ScanLag：ハイスループットコロニーの成長の定量化とラグタイム

サマリー

ScanLagは、成長の遅延、つまり遅延時間、および数千の細胞の並行成長速度を測定するためのハイスループットな方法です。ScanLagを使用したスクリーニングにより、単一のバリアントのレベルで長い遅延時間と成長の鈍化を区別できます。

要約

成長ダイナミクスは微生物の基本的な特性です。成長を正確に定量化することは、微生物学における重要な目標です。成長ダイナミクスは、微生物の倍加時間と、ある条件から別の条件への移行による成長の遅延、つまり遅延の両方の影響を受けます。ScanLag法は、これら2つの独立した特性を、それぞれ単一の細胞に由来するコロニーのレベルで特性評価することを可能にし、遅延時間と増殖時間の2次元分布を生成します。ScanLagでは、従来の栄養寒天プレート上のコロニーが検出されるのにかかる時間の測定は、社内アプリケーションによって制御される一連の商用スキャナーで自動化されます。シャーレをスキャナーにセットし、アプリケーションが定期的に画像を取得します。その後、コロニーの成長の自動分析は、各コロニーの出現時間と成長率を返すアプリケーションによって行われます。コロニーの形状、テクスチャ、色などの他のパラメータを抽出して、細胞の亜集団の多次元マッピングを行うことができます。最後に、この方法により、特定の増殖表現型を持つ希少な変異体を検索し、さらなる特性評価を行うことができます。この技術は、抗生物質の持続性を引き起こす可能性のある長い遅延を特定するための細菌学や、表現型スクリーニングの一般的な低コストの技術に適用できます。

概要

細菌は多くのストレスの多い状況に対応するために進化してきた。ストレスへの適応の一般的な特徴は、成長のダイナミクス^1,2の変化である。指数関数的な成長速度と遅延時間、新しい条件に適応するのに必要な時間、すなわち：成長動態は、2つのパラメータによって主に特徴付けられる。ハイスループット方法の多数の成長速度の測定値に焦点を当てるのに対し、それが新たな条件への適応の特徴付けのための重要なパラメータであるが、遅延時間は、しばしば見落とさパラメータである。変化する状況への適応の定量化は、伝統的に面倒な手動の方法の^3,4を用いて行われた。より最近では、高度な技術は、単一セル^5,6の分析のために開発されてきた。しかしながら、成長の遅い成長遅延から（即ち遅延時間） ^の2,3次の正常な成長を区別することは困難である。自動化された方法はに、ScanLag ^7、構築したこれら2類似の表現型を区別。

遅延時間の分布の研究の重要性の顕著な例は、抗生物質治療の下で明らかにされる。多くの抗生物質および他のストレスは、活発に増殖する細胞を殺す、及び、従って、「遅れ」された細胞を⁸保護されている。遅れ時間を監視するためには、顕微鏡下で単一細胞を観察し、1分割までの時間を監視することができます。この方法の主な欠点は、ダイナミック時間範囲が制限されることである。早く成長している細胞を効果的により長い遅延時間を有する細胞の増殖を低下させる、指数関数的に表面を覆う。フローチャンバーの使用は幾分この^5を回避するが、限られた数の細胞を追跡することができ、人口の大部分が成長し始めた後に遅滞期を終了した細菌の割合を観察することができない。これらの制限にもかかわらず、いくつかの研究は、ジのレベルの影響を評価したfferentは単一細胞顕微鏡^9月12日を使用して、遅延時間の分布に強調している。遅延時間の分布をモニターする別の方法は、濁度測定^13,14を介してである。各々が単一の細胞から開始し、多くの並行培養は、経時的な培養中の細菌の数を測定する光学密度プレートリーダーで増殖させる。このメソッドは、外挿の精度によって、プレートのウェルの数に制限されています。

自動化された方法であっても、非常に長い遅延時間を持っている人口の中の細菌の割合が低いため、評価されるように遅延時間および成長時間の分布を可能にする、ScanLag呼ばれ、開発されました。この方法は、従来の栄養寒天プレート^15（ 図1）上のコロニーの検出に基づく。検出^16,17を定期的にプレートの画像を取得するために家のソフトウェアから指示される商用のスキャナ¹⁸の配列を自動化するために、設計されました。ソフトウェアだった画像を自動的に分析し、このような各コロニーの出現時間と80ピクセルに20ピクセルから成長するための時間として定義される各コロニーの成長時間などの定量的なパラメータ^19,20を抽出するために設計されています。ここでは、システムのセットアップ、より良いユーザインタフェースを改善されている自動画像解析ソフトウェアの使用を含め、詳細に方法を提示する。

この方法は、形態および色のようなコロニーの他の特性を測定するように構成することができる。パラメータこれらのタイプの測定は、多次元フェノミクスでのシステムの使用が可能になります。この方法は、単一細胞からのコロニーを検出すると、システムは、集団レベルの測定によって測定することができない新たな表現型を明らかにすることができる。技術は稀な亜種の検出および検索を可能にし、所望の形質についてのスクリーニングを容易にします。

プロトコル

1。セットアップの構築

1. 光学解像度のフラットベッドスキャナを選択：4,800 DPIを;ハードウェアの解像度：4800 X 9600 dpiの;カラービット深度：48ビット、該当する温度と湿度レベルで動作することができます。
2. ペトリ皿は、通常は商用のスキャナに使用される紙とは異なり、かなりのボリュームがあります。コロニーは約5mmスキャナ面の上方に、寒天層の上に横たわる。注：ほとんどのスキャナのコロニーが焦点になります。
3. スキャナの企業が同じコンピュータに同じタイプのスキャナの複数のインスタンスの接続を許可していない。複数のスキャナが付属して一意に識別できることを確認します。
4. 下記のとおりアクセサリーを準備します。
   1. 無菌ブラックの準備枚のプレートをカバーする布（ 図1のステップ2）を感じました。
   2. 所定の位置にペトリ皿を保持するために、スキャナに合う白い板ホルダ（材料と方法）を調製し、6 HOLを持っているESの皿の大きさ（ 図1のステップ3）。
5. 微生物の成長に必要な場合には、温度制御された環境でスキャナを置く。コンピュータにスキャナを接続します。
6. オプション：コンピュータにリレーを接続し、温度勾配を克服するために、スキャナのオン/オフスイッチをバイパスします。
   注：リレーユニットは非常に温度に敏感な微生物のためである。電子機器が不均一に表面を加熱しないように、それは、スキャナのスイッチを切る。スキャナ面の一部のみを使用すると、同様の結果を得ることができる。

2。スキャンマネージャをインストール

1. http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.htmlから指定されたディレクトリにすべての「スキャンマネージャ」アプリケーション·ファイルをコピーします。
2. 彼らはコンピュータの管理] - > [デバイスマネージャ] - > [イメージングデバイス（に表示されるようにスキャナ名に従ってScanningManager.exe.configファイルを設定図2）。
3. 「スキャンマネージャ」アプリケーションのトラブルシューティングについては、私を読んでファイルを参照してください。
4. 「スキャンマネージャ」アプリケーションの詳細ドキュメントについては、マニュアルライブラリを参照してください。

3。実験を行う

1. ペトリ皿（ 図1）を準備します。
   1. 約2,000 CFU / mlに文化を希釈します。プレート、プレート表面に均一に文化の0.1ミリリットル。
   2. コロニーと皿の間に良好なコントラストを得るために、湿気を吸収するために、無菌の黒の部分にプレートをフェルト布をカバーしています。プレートに蓋を置く。
2. スキャナのホルダーにプレートを置きます。
3. 付属のスキャナのリストから参加するスキャナを選択します。スキャンマネージャ（ 図3）を起動します。 （繰り返し回数）を撮影する画像の数、後続の画像間の時間間隔（時間間隔）、およびtを開始する前に時間遅延を選択する彼は（後に開始）実験。

4。画像の解析を

注：計算方法の概要をhttp://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publicationsにおける非商業的な使用のために自由に利用できる「ScanLag」を使用して、MATLABで画像を解析するために設けられている。 HTML。利用可能な更なる機能は、ソフトウェアの取扱説明書に記載されており、サンプルコードが補充される。

1. 別々のフォルダに各スキャナから画像を並べ替えます。
2. MATLABのコマンドウィンドウを使用して、次の手順を実行します。これらの手順を実行するために必要なパラメータは、ソフトウェアのマニュアルで定義されています。
   1. 前処理を実行するためにPreparePicturesを実行します。前処理では、スキャナからの画像が並んでいる。各ペトリ皿は、画像の各シーケンスからトリミングされます。各画像が収集された時刻は、タイムスタンプから取得される。
   2. Eで検出および追跡を行うために実行TLAllPlatesACHペトリ皿は、別々に、コロニーが検出され、識別番号が割り当てられる。
   3. 抽出されたデータの解析：すべての検出されたコロニーの大きさは、時間の関数として測定される。コロニーの出現分布を抽出するために（さらなる情報は、ソフトウェアのマニュアルで提供されています）MATLABのコマンドウィンドウに以下の機能を使用します。
      1. 並んでコロニーのグラフで特定のペトリ皿の分析を表示するために実行ScanLagAppは時間（ 図4）対サイズです。
         1. プレートの現在の時刻を変更するには、スライダを使用します。タイミングもコロニー面積グラフ上の整合縦線で示される。
         2. それに関連付けられた曲線を表示するには、コロニーをクリックし、その逆も、それに関連付けられた植民地を見つけることが、曲線をクリックしてください。コロニーを識別した後、表現型は、特定されたペトリ皿からコロニーを選択することによって取得することができます。
         3. チュウによって自動解析の欠陥をフィルタコロニーを歌うと除外]ボタンをクリックする。コロニーの数を除外クリックすると黄色に変わります。
      2. 各プレートの分析の結果を経て、結果をまとめる。
         1. 外観時間のヒストグラムを作成するためにAddHistogramsを実行します。
         2. 分布の生存曲線の表現を作成するplotDeathCurveを実行します。
         3. 実験で全てのコロニーの出現時間を取得するためにGetAppearanceTimesを実行します。

結果

遅延時間分布抽出の一例として、 図5は、スクリーニングアッセイにおいて行われるであろうように、経時的に一つのプレート上の特定の特性を持つ各コロニーを識別し、追跡するScanLagの能力を示している。

微生物の培養が不均一である場合、異なる亜集団は、アッセイ中に自分自身を明らかに可能性があります。例えば、 図6は、出現定量化を示すので、E.の突然変異株における二峰遅延時間の分布を明らかにする大腸菌。

細胞の増殖速度は、コロニーの出現時間に影響を与える。コロニーを同じ割合で成長すると、後期外観はラグタイム（ 図7）に帰することができる。

この方法は確かに単一セルの遅延時間を測定することを検証するために、我々は、単一細胞顕微鏡を用いて得られたものとScanLag結果を比較し;この検証は、お得です。以前の出版物⁷で詳しくribed。この方法は、顕微鏡を用いて評価することができるよりも多くの細胞のモニタリングを可能にします。顕微鏡を使用してScanLagを使用して得られたディストリビューションは、大部分が重複している。 ScanLag分布がやや広い。理論的な分析は、分割時間の標準偏差のオーダであることが広がりを予測する。成長時間は各菌株ごとに異なる​​場合には、外観の遅れの原因は、他の方法を用いて検討しなければなりません。

後でコロニーの外観に早期出現したコロニーの影響を調べた。対照実験^7は、後述外観限り、プレートあたりのコロニーの総数が（ 図8）200を超えないように影響されなかったことを確認した。別の対照実験は、プレート上のコロニーの位置が、その出現時刻^7に影響^を与えないことを確認した。

Pの分析lates増殖培地または微生物の種類に存在する栄養素に応じて変更が必要になることがあります特定のしきい値に校正されています。それにもかかわらず、分析は、 図9に示すように、閾値の広い範囲のために非常に堅牢である。

図1。コロニーの出現分布を作成するために必要な手順の概略図。

図2。付属のスキャナ、およびコンフィギュレーションファイルの名前を示すデバイスマネージャのスクリーンショット。 拡大表示するには、ここをクリックしてくださいこの図のバージョン。

図3。スキャンマネージャのスクリーンショット。

図4。ScanLagAppのスクリーンショット。プレートの画像は、左ペインにあり、マニュアルに詳述されるよう各コロニーの成長曲線は、右側のペインにあります。 2つ以上のコロニーがマージするときコロニー面積曲線のいくつかではスパイクが発生します。コロニーのマージが起きると、これらのコロニーの面積は接合領域であると考えられる。

図5つのプレートの分析の代表的結果（A）実験の終了時検出アプリケーションの出力の画像。各コロニー領域は、同定および着色固有のID番号が付与されている。矢印はコロニー（強度閾値に基づいて検出されるB.において測定代表コロニーを指すが、LB寒天またはM9寒天培地上の大腸菌コロニーの場合、この閾値は0.03である。他のメディアまたは細菌の場合、この閾値は、機能ProcessPicturesに調整することができる）。 （このしきい値は、関数MatchColoniesで変更することができる）10以上のピクセルがカウントされているオブジェクトのみ。コロニーの検出は、約10 ⁵の細菌から始まります。このプレートの4つの代表的なコロニーの時間に対するピクセル単位面積（B）をプロットします。コロニーが検出されたときに各コロニーの「出現時間」である。各コロニーの '成長時間は、「あちこちに成長するための時間として定義される（それらの境界は機能getAppearanceGrowthByVecを使用して調整可能です）80ピクセルに20ピクセルをメートル。ソフトウェアは、上限に達する前にマージされたコロニーを除外します。その特性に応じて、特定のコロニーの同定は、識別番号と各コロニーに割り当てられた色に簡単に感謝です。例えば＃1のコロニー、56、77および124は、両方のグラフで強調表示されます。

図6外見定量化は、二峰性遅延時間の分布を明らかにすることができる。2つの異なる株のための出現回数ScanLag分析のヒストグラムの比較。青線：野生型株指数関数的に成長している（合計：1,320コロニー）;遅れ細菌（：1,529コロニー数）で強化され、赤のラインの高持続性変異体。 （A）は正規外観ヒストグラム。ピーク指数関数的に増殖する細胞の出現の検出可能なコロニーに成長するのにかかる平均的な時間である。挿入図：二峰遅延時間の分布を示す対数等間隔のビン上の実際の遅延時間を取得するために指数関数的文化のピークの時間を差し引いた後の変異株の同じヒストグラム。 （B）は対数目盛で、（A）と同じデータの生存関数。この表現は、変異株の後期外観テールを強化します。

図7外見分布及び成長時間分布（A）及び（B）は、二次元の出現時刻のヒストグラムおよび2つの異なる条件（ソフトウェアが上限に到達する前にマージされたコロニーを除く）の成長時間を示している。 （C）のヒストグラムを比較する成長時間（D）は似ているのに対し、2株の出現時間の差は、表示されます。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図8は、初期のコロニーの出現は、後にコロニーの出現を妨げない。（A）単独めっき野生型細胞の時間分布遅れる。 （B）許容温度への転送後に、一人で低温感受性株の時間分布ラグ。 （C）は、同じ条件下で一緒にプレーティングし、両株の時間分布遅れる。黒い線は別々に歪みを測定する際に得られたデータに基づいて予想される分布を表す。良いA予想と測定された分布間greementであれプレートあたりのコロニーの総数が200未満であるとして得られる。

。図9は、検出閾値は、コロニーの外観分布の形状に影響を与えないコロニーの出現分布は二つの異なる閾値の大きさを使用して同じデータセットを分析した。 （A）しきい値サイズは10ピクセルです。 （B）は 、しきい値サイズは50ピクセルです。ヒストグラム当たりの細胞数：約。 1500。異なる検出閾値は、検出時間のずれが生じる。

図10。温度安定性測定のACR電源管理なしのスキャナ上に成長させた枯草枯草菌のコロニーを有するプレートのOSSスキャナの表面（A）画像。表面が底に暖かいので、コロニーが速く成長。プレートの横に緩やかなラインは、熱勾配の概略図である。 （B）温度安定性は、スキャナの表面を横切って配置された2つの熱電対で測定した。スキャナは、各走査中に、時間をかけて加熱する。 （C）は、電源管理を使用すると、温度が均一であり、コロニーは同様の速度で成長する。 （D）電源管理モジュールと、（B）と同じ。 ±0.2℃の温度安定性

図11。外観分布の差はディが原因である可能性があり固体培地の量のfferences。同一の細菌培養物は、寒天表面の異なる高さで、その結果、LB寒天の異なるボリュームを有するプレート上にプレーティングした。異なる高さは、プレートの異なる不透明度、したがって異なる検出時間につながった。インタープレート差がチェックされ、異なる高さの条件の違いました。 LB寒天の30±0.5ミリリットルの等容量のプレート間の（A）の代表的な違い。異なる高さの条件との間の（B）の違い：外観分布は30±0.5ミリリットル（緑）の40±0.5ミリリットル（青）で、20±0.5ミリリットル（赤）の容積を有するプレートを測定した。各条件は、6種類のプレートの平均である。限り板の体積が±5ミリリットルの範囲内にあるように、不透明度は同様であり、同様の外観時間分布をもたらす。

ディスカッション

直接観測に基づく微視的な方法は、多くの場合、単一細胞の挙動を研究するための「黄金標準」とみなされている。細菌集団における遅延時間の分布の測定を可能ScanLagは、単一細胞分析から得られた分布とよく一致してデータを提供し、非常に高い統計を達成する。

いくつかの重要なステップは、うまく動作するように、この方法のために実行されなければならない：第一に、良好な画像を得るために4800 X 9600でなければなりませんスキャナの解像度、に妥協はありません。第二に、電源管理モジュール（ステップ1.6）なしで、温度勾配がフラットベッド表面に発展と成長に影響を与える可能性があることに注意してください。もう一つの重要なステップでは、誤ってソフトウェアによってコロニーとしてカウントされている可能性が塵埃等の欠陥の濾過である。ソフトウェアの組み込みのバックグラウンド除去は、通常、これらの欠点を克服し、時には「偽」のコロニーがする必要が手動でフィルタリングする。

主なトラブルシューティング手順は、いくつかの理由のためにセットアップにおけるプレート間の変動に対処するかもしれない：（a）の微生物の成長速度は温度によって影響される。異なる温度と湿度の条件は、培養器内の皿の不均一な換気や場所に発生する可能性があります。 （b）は、スキャナの電子機器は、スキャナの表面を横切る温度勾配を加熱し、発生する可能性があります。10を一緒にする前に、スキャナの表面の温度の測定値と、 バチルス属細菌に対するそのような空間的な熱勾配の影響を、 図電源管理モジュールを実施した後（ステップ1.6）。このモジュールは、新しいスキャナに必要でないかもしれないことに注意し、スキャナ面の一部のみが使用される場合、電力管理は不要である。寒天栄養素のさまざまな不透明度（C）プレートは、検出のさまざまなレベルにつながる可能性があります。 図11は、目を示しています異なる不透明になる栄養寒天の異なるボリュームのE許容値。

実験的にS​​canLag技術は、実施が容易であり、唯一の標準ペトリ皿上の微生物をめっきすると、スキャナの表面上に配置する必要があります。開発されたソフトウェアは、全体の手順を制御します。画像取得が自動的に行われ、コロニー追跡のための画像解析は、自動である。さらに、システムはスケールアップすることができると同時に、多くの異なる状態を測定する。最後に、この方法は、商業オフィススキャナに依存し、従って、低コストである。

この技術は、E.異なる微生物の研究に拡張することができる大腸菌 K-12は、しかし、いくつかの考慮がなされなければならない。以前の刊行物⁷に詳細に記載されるように、まず、後のもの早期出現したコロニーの影響が評価されなければならない。 E.のための大腸菌 K-12、プレート当たりのCFUの最大密度は200です。コロニーの様々なサイズ、そしてコロニー間の他の可能なクロストークと他の株、異なる密度を必要とする場合があります。第二に、プレートの分析は、固体培地とコロニーの間のコントラストに応じて修正する必要があるかもしれません、特定のソフトウェア·ベースのしきい​​値に較正される。ソフトウェアは遅れ、成長速度を越えて、他のコロニーの特徴を抽出することも拡張することができる。ソフトウェアコードは開放され、コロニーの形状、明るさ、平滑性、色を抽出するために修飾することができる。

測定は、単一の細胞に由来するコロニー上で行われるため、データは、集団レベルの測定によって測定することができない新たな表現型を明らかにする。遅延時間分布の重要性は、抗生物質の存在下で明らかにされる。多くの抗生物質のみが増殖している細胞に対して有効であることが知られている;従って限り細胞は誘導期に残り、増殖しないように、それらはプロあるこれらの抗生物質²¹の影響から保護対象。生き残り細菌の数は、抗生物質による治療^15,22,23の間の時間間隔で評価されると、persistersと呼ばれる細菌の亜集団は、しばしば明らかにされる。特定の場合において、抗生物質治療に対する耐性は、長期の遅れに起因する。この設定を使用すると、この遅れは明らかにし、多くの場合、非自明な分布^24（ 図6）を有する。また、このメソッドは、まれな変異体の検索を可能にします。例えば、突然変異誘発された集団をメッキした後に、変異体​​は表現型に基づいて同定することができ、選択することなく、直接単離する。セットアップはまた、近くのコロニーの密度の関数としてコロニーの増殖を測定することにより、細胞間相互作用を監視することができるし、そのようなクオラムセンシングや群がって細菌の蔓延などの現象を定量化する。この方法を使用して将来の実験によって発見された多次元情報は、微生物集団のより良い特性評価につながるS·医療·環境研究の進歩。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バクト寒天	BD	214010
Difco LB ブロス	BD	240230
ペトリ皿 90 mm	Miniplast	20090-01
エプソン パーフェクション v37	エプソン	B11B207201	フラットベッド スキャナー 光学解像度: 4,800 dpi、ハードウェア解像度: 4,800 x 9,600 dpi、カラービット深度48ビット。
エプソンパーフェクションv200	エプソン	B11B188011
エプソンパーフェクション3490	プソン	B11B177011
ADU200 USBリレー	ONTRAK
滅菌黒フェルト布のピース	カスタムメイド		約100 x 100 mm
ホワイトプレートホルダー	カスタムメイド		表面サイズ、直径6 x 99 mmの穴付き
Delerinリングシャーレのサイズ	カスタムメイド		内径:72 mm 外径:86 mm トップ外径:90 mm

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