細胞の細胞同一性を決定するために、特定の神経表現型の獲得を実証するために、このようなBIII-チューブリン、MAP2およびNeuNのような神経抗原に対する免疫細胞化学を実施し、機器、2.2.1で示したのと同じ手順に従ってください）。
- E14マウス大脳皮質から派生したニューロンとPdiNs、共培養これらの細胞の成熟を向上させるため。そのためには、大脳皮質を解剖し、火研磨されたガラスパスツールピペットを用いて機械的に組織を解離する。 SOX2とASCL1再エンコードした形質導入後周皮由来細胞2〜3週間の培養に10,000-50,000ネズミの神経細胞を追加troviruses培養を続ける。形質導入された細胞は、ライブエピ蛍光によってまたはGFPとDsRedのための免疫細胞を、次のいずれか、そのレポーター（GFPとDsRedの）式でネズミの神経細胞と区別することができる。
- マウスの神経細胞でPdiNs上にシナプスの形成を評価するために、このような小胞グルタミン酸輸送体1（VGLUT1）などの小胞の神経伝達物質受容体に対する免疫細胞化学を行う。
- その電気的特性（活動電位を発生させるすなわち能力）およびパッチクランプ電気生理学による機能シナプスの確立のための形質導入した細胞を探る。手順の詳細については、ハインリッヒら （2011）を参照してください。
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結果
首尾成人の大脳皮質の標本からの培養を確立した後、このプロトコルの最初の成果は、文化の細胞組成を同定することにある。細胞型特異的なタンパク質のための免疫細胞化学は、異なる患者（ 図1A）の検体から派生文化間の異質性のかなりの程度を明らかにしている。フローサイトメトリーによって定量化したよう（平均で約75％、30から99％までの範囲）PDGFRβを発現する細胞のかなりの割合が常にある。このようなCD146、NG2およびCD13などの周皮細胞の他のマーカーは、一般的に低い範囲（ 図1B）で表されます。免疫細胞化学（ 図1A）によって決定されるように、同様に、SMAは、培養細胞の小亜集団において発現される。継代0（P0）で、CD34陽性内皮細胞の10％が<通常存在し、その数をさらに継代による検出の下方に低下する。同様に、astrocytESは早いパッセージでは軽微の汚染を含む。さらに、神経幹細胞、神経細胞、またはオリゴデンドロサイトマーカーについて染色ない細胞は、典型的には存在しない。免疫細胞化学およびフローサイトメトリーデータは、完全に...
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ディスカッション
この議定書は、成人の大脳皮質からの分離と神経性転写因子Sox2のとASCL1のレトロウイルス媒介発現によるINSへのその後の変換次の周皮由来細胞のin vitroでの拡大と充実を説明しています。このようなプロトコルは、最終的には成人の脳のin vivoの設定に、この直接変換方式を変換する念頭に置いて目標に、神経細胞に脳常駐細胞の系譜変換を研究し、潜在的にグリアするin vitro系での実験を提供しています。
技術的な考慮事項
私たちの研究では、男女ともに、19〜70歳の患者からのヒト脳組織を利用した。私たちは、性別や年齢に応じて、7リプログラミング効率の明白な違いに気付かなかった。それにもかかわらず、より多くの微妙な違いは、それにもかかわらずであるとして、この情報を文書化することをお勧めします我々の注意を脱出したことを観察した。
それは、さらに研究室に組織サンプルの転送以下の可能な限り早...
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開示事項
著者らは、開示することは何もありません。
謝辞
私たちは、このプロトコルの開発中に、彼女の入力のための博士マグダレナゲッツに感謝しています。我々は寛大にSOX2コード配列を我々に提供するために博士マリウスWernig（スタンフォード大学）に感謝。また、ウイルス産生のための博士アレクサンドラLepierに非常に感謝しています。この作品は、ドイツ学術振興（4182/2-2 BE）とBMBF（01GN1009A）BBに、科学のバイエルン州立省、研究、MKとBBCSへの芸術が二国SYSTHER-から資金提供を受けたの補助金によって支えられてINREMOS仮想研究所（ドイツ語、スロベニア語、連邦教育研究省）およびDFG（SFB 824）。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 抗CD140b-PE | BDバイオサイエンス558821 | 使用1:100 | |
| 抗CD146-FITC | AbDセロテック | MCA2141FT | 使用1:100 |
| 抗CD13-FITC | AbDセロテック | MVA1270A488T | 使用1:100 |
| CD34-APC | BDバイオサイエンス | 560940 | 1:100 |
| 抗PDGFR&β; | 細胞シグナル伝達 | 3169S | は1:200 |
| 抗CD146 | Abcam | Ab75769 | 1:400 |
| 抗NG2 | ミリポア | AB5320 | を使用1:400 |
| SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | 1:400 |
| 抗ベータを使用。III-チューブリン | Sigma-Aldrich | T8660 | は 1:400 |
| 反 MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | は 1:200 |
| 反 GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | は 1:600 |
| 反 GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | は 1:1,000 |
| 反 RFP | Chromotek | 5F8 | は 1:500 |
| 反 S100&beta を使用。 | Sigma-Aldrich | S2532 | は 1:300 |
| 抗 NeuN | Millipore | MAB377 | は 1:200 |
| 反 GABA | を使用 Sigma-Aldrich | A2052 | は 1:500 |
| 反カルレチニン | ミリポア | AB5054 | 使用 1:500 |
| 抗 vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | 1:1,000 |
| ラット IgG1 アイソタイプコントロール FITC | AbD Serotec | を使用11-4301-81 | 1:100 |
| ラットIgG1アイソタイプコントロールPE | AbDセロテック | 12-4301-81 | を使用1:100 |
| ラットIgG1アイソタイプコントロールAPC | AbDセロテック | 17-4301-81 | :100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM、高グルコース、GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27無血清サプリメント | Invitrogen | ||
| ウシ胎児血清 | Invitrogen | 10106-169 | 56°Cでのインキュベーションにより熱不活性化を行います。C、30分間 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| CaCl2 および MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine臭化水素酸塩 (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA(パラホルムアルデヒド) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| ウシ血清アルブミン | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI(4′,6-Diamidin-2-phenylindole)二乳酸 | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/マウント | Polysciences | 18606-20 | |
| ポリプロピレン丸底チューブ | BD Biosciences | 352063 | |
| ポリスチレン丸底チューブとセルストレーナーキャップ | BD Biosciences | 352235 | |
| 24 ウェルプレート | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 培養フラスコ | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 培養フラスコ | Greiner Bio-One | 690175 | |
| 使い捨てピペット 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| ガラスパスツールピペット(150mm) | フィッシャーブランド | FB50251 | |
| ガラスカバースリップ直径12mm | ゼル | CB00120RA1 | |
| 外科用使い捨てメス | B. Braun | 5518083 | |
| 組織培養皿 | Greiner Bio-One | 633180 | |
| コニカルチューブ 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| 層流フード | |||
| 遠心分離機とスイングアウトローター、15 mlおよび50 mlチューブ用アダプター付き | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| フローサイトメトリー セルソーター:FACSDivaソフトウェア付きFACSAria l | BD Biosciences | ||
| Humified細胞培養インキュベーター | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACS低シース液 | BD Biosciences | 342003 | |
| 落射蛍光顕微鏡 BX61 | オリンパス | ||
| 共焦点顕微鏡 LSM710 | Zeiss |
参考文献
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