4次元蛍光イメージングと住んでいる神経末端におけるエンドソームダイナミクスの可視化

サマリー

四次元（4D）画像化は、脊椎動物の神経末端を生体内エンドソームの2種類のうちの挙動および相互作用を研究するために利用される。これらの小さな構造の移動は、例えばエンドソーム融合およびエキソサイトーシスなどのイベントの確認を可能にする、三次元を特徴としている。

要約

四次元（4D）光イメージングは​​、ガーターヘビの薄い腹横筋筋の運動神経終末内の小さな構造の挙動を研究するために使用されている。生データは、3Dのz-スタックの経時的配列を含む。各スタックは400-1,500 nmの区切られた焦点面でのエピ蛍光光学系を用いて取得4月20日の画像が含まれています。このようなフォーカスの調整などの画像スタックの取得の手順は、励起波長の切り替え、及びデジタルカメラの動作は、画像レートを最大化し、光露光から組織の損傷を最小限に抑えるために可能な限り自動化されている。取得後、画像スタックのセットは、空間分解能を向上させるためにデコンボリューションされ、所望の3Dフォーマットに変換され、4D「映画」ことが求められる実験データに応じて、コンピュータベースの様々な分析に適しているの作成に使用される。 1つのアプリケーションが、神経末端-macroendosomes（MES）で見つかったエンドソームの二つのクラスの動的挙動の研究であるおよび（有害事象）、サイズが（両方のタイプの200〜800 nm）の酸性エンドソームは、回折限界またはその付近である。各時点での3次元情報へのアクセスは、従来のタイムラプス撮影に比べていくつかの利点を提供する。特に、構造物の動きの大きさと速度は、鮮明な焦点を失うことなく経時的に定量することができる。 4Dイメージングからのデータの例は、MEは、それらがエキソサイトーシスではなく、単に垂直方向に離れて単焦点面から移動していることを示唆し、原形質膜に接近し、消滅することが明らかになった。また、各3正射影で見たように、2つの色素を含有する構造体の間の重複の視覚化によって、有害事象のMEとの推定上の融合で明らかにした。

概要

生体組織のタイムラプスイメージングは​​、単一の時点で撮像され、固定または住んで調剤に理解されることができない力学構造と機能の関係を視覚的にアクセスを提供します。しかし、多くの場合、一時的な情報へのアクセスのためのトレードオフは、光学解像度の低下である。高開口数油浸対物レンズは、代替として水浸漬またはドライの目標を残しているため、焦点の彼らの狭い範囲の生体組織に非実用的である。さらに、共焦点光学系によってもたらさ高解像度照明比較的高レベルの^1,2必要から、光毒性に起因するいくつかの生体調製物中で利用することができない。最後に、いくつかのリアルタイムまたは時間経過の光学技術が利用可能であるが強化された解像度を提供することが、その適用は、関心のある構造は対物レンズ¹の数百ナノメートル内に配置することができる製剤に限定されている。方法について説明比較的低コストの機器を利用した汎用性のある、さらにより一般的に使用されるタイムラプス技術と比較して改良された解像度を提供しています。なお、各施設ならびに撮像施設での使用を意図している。

この方法は高感度デジタルカメラで、迅速に、わずかに異なる焦点面（Zスタック）で画像のセットを取得するために設計されたハードウェアと組み合わせて、従来の落射蛍光顕微鏡を利用しています。それぞれのzスタックはデジタル分解能を高めるためにデコンボリューションされる。 3Dタイムラプス（4D）画像の特徴の一つは、細胞小器官または他の構造の移動を正確に追跡している。適切に設定すると、画像化された構造は、フォーカスの外に出ないし、すべての3方向の動きを観察し、定量化することができる。染色された構造は、単に狭い焦点面の上または下に漂流して、1つ以上の時間経過フレームにわたって消滅するためにこのように、それは不可能です。この方法はまた、相互作用し、可能FUを評価するための高感度なツールとして機能します小さな構造のシオン。回折限界（数百nm）の近くで、従来の落射蛍光または構造の共焦点画像がマージされた画像は、それぞれのラベル³の重なりを見せても融合を確認していません。融合は示唆し、それは、オブジェクトが回折限界未満である距離だけ水平方向または垂直方向に分離されている可能性が残る。三又は四次元イメージングは​​、対照的に、3つの直交方向のそれぞれにおいてオブジェクトの表示が可能になる。すべての3つのビューにおける融合の外観は、確実性のレベルを増加させる。そして、いくつかの生きた標本で、指向性または両方のラベルは、時間に一緒に移動すると推定される融合されたオブジェクトのブラウン運動は、さらなる証拠を提供しています。もちろん、とき回折限界の背景から、こだわりの構造における確実性のレベル、またはそれらが2色素（融合）が含まれていることを示すの近くに、絶対的なものではない。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）のような該当する場合、専門的な技術が、^4は 、より適切である。

プロトコル

1。超生体色素で準備を染色

1. ガーターヘビ解剖プロトコルの場合スチュワートらを参照してください^。5とテンら ⁶爬虫類組織は、より長い時間、低温度に保た少ない細菌汚染、（下記参照）で、生理学的のまま。哺乳動物組織は、通常、室温以上に維持される。
2. リソソーム生体色素染色のために、冷たい爬虫類リンゲル液1:5,000（0.2μM）に色素を溶解する。 15分間4℃でインキュベートする。冷たいリンゲルで数回洗浄します。なるべく早く画像。
3. 塩化カリウム刺激を使用して、FM1-43染色のために、高塩化カリウムリンガー1:500（7μM）に色素を希釈する。 30〜60秒、最大4℃でインキュベートする。 〜1分/すすぎ、冷たいリンガーで素早く3回洗浄する。なるべく早く画像。
4. 高張（ショ糖）の刺激を使用して、FM1-43染色のために、上記のように0.5 Mショ糖リンガー色素を希釈する。 4＆＃でインキュベートする176; 2〜5分間のためのC。冷たいリンガー上記工程1.3と同様に洗浄する。なるべく早く画像。
5. FM1-43染色のために電気刺激を介して、テンら ⁶を参照して簡単に説明すると、製剤は、生理食塩水、色素を含有する皿が配置されている。神経を200秒の矩形パルス（〜7 V、30 Hzで、18秒）のあらかじめプログラムされた電車で刺激される。冷たいリンガー上記工程1.3と同様に洗浄する。なるべく早く画像。

2。イメージングのための準備を設定します

1. 東洋近隣の構造は、顕微鏡対物レンズにできるだけ近くなるように調製。
2. 倒立顕微鏡を使用する場合は、その底部の薄い丸いカバースリップを含有するチャンバを利用する。一般的に、撮影室が中心で25ミリメートル、直径1位厚ガラスカバースリップで、薄いステンレス製の底部を持っている必要があります。正立顕微鏡を使用する場合は、底部カバーガラスは必要なく、有用であるれていない透過光による画像撮影を可能にするために（ 例えば微分干渉コントラスト、DIC）は、試験片の方向を、目的のオブジェクトを検索します。
3. 可能な限り最高の3D解像度を得るために、適切な目標を選択します。開口間のトレードオフ（NA）、作動距離、倍率、レンズの種類（乾燥、水溶性および油浸）がある。組織培養物のような薄い準備のため、オイルの目標は最高です。正立顕微鏡を使用して、水性浴上にカバースリップをフロートし、カバースリップの上部と客観の間の液浸油を使用しています。
4. デコンボリューションソフトウェアを使用する場合、ベンダは、特定の目的のための所定の点広がり関数（PSFの）を提供するかもしれない。そのような情報が提供されていない場合、またはサポートされていない目的が選択された場合、蛍光マイクロドットまたは類似の回折限界のオブジェクト^7,8を撮影^したPSFを決定する。

3。目的のフィールドの深度およびIMAの数を確立タイムラプスフレームあたり希望GES

1. 彼らはz方向に移動するように関心のある構造の移動や相互作用が消失するか、焦点の外に出ないように、フィールドの全深さを選択します。 Z-フィールドは、わずかに撮像されている細胞または細胞プロセスの垂直寸法を超えている必要があります。脊椎動物のモータ端子の場合は、15から20程度が一般的である。
2. 焦点の各増分に必要なz軸ステップを計算します。 z軸に沿った分解能は、対物レンズの特性に依存して変化する;それはxy平面の解像度の約4分の1である。共焦点イメージングまたはデコンボリューションソフトウェアのいずれかが使用される場合、z軸の解像度が向上する。 z方向⁵における意図的なオーバーサンプリングすることにより、最終解像度を向上させるだけでなく、下記の3.3のステップを参照してください。典型的なステップ間隔は40-100Xの目的のため400-1,500 nmの範囲である。光が各z段階の画像との間でオフシャッターべきである。
3. zスタックあたりの画像数を選択し、すなわち、所望の被写界深度は、分割されたステップ間隔による。典型的なzスタックが完了するまでの時間は1〜10秒です。高速移動体（100ナノメートル/秒）は、各画像面は、わずかに異なる時刻に対応するので、3D画像スタックにぼやけて見えることができる。また、それぞれの追加のイメージは光退色し、可能な光毒性（説明を参照）に貢献しています。どちらの状況が関係する場合は、スタックごとに少ない画像を収集するために、より大きなZ-ステップを選択します。画像補間ソフトウェア（以下のステップ6.3）を使用して、後で補う。

4。タイムラプスフレームレートを選択します。

スムーズな動き、相互作用または融合現象⁹などの経時変化を解決するだけで十分である割合を実験によって選択します。オーバーサンプリングは、不必要に光への露出を増加させながらサンプリングの下で​​は、モーションアーチファクト（サンプリング誤差）が生じることがあります。単一の長いシーケンスまたは同じ調製、比較的小さな総時間間隔でそれぞれの（からのいくつかの反復配列のいずれかを収集する例えば10時間点X 30秒間隔= 5分）。可能な場合は、およそ存在する場合、製剤全体のドリフトを含め、移動速度を推定するために継続的なエピ蛍光照明との準備を表示します。

5。特定の調製のためのすべてのライブイメージングを完了

爬虫類の製剤は、一般的に冷却し、より長い場合には、約1〜2時間、堅調に推移。

6。、所望の用途に応じてデータを分析

1. すべての生データファイルを保持します。デジタルストレージは通常は問題ありませんが、処理時間があっても、高速のパーソナルコンピュータまたはワークステーションと有意である。関心のある領域へのこの理由のために、作物のイメージ[ROI]。関心領域全体が全時間経過時にトリミングされたウィンドウ内にあることを保証する。
2. デコンボリューション画像は、適切なソフトウェアと適切な点広がり関数を用いてスタック。その解像度が向上して確認しているというアーティファクトによって生成されていないデコンボリューションアルゴリズム。 図3は、例示的な画像を示す。
3. z軸見かけの解像度を拡大する補間アルゴリズムを使用してください。見かけ0.25μmの分離への実際1.5ミクロンの像面分離から6Xの拡大が示唆されている。あるいは、いくつかのオーバーサンプリングの組み合わせ（ステップ3.2）および補間を使用しています。
4. 所望であればコントラスト、明るさ、ノイズフィルタリング、光退色および他の典型的な画像処理調整を行う。画像操作基準は、ほとんどの科学的研究のために、それは、同じ修正がスタック内の異なる時点で両方、すべての画像に適用することが適切であることを指示する。特定の調整の結果、すべての画像⁹の中で評価されるべきである。
5. データのエクスポートのための特定の表示モードを選択します。最も簡単な表示が緑、赤または赤青のアナグリフ（ 図3の例）、ステレオペア、または交互のいずれかを使用してステレオビデオですRIGH /左シャッターメガネとTアイフレーム。アナグリフは、単一色に制限されています。 z軸視覚解像度を向上させるために、所望であれば明ら​​かな画像深度を向上させる。
6. 様々なフィルタリングと画像強調技術を試してみてください。例えば、ラプラシアンフィルタ処理は、バックグラウンドの上の小さな構造のコントラストを向上させることが有用である。周辺の明るさを低減しつつ実行されているウィンドウの中心の画素の輝度が向上する。いくつかのフィルタリング方法を組み合わせてうまく機能しないことに注意してください。
7. 経時的な製剤の実質的な動きがある場合、ドリフト補正を適用する。このような動きは、薬は、活動電位とシナプス電位を抑制するために添加してもして、筋肉を生きているでは一般的です。ピクセル合わせアルゴリズム（ 例えば 。IMARIS、アドビ後遺症、ImageJのためTurboRegプラグイン）は、タイムラプス画像を整列させ、減少させることができるが、通常は完全に、このような運動を排除しない。

結果

示されたデータは、（ 図3に低域と高倍率のビューを参照してください。エンドサイトーシスの色素は（FM1-43）の取り込みは、各繊維末端を埋めるヘイズが作成されます）ヘビ神経筋端末からのものであり、特に、macroendosomes（MES）と酸性エンドソーム（AES）これらの端子^5。のMEは、神経活動¹⁰中に大エンドサイトーシスによって作成され、活動が^6を停止した後に、その数は時間とともに指数関数的に低下している。 4Dライブイメージングの使用は、MEが、それらのいくつかはexocytoseため、その数が減少することを示唆し、原形質膜に向かって移動するとすぐに消えるかどうかを決定することであった。全てのこのようなのMEは、一時点で存在する（そして前と）、完全に次の時点で行って（以降もの）であった。このようにして消失するのに要する時間は、我々のフレーム間隔（30秒だけ短く）およびエキソサイトーシスと一致未満であった。 4Dデータによってサポートされていない別の理論は、MesはゆっくりとVの発芽を経由して放散するということです彼らが消えるまで...

ディスカッション

4Dイメージングの最も重要な側面は、露光の期間と強度の管理である。光退色は、画像の信号対雑音比を減少させ、フルオロフォアの選択を含む種々の要因に応じて、問題であってもなくてもよい。生体組織（光毒性）に対する非特異的損傷は、光退色に関連して、時には目的のために^2,12又は微分干渉コントラスト（DIC）のような適切な明視野光学系を有する形態学の検査により設計された蛍光プローブを用いて同定することができる。

これはよく退色および光毒性に関連するものの大きさを下回る光レベルで生じる生理学的効果を誘導することは可能である。例えば、複数の製剤を使用して初期の実験では、各刺激後の異なる時点で固定されたMEが短い刺激後、経時的に消失する速度が⁶で測定^した。標準的tがあるとしてそれらは観察されるまで、O退色最小限に、製剤は暗所に保存した。同様の実験は、4Dライブイメージングを用いて実施した場合には、さらに多くのMESが実験（〜20〜60分）を通じて残り、消えることはありませんでした。実際に記録することにより、最初と最後の一つのフレー...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Equipment
SGC5	Biotium, Hayward, CA	70057	最終濃度: 10 mM
FM1-43FX	Invitrogen, Carlsbad, CA	F35335	最終濃度: 7 mM
LysoTracker Red	Invitrogen, Carlsbad, CA	L7528	最終濃度: 0.2 mM
爬虫類リンガー pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (二塩基性)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
高 KCl 爬虫類リンガー pH 7.2
NaCl			86 mM
KCl			60 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (二塩基性)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
高ショ糖リンガー pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO4			1.8 mM
KH2PO4 (二塩基性)			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
ショ糖			0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 倒立顕微鏡	Carl Zeiss, Thornwood, NY		a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com
N-Achroplan 63X 水対物レンズ; n.a.=0.9;作動距離=2.4 mm	カールツァイス、ソーンウッド、NY		www.zeiss.com
>DG4コンビネーション光源/励磁フィルターホイールスイッチ	ャーSutter Instruments、ノヴァト、CA	175W キセノンアークランプ	www.sutter.com
>Lambda 10-2  エミッションフィルターホイールスイッチャー	Sutter Instruments、ノヴァト、CA		www.sutter.com
>Sensicam CCD camera	Cooke Instruments, Tonawanda, NY		a href="http://www.cookecorp.com/">www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera	Photometrics, Tucson, AZ		a href="http://www.photometrics.com/">www.photometrics.com
イメージングディッシュ-自社製-直径11cm。直径25mm#1カバースリップ埋め込み。磁気ピン
ソフトウェア
Slidebook 5.0	Intelligent Imaging Innovations、デンバー、コロラド州	デコンボリューション;ドリフト補正;3Dおよび4Dデータ表示	www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2	Bitplane, South Windsor, CT	ドリフト補正; 3Dおよび4Dデータ表示	www.bitplane.com
>AfterEffects CS6	Adobe, San Jose, CA	ドリフト補正	www.adobe.com
ImageJ 1.46	National Institutes of Health, Bethesda, MD	複数のプラグインが利用可能。ステレオペア構成	http://rsbweb.nih.gov/ij
>Zeiss LSM	Carl Zeiss, Thornwood, NY	ステレオペア構成	www.zeiss.com