Optogeneticsは、行動神経科学の実験で使用するための強力なツールとなっています。このプロトコルは、レーザーシステムの設計とセットアップのステップバイステップガイドを提供し、ほとんどのげっ歯類の行動試験パラダイムと互換性のある複数の同時in vivo光遺伝学的刺激を実施するための完全なプロトコルを提供します。
この記事について
サマリー
要約
覚醒し、自由に動く動物の定義された神経回路を細胞型の特異性、空間精度、高い時間分解能で探す能力は、複雑な行動状態を支配する神経回路のシステムレベルの探索において、神経科学者にとって長い間求められていたツールでした。オプトジェネティクスは、神経科学の分野に革命をもたらしている最先端のツールであり、神経シグナル伝達イベントと行動との関係に関する因果関係の検証を可能にする最初の体系的なアプローチの1つです。光学的アプローチと遺伝的アプローチを組み合わせることで、哺乳類細胞における光感受性イオンチャネル(オプシン)の発現を通じて、神経シグナル伝達を双方向に制御することができます。現在のプロトコルでは、覚醒して自由に動くげっ歯類の脳深部構造のオプシン発現細胞に特定の波長の光を照射し、神経回路を調節することを説明しています。実験的考察としての光透過の理論的原理は、in vivo光遺伝学的刺激の実施の文脈で議論されています。このプロトコルでは、単純なレーザー構成と複雑なレーザー構成の設計と構築を詳しく説明し、ハイスループットの行動試験のために複数の動物を同時に刺激するためのテザリング戦略について説明しています。
概要
光遺伝学は、正常および疾患関連行動の状態を駆動する神経回路素子のために、検索にシステムレベルの神経科学に革命をもたらしました。 1は 、機能的に哺乳動物細胞で発現することができ、感光性微生物オプシンという発見は、高い空間的、時間的精度2と神経活動の前例のない制御を得るために光を使用するためのプラットフォームを提供しました。神経活動の操作に伝統的な電気生理学的または薬理学的アプローチとは異なり、光遺伝学は、不均一な集団内および生理学的に関連のタイムスケールでの（識別遺伝的または空間投影に基づいて）特定の細胞型の制御を可能にする。神経光インタフェースのその後の導入は、動物3を振る舞うに光を送達するための実用的なツールを提供した。これは、因果的にテストするために、目を覚まし挙動するのげっ歯類で定義された神経回路のリアルタイムの変調を可能にした神経学的および精神疾患4-6に関連する行動状態のガバナンスにおけるこれらの神経回路の役割。光遺伝学は、従って、動物モデルにおける脳活動および行動または生理学的措置の間の機能的関係を調査することに興味の任意の実験室への導入のための強力なツールを表す。
光遺伝学的実験の成功デザインと完了します（ 図1を参照）さまざまなステップおよび考慮事項が含まれます。現在のプロトコルの目標は、目を覚まし挙動するのげっ歯類で光遺伝学的刺激を実行するために必要な理論と実践的な知識、と一緒に、ツールとコンポーネントを持つ個人を提供することです。現在、微生物のオプシンチャネルを活性化するために使用される2つの主要な波長範囲があります。青のスペクトルで（一般的に473 nm）であり、黄緑色のスペクトル（一般的に532または591ナノメートル）。レーザーや発光ダイオード（LED）の両方がdの光源として使用することができる脳組織への光の特定の波長をeliver。 インビボでのげっ歯類の刺激に必要なコアの小さなファイバに結合させる際に、LEDによって放射された非コヒーレント光は、しかしながら、光困難の効果的な伝送を行う。適切なレーザアセンブリの決定することは極めて重要な最初のステップであり、実験室での光遺伝学の使用目的に依存します。シングル予め結合レーザーおよびデュアルレーザーシステム（ 図2を参照）：現在のプロトコルは、組み立ておよび使用の容易さが異なる2つの基本的な構成について説明します。メーカーによって事前に結合されている単一のレーザーシステムは、基本的にすぐに行く必要ありませんセットアップに少しで到着時にですが、最小限のエンドユーザーによるカスタマイズの欠点を持っている。デュアルレーザーシステムは、同じファイバダウンつの異なる波長の送達を可能にする。異なる波長の阻害/ distincを活性化するために使用することができる、これは、組合せ光遺伝学の出現によりますます重要になる空間的に共局在しているトン細胞型。これは、光電流は、それぞれ7,8、青色光と黄色光によって開始され、終了され、双安定階段関数オプシンで使用するためにも不可欠である。必要に応じてユーザーがビーム経路から（ 例えば、外部シャッター、ビームフィルタ、インラインパワーメーター）コンポーネントを追加または削除することができますように、デュアルレーザーシステムもカスタマイズ可能です。光遺伝学は、実験室で使用される継続的なツールであることを行っている場合には、その汎用性のために、デュアルレーザーセットアップを推奨します。レーザの結合は、しかしながら、課題を提示することができるので、迅速、簡単、かつ信頼性のある連結機構は、このプロトコルで提供される。このプロトコルは、光学部品のアセンブリについて詳細に説明し、200μmのコアと0.22の開口数（NA）とステップインデックスマルチモードファイバ用に最適化されたパッチ·コードおよびコンポーネントを利用し、注意してください。異なるコアサイズは、NAはしかし、すべてのコンポーネントは、理想的にはコアの面で一致する必要があり、購入することができますサイズおよびNAは、ファイバの接続点での光損失を回避する。また、ファイバの接続で、光がより大きなコアサイズに小さくから渡すことができます。および/または低NAから高NAファイバに付加的な損失なし。
テザリング戦略は、ハイスループット行動試験のために複数のマウスの同時刺激を可能に提供される。提供されるプロトコルは、行動試験のために、慢性の移植可能な繊維の使用を想定して、急性刺激プロトコルのために修飾することができる。同カニューレの薬剤と同じ場所に、光ファイバの先端を送達するために使用することができるので、急性移植繊維は、薬理学的操作で光遺伝学的刺激を組み合わせるために有利である。それは繊維の繰り返し挿入および除去に伴う組織損傷を減少させ、繊維の一貫した配置するための面で精度を高めるように慢性的に注入した繊維の使用は、しかし、非常に多数の日の行動試験のために推奨される組織照明3。ここで説明テザリングの設定と組み合わせると、動作が複数の日渡って確実に記録することができます。繊維移植後確かに、信頼性の高い光透過率が報告されているか月9慢性刺激および行動試験パラダイムは、理論的には、数日から数週間にわたって行うことができるようになっている。ハードウェアコンポーネントに関する追加の注意事項は、社内で行うことができ、費用対効果的な代替と製品を含む、個々のニーズに合う最高の製品におけるリーダーの選択を可能にするためのプロトコルに追加されました。セットアップと実装時に便利です重要なヒントも提供される。
プロトコル
！注意：このプロトコルは、クラス3Bレーザーの使用を伴い、従うべき適切な訓練や安全ガイドラインが必要になります。レーザーを操作する場合、安全ゴーグル、アライメントの手順は特に高リスクを提示すると、常に着用しなければならない。所定のレーザのための最大限の減衰を提供しますアイウェアを決定するために、レーザープロバイダにお問い合わせください。利用可能な場合は、制度的レーザー安全トレーニングコースに入学。適切な安全眼鏡やトレーニングなしでレーザーを使用しないでください。
1.レーザ装置セットアップ
適切な場合には、第1のステップは、それぞれ、シングルまたはデュアルレーザシステムを区別するために（A）または（B）として指定される。
- ブレッドボードにレーザーを取り付け、固定します。ブレッドボードは、優れた熱伝導体であり、長期間の使用による内部レーザ部品の損傷を防止するためのヒートシンクとして働く。
- （A）は事前に結合されたラスセキュアER¼-20「キャップネジとワッシャー（ 図2A）を使用して、10 "×12"ブレッドボード（または必要に応じて）へ。ブレッドボードの穴がレーザーの取り付け穴に合わせていない場合は、ブレッドボード、レーザーを確保するために小さな 'テーブルクランプを'を使用します。
- 2レーザが使用される場合（B）は、非常に異なるビームの高さ（>約1 cm）を持つレーザーのいずれかのプラットフォームを作成するために小4 "×6"ブレッドボードを使用する。 図2Bに示すように、キャップネジまたはテーブルクランプを使用してより小さなボードにレーザーを取り付けた後、「ワッシャー付きキャップネジを1/4 20を使用して、メイン大12 "×18"ブレッドボードにこれらのボードを取り付けます。キャップネジまたは可変の高さテーブルクランプを使用してブレッドボードに直接他のレーザを取り付けます。
重要なステップ：ブレッドボード、ネジ、および光学部品は、アイテムを購入するときに一貫性が皇室またはメトリックとして購入することができます。このプロトコルのデフォルトは帝国です。 - （A）物理的にレーザー（ 図2A）の前面に装着され、カプラ（ 図3参照カプラーコードとも呼ばれる）への厚いジャケットフラットクリーブ/物理的な接触（FC / PC）パッチコードを添付します。
- （B）は、使用中に緩みやずれを防ぐために、カプラーとJB Kwikの、または類似のエポキシを使用して、ポストの上部との間の接合部をエポキシ、¾ "光ポスト上にカプラを通します。 （ブレッドボードの穴が常に光学部品の必要な配置と整列、ポストホルダー、台座ベースアダプタ、およびフォークをクランプしないような場所で、カプラの光ポストを固定するために使用されます）ブレッドボードにポストを取り付けます。カプラーの背面に厚いジャケット付きパッチコード（カプラーコード）を取り付けます。
- （B） キネマティックホルダーに青色レーザーの最初のステアリングミラーを挿入し、¾ "光ポストを使用してブレッドボードに取り付けます。ベースADAPにこのポストを取り付けますタークランプフォーク。クランプフォークを置き、ダイクロイックミラーに向けてレーザーを操縦する45°の角度を鏡で青色レーザーの正面にアセンブリを投稿してください。ラフアライメントガイドとしてブレッドボードの穴のグリッドパターンを使用してください。一度、大きく配置し、（、Cを図2Bを参照）ブレッドボードにクランプフォークを固定するために¼ "-20キャップねじを使用。
- （B） キネマティックホルダーにダイクロイックミラーを挿入し、1「光ポストに添付してブレッドボードに直接固定します。遠くの左側に、ダイクロイックミラーを配置し、青色レーザミラーに沿っ。角度は、青色光は第1ミラーで反射されるように45°の角度でダイクロイックミラーは、（ 図2B、C参照 ）ポストにキネマホルダーを取り付けるネジを締めた後、カプラに反映されます。
- （B）は、¾ "光ポストに黄色のレーザーのための最初のステアリングミラーを取り付けます。 OPTIを取り付けベースアダプタとクランプフォークへのCALポスト。黄色の光が第2のステアリングミラーに向けられるような45°の角度で位置黄色レーザーの前面と角度を直接クランプフォークとポストアンサンブルミラー。 ¼ "-20キャップネジとワッシャーで所定の位置にクランプフォークを固定します。
- （B）1「光ポストに黄色レーザに第2ステアリングミラーを取り付けます。角度第1ミラーからの黄色光はダイクロイックカプラ（ 図2C）に反映されるようにミラー。ブレッドボードに直接ポストを固定し、ミラーが適切に角度付けしたら取り付けネジを締めます。微鏡の調整は、後の工程でキネマティックミラーマウントを用いて説明する。
- （B）¾ "光ポストに減光フィルタホイールを取り付け、取り付けベースに取り付けポストホルダーにポストを置く。最初とSEの間でブレッドボードにアンサンブルを固定しますシングル¼ "-20キャップネジを使用してCOND黄色のミラー。このホイールは、カプラに到達する黄色レーザ光のパワーを調整するために使用される。
ヒント：個別ベースにそれらを取り付ける前に（そのような記事のトップにキネマティックミラーホルダーを固定しているネジ、ポストの底にベースアダプタを保持するスレッドなど）すべてのコンポーネントを締めます。十分なトルクを得るために、光のポストに設けられた貫通穴に小さな六角レンチのシャフトを使用してください。これにより、コンポーネントは再編が必要、使用中に緩んで来て防ぐことができます。 - ブレッドボードにFC / PC L型ブラケットアダプタにFC / PCを接続します。
- オプション：2つ以上の動物の同時in vivoでの刺激のためのブレッドボードに直接1×2 50/50ミニキューブファイバースプリッタを固定します。さらに、ハンドルは（ 図2Aに見られるように）ブレッドボードアセンブリの移動を補助するために添加することができる。
2.レーザーカップリング（非接触スタイルカップ）
このセクションでは、デュアルレーザーセットアップ（ 図2B）にも関する。外側の黄色のレーザー経路を位置合わせする前に、内側の青色レーザーパスを合わせます。
！注意：目の安全を確保するために、低光電力結合（〜1 MW）を使用してください。レーザーおよび光強度を測定し、安全であるとみなされるまで電源への安全ゴーグルを着用する。
- レーザーの背面にスイッチを設定する「CURR」（電流）と、トランジスタ - トランジスタ論理モード（TTL）+一定の照明用（アナログモードではなく）。ドライバの前面にある電源ノブをゼロに設定されていることを確認してください。最初にして、ドライバにレーザーキーを回して、レーザーをオンにします。
- 〜1mWのレーザー光が放射されるように、ゆっくりとレーザドライバの前面にある電源ノブを調整します。 15分（またはメーカーが指定されている）、レーザーのウォームアップするために - 10を待ちます。
- がfreに直接光ファイバケーブルテスターを接続するEカプラーパッチコードの端とケーブルテスター（ 図3A）をオンにします。赤い光はバックストレートダイクロイックミラーの中心に向かって走行するようにカプラの角度を調整します。ケーブルテスターから出射される赤色光のビーム経路は、入射レーザ光は、レーザに結合させるために実行する必要があります正確なパスである。
- 粗アライメントを実行してください。カプラーにレーザ光のビームを操縦する運動学的鏡に横方向と水平方向のノブを使用してください。ペデスタルクランプは少し鏡とカプラーを再配置する緩めることが必要になる場合があります。キネマティックマウントはさらに、微調整のために利用可能ないくつかの旅行を持っている必要があります。何青色光は、この時点でカプラー付パッチコードの外に放出されないされても心配する必要はありません。
- ダイクロイックとカプラの間に、 直接、ダイクロイックミラーの前で半透明の紙一枚を置きます。青とARの両方があるでしょうEDはそれぞれ、レーザーおよびケーブルテスタからこの紙の上に点在しています。紙の同じ側から同時に赤と青の斑点の両方を見ることが十分に半透明である紙を使用してください。
- 最初のステアリングミラーを微調整する（ すなわち、レーザーではなく、ダイクロイックに近い方）を慎重に青いドットと赤のドットの中心を位置合わせするために、横方向と水平方向のノブを調整することによって。
- それはカプラーの正面になるように、バックカプラに向かって紙を移動し、赤色光のレーザービームを整列させるために第二 （ すなわち、ダイクロイック）ミラー上のノブを調整します。
- （赤と青のビームが同一直線上になるまで、すなわち ）/青黄色と赤のビームの中心が正確に両方の位置に整列されるまで、2.6＆2.7を繰り返し反復処理。
- カプラーコードからケーブルテスターを外します。レーザ光は今やカプラパッチコードの端から出射されるべきである。
- Determi電力計を使用してカプラーパッチコードの光ファイバの先端から出射される光パワーを測定することによってね結合効率。パワーメータのフォトダイオード上の500 mWの設定を使用し、使用されている青（473 nm）以下のレーザーによっては黄色（635 nm）のスペクトル光の波長設定（λ）を変更。
- 電力測定値を得るために、フォトダイオードと垂直なファイバーチップを置きます。ファイバ端から出射された光パワーにカプラーに入る光パワーを比較してください。 > 80パーセントの結合効率が非常に良いと考えられている。第2ステアリングミラーの非常に小さな更なる調整は時々少しカップリングを向上させることができます。結合ファイバの端からのビームパターンは（それを囲むない環を有する）小さな、タイト、中心スポットである場合、一般に、ファイバ·コアに結合効率が最適である。
- 繰り返しますが、2.1のステップ-黄色のレーザーのための2つのステアリングミラーを使用することを除いて、黄色のレーザーカップリングのための2.11（ 図2Cを参照）。無し飲酒tは、ダイクロイックミラーや青色レーザーの位置合わせの位置が失われます調整します。
3. インビボ光遺伝学的刺激
動物の使用を含むすべての手続きは、地域および国のガイドラインに沿って実施し、対応する施設内動物管理使用委員会によって承認されていることを確認。
- 光ファイバーセットアップ（以下に参照パッチ·コードの異なるタイプの識別のために図3Bを参照）。単一のマウスを刺激直接ブレッドボードに接続されたFC / FC L型ブラケットアダプタを使用して厚いジャケット付きパッチコードにカプラーパッチコードを接続するには（ 図4Aを参照）。 1レーザから2匹の動物を刺激するために、1×2 50/50ミニキューブ（ 図4Bを参照）を使用して2つの厚いジャケット付きパッチコードにカプラーパッチコードを接続します。 1×2メートルを使用してマルチモードファイバスプリッタ、カプラコードを取り付ける3つ以上の動物を刺激するINIキューブがすでにブレッドボードに取り付ける（ 図4Cを参照）。
- 厚手のジャケット付きパッチコード/繊維スプリッタの自由端に整流子/ロータリージョイントを取り付けます。彼らは、パッチコードの上にトルクの蓄積を防ぐ齧歯類の動き、との繊維の回転を可能として、整流子が不可欠である。あまりにも多くのトルクは、コードをねじら破損につながり、およびテスト中に動物の自然な動きを妨げる可能性があります。
- 整流子に動物のパッチコードを添付します。
- 動物のパッチコード（ 図5）の遊離金属フェルール端に接続するスプリットスリーブを取り付けます。すべての方法までフェルールをスリーブを強制しないでください。このようにさらさスリーブの0.5センチメートル〜脱退動物（ 図6）に取り付けられた注入された光ファイバに接続するものです。
重要なステップ：常に接続中に移植されたファイバフェルール上のスリーブの拡大を可能にするために、分割が含まれている袖を購入し、除去。インプラントからスリーブを切断しようとしたときに、インプラントが頭蓋骨からdislodges場合、フィット感のきつすぎる動物に深刻な外傷を引き起こす可能性があります。これが発生した場合、動物は試験から除外し、即時の獣医師のケアを受けるべきである。同様に、初めて新しいスリーブを使用する前に、接続し、それは力の目標量と切断するまでフェルールを抜いて」にそれを破る」。
ヒント：それはしっかりとフェルールに装着されたスリーブを除去しながら繊維を破ることは容易である。これを回避するには、スリーブ（標準綿棒のハンドルが正しいサイズである）の開口端に小さな木の棒を挿入してフェルールを押し出す 。 - BNCケーブルを使用して、パルス発生器に青色レーザドライバを接続し、上のパルス発生器を回す。
- 上の適切な安全ゴーグルを置く。レーザーを「CURR」と「TTL +」モードの背面にあるスイッチを設定します。ことを確認してくださいTHAトンドライバの前面にある電源ノブをゼロに設定andturn（最初にしてレーザーキーにドライバをオンにする）にレーザである。
- 光パワーメータを用いて測定ミリワットが動物パッチコードファイバー先端から放出されている5から10ように、レーザの前面にある電源つまみを調整します。 5から10 mWのは一般的なガイドラインである-組織の特定のボリュームに影響を与えるために必要な正確な電力強度がAravanis らのように、実験開始前に計算されるべきである3。
- in vivoでの刺激のために青色レーザーに「アナログ」モードを切り替えます。注：イエローDPSSレーザは、一定の照明のためのTTL +モードで動作する。レーザーがウォームアップするために10〜15分待ちます。
- 静かにマウスを拘束し、慢性移植可能な繊維への動物のパッチコードに分割スリーブを接続します（ 図6を参照）。両方のファイバの端部が互いに物理的に接触していることを確認してください。として接続スリーブでスプリットを使用してください。時々破片が動物の移植可能な繊維の金属フェルールに収集し、適切な接続を妨げる可能性が2つの重要なステップの間の直接接触を視覚化するウィンドウ。この場合には、エタノールを使用し優しく取り付けの前に動物の頭の上にフェルールをきれいに拭く。これは動物に重篤な外傷の原因となりますので、フェルール上の接続スリーブを強制しないでください。ファイバ端部との間の物理的な接続は、洗浄後に行うことができない場合は、研究から動物を削除する。
ヒント：光漏れが注入された繊維や動物のパッチコードとの接続点に発生する可能性があります。げっ歯類によるこの光の可視化は、実験的交絡10を提示することができる。熱収縮チューブは、パッチ·コードに取り付けられ、外光を最小にするための接続点を介してスライドさせることができる。 - マウスは行動試験の開始前に数分間に回復することを許可する。
ヒント：D動物を接続するために必要な処理は、ストレスを誘導し、行動試験を混乱可能性がある、3日前まで - 投与すべき行動試験にepending、それは2接続とテザリングプロセスにマウスを慣らすのがベストです。 - コネクタコードは思わぬ障害がないことを保証する行動試験装置にマウスを置きます。刺激中の無人の動物を残すことはありません。偶数整流子を用いて、パッチ·コードは、長期間の間にねじれる傾向を有しないし、行動試験を妨害する可能性がある。
- 選択肢のオプシンを活性化する所定の周波数で青色レーザーをパルスパルス発生器を使用してください。黄色レーザーの使用のために外部シャッターまたは単に不透明、非反射性、非引火性物体を有するビーム経路を遮断することによって、黄色のレーザーパルス。
vivo刺激の考慮事項4.ポスト
このセクションは、完全プロトであることを意図されていないCOLしかし、インビボ光遺伝学的刺激後の考慮すべき追加の手順については、ガイダンスとして提供されています。
- 実験が完了すると、行動の結果の正確な解釈のためのウイルスおよび繊維配置組織学的に確認する。施設のガイドラインに従って、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて動物を灌流し、PBS中の4％（w / v）のパラホルムアルデヒド動物を安楽死させる。
- しっかりとペンチや止血に露出した金属フェルールを把握することにより、移植された光ファイバを削除します。 1スムーズ、まだSWIFT、運動に引き上げます。各実験の終了時に光出力を測定することによって注入繊維の完全性をテストすることが重要である。
- 関心のある領域を通って、切片の前に48時間 - 少なくとも24のためのパラホルムアルデヒドで脳をポスト修正。 （凍結ミクロトームを使用している場合は、切片の数日前に30％ショ糖溶液中で脳をインキュベート）。 standaを用いた免疫組織化学を実行します適切なオプシンタグ付き蛍光体の検出のため番目のプロトコル、すなわち、緑色蛍光タンパク質（GFP）、強化黄色蛍光タンパク質（のeYFP）またはmCherryを。
- 顕微鏡下オプシンの発現と繊維インプラントのサイトをチェックして、視覚的に選択された座標に基づいて、ウイルス注射とインプラントの適切な配置を確認。
結果
in vivoでの光遺伝学的刺激を用いて得られた行動の結果は、動物モデルを使用し、標的とされる神経回路に完全に依存しており、変調パラメータ。チロシンヒドロキシラーゼの現在例証目的のために、腹側被蓋領域におけるドーパミンニューロン、またはVTA、::のためのCreマウスは、安定した階段関数オプシン（SSFO）8で形質導入された、またはコントロールウイルス（のeYFP）、および繊維インプラントは、慢性的であった。注入された。 THの使用::のCreトランスジェニックマウスは、オプシンの発現がVTAにおけるTH +細胞（ドーパミン）に制限されます。 図7に複数のマウスの同時刺激のための現在のレーザのセットアップを使用して得られた代表的な行動の結果を示す。ここで、マウスは、テザーであり（ 図4Cのように3匹のマウス/レーザー）別個のレーザを用い、同時に刺激され、運動行動を1時間記録した。 VTAにおけるドーパミンニューロンの反復刺激は、以下のような結果に刺激の期間を通じて持続した非常に活発な表現型。運動行動に変化のeYFPマウスにおいて見られなかった（ ビデオ1を参照）。行動試験の後に、免疫組織化学を目視で確認したVTAドーパミンニューロンおよび繊維配置（ 図7参照）の正確なウイルスの標的化を確認するために行った。
in vivoでの光遺伝学的刺激のための、図1。実験の手順。設計およびin vivo光遺伝学的刺激に実行する際に関係する4つの一般的なステップがあります。このプロトコルは、具体的に行動する齧歯類におけるレーザ光源からの脳深部構造への光の送達に関連する手順について詳細に説明し、1）レーザーシステムアセンブリと光結合を含む。 C 2）テザリング戦略ハイスループット行動試験のための光源に複数の動物をonnecting、3）光配信のためのターゲティング戦略を確認するためのガイドラインを提供 - データ解釈のために不可欠であるステップを。注：このプロトコルはテザリングの目的のために慢性の移植可能な繊維に排他的ではないが、それは推奨され、行動試験で光遺伝学的刺激を組み合わせた場合に想定。ウン＆Arenkiel、2012年18およびスパルタらの両方を参照してください。2012年9慢性光ファイバの内製と移植のために。実線=このプロトコルでカバーステップ。
インビボでの光遺伝学的刺激に用い、図2レーザーシステム（A） のin vivo刺激のための単一のレーザシステム。このレーザーがphある ysically製造業者によって予め結合ほとんどのエンドユーザのセットアップを必要とする。（B）デュアルレーザシステム。二つのレーザは非接触様式カプラにそれぞれのビーム経路を操縦するように作用するミラーを使用することにより、単一のファイバに結合されている。これは、最も汎用性の高いセットアップ必要な光学構成要素を削除または追加することができるようであるが、効率的なレーザの結合の点で課題の多くを示す。（C）デュアルレーザシステムの概略図を（B）に示されるレーザおよびミラーの配置を示す対応するレーザ光のビーム経路（矢印）で示さ。ここで、ダイクロイックミラー "D"を介して連結器「C」へと取り付けられたカプラパッチコードに黄色の波長を透過する光の青の波長を偏向するために使用される。 B =青色レーザー。 C =非接触様式カプラ。 D =ダイクロイックミラーと、 FW =フィルタホイール。 M =ミラー。 Yは黄色のレーザーを=。= "_空白"を取得>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
非物理的なカップリングプロトコルで使用される図3（A）ケーブルテスター下：。直接パッチコードに接続されたケーブルテスター。インサートは、ケーブルにテスターの接続点を示している（B）パッチコードは、プロトコルを通じて言及アウターからインナーまで：フラットクリーブ（FC）端部に取り付けられた白いジルコニア割スリーブ付きマルチモードファイバスプリッタ、黒ジャケット動物パッチコードを、 （また、「カプラーコード」と呼ばれる）の厚さのジャケット付きパッチコード。厚いジャケット付きパッチコードは、特別な保護のためのポリ塩化ビニル（PVC）チューブで被覆されている。これらのケーブルは、業界標準の色コードは、異なる種類の繊維、オレンジ=マルチモードファイバとの間で区別するために使用される。動物のパッチコードですシンナー行動試験中に、動物の移動のための柔軟性を可能にするためにジャケット。そのダストキャップは、ケーブルが使用されていないとき、FC / PCが終了した上に置かれることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
（A）単一の動物、（B）2匹の動物のin vivo光遺伝学的刺激のための図4テザリング戦略。 。（C）3または4匹の動物の可能な構成が上記に示したものに限定されるものではない-複数の構成は、市販またはカスタムオーダーにより利用可能ですアダプタ、ファイバスプリッタ、及び分岐パッチコードのユニークな組み合わせによって可能である。注：パッチコードとファイバスプリッタ両端FC / PCコネクタを含む（一端のみが示されている）。ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5。スプリットスリーブを使用して、移植可能な光ファイバへのパッチコードの正しいと間違った（赤のx）を接続。 （左パネル）、スプリットスリーブジルコニアAは、埋め込 み型光ファイバ（ここでは図示動物に貼付されていない）のフェルールにパッチコードを接続するために使用される。矢印は、パッチコードや植込み型光ファイバとの接続点を指している。接続スリーブの分割により可視化されるようにギャップが、パッチコード及び植込み型光ファイバとの間に存在する（右パネル）と比較してください。不適切な接続（右下）で発生する可能性の光漏れに注意してください。 U上のボトムインサートPPER左側のパネルには、使用される個々の構成要素を示す。ドリス式植込み型光ファイバーカニューラ、白ジルコニアスプリットスリーブ、黒ジャケット、動物のパッチコードのフラットクリーブ（FC）終了（ 図3Bに示されている完全なパッチコード）：トップからの挿入の下へ。すべてのパネルでは、接続スリーブは、パッチコードのFC端部と同一平面ではないことに注意してください。ままに〜0.5cmのオーバーハング動物に取り付けられた移植可能な光ファイバに接続するための。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6.サイド（左）と前頭パッチコードに接続されている移植された光ファイバとマウスの（右）ビュー。パッチコードtの適切な接続を視覚化するために接続スリーブ上のスプリットを使用してください移植された光ファイバのフェルールoを接続ポイントは、赤い破線のボックスで強調表示し、また、上のインサートに描かれている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
7.代表的な結果を図。 （左） の生体内光遺伝学的刺激の行動読み出し。記載のレーザセットアップとテザリングプロトコルを使用して得ることができる動作の例。自発運動は、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）で腹側被蓋領域（VTA）の光遺伝学的刺激中に記録された:: Creマウス（N = 7から8 /グループ）のいずれか階段関数オプシン（AAV5-DIO-SSFO-のeYFPで形質導入）またはコントロールウイルス（AAV5-DIO-のeYFP）VTAで。 3匹のマウスの群は、同時に1につながれた図4Cに示されており、447または473 nmの光の5秒のパルスで刺激としてレーザーは一回15分毎に配信。光遺伝学的刺激は運動活性を増加したことにより、双方向反復測定ANOVAは、重要なグループ×時間の相互作用（F 3,39 = 15.27、P <0.0001）と時間の有意な主効果（F 3,39 = 4.67、P = 0.007）を明らかにしたSSFOマウスにおいてのみ（= 0からt相対ボンフェローニ事後P <0.0001、 - 15時間ビンを）のeYFPマウスと比較して運動活性の全体的な増加（グループの主要な効果が得られる：F 1,39 = 10.69、P = 0.0061;ボンフェローニ事後P 2で、。エラーバーは平均の標準誤差を表す。のeYFPSSFO 対 ：** P <0.01; *** P <0.001;時間効果：ウイルスおよび光ファイバの配置の#### P <0.0001（右）組織学的確認。ライカTCS SP5走査型レーザ顕微鏡で取得した共焦点蛍光画像を繊維配置（点線）、およびインビボでの光遺伝学的刺激後のマウスの腹側被蓋領域におけるウイルス媒介発現（緑色）を可視化した。ドーパミンニューロン（TH +）が青色で見られている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
生体光遺伝学的刺激で ビデオ1：Creマウス:: THでSSFOを使用してVTAの刺激中多動このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。
| 表1.光放射照度は、一般的に使用されるオプシンを活性化するのに必要な。 | ||||
| オプシンバリアント | λ | パワー密度（個/ mm 2） | プロパティ | |
| オン/オフ速度論 | ||||
| 光励起：速効性のchannelrhodopsins | ||||
| ChR2を2 | 470 | 1 - 5mWの | 1.21 / 12ミリ秒 | 40ヘルツまでの火災 |
| ケタ19 | 490 | 5ミリワット | 0.86 / 8.5ミリ秒 | 200ヘルツまでの火災 |
| CHIEF 20 | 450 | 1.65 mWの | 1.62 / 12ミリ秒 | ChR2をの非脱感作フォーム |
| C1V 18 | 540から630 | 8 MW（540nmの） | 54で5/34秒0nm | 赤方偏移 |
| 3.2 MW（630nmの） | 630nmのの67ミリ秒（上） | |||
| 光励起：遅効チャネルロドプシン | ||||
| 安定したステップ関数オプシン（SFO）8 | 590分の470 | 8μW（470nmの） | 20ミリ秒/ 29分 | 新しいSFOの変異体;長く開いた状態。 470nmのことでオープンした、590 nmのにより閉鎖 |
| 光阻害 | ||||
| eNpHR3.0 21 | 560から630 | 3から5ミリワット | 2.5ミリ秒/ <10ミリ秒 | 一定の光で30分間22持続阻害* |
| ArchT3.0 11、23 | 520から560 | 1から5ミリワット | 2 / <10ミリ秒 | eNpHR3.0 <より大きい光電流とのより敏感/ TD> |
| この表はあくまで目安として提供されている。神経変調のために必要な特定の光放射照度は、独立して確認する必要があります。 | ||||
| 実験的検証はオプシン、ターゲット戦略、および光刺激パラメータは、意図的に5における神経発火を調整することを確認することが重要です。 | ||||
| 出力密度（mWの本/ mm 2）は 、脳組織の所定の領域に照射される光のパワーを参照し、ファイバ先端から出射される光パワーを意味するものではない。 | ||||
| *常に特に長時間の光刺激で、可能な限り低い光強度を使用しています。 | ||||
表1.光放射照度は、一般的に使用されるオプシンを活性化するのに必要な。
略語
AAV =アデノ随伴ウイルス
DPSS =ダイオード励起固体
のeYFP =強化された黄色蛍光タンパク質
FC / PC =フラットクリーブ/物理的な接触
GFP =緑色の蛍光タンパク質
PBS =リン酸緩衝生理食塩水
PVC =ポリ塩化ビニル
MW =ミリワット
NAは開口数=
SSFO =安定した階段関数オプシン
TH =チロシンヒドロキシラーゼ
TTL =トランジスタ - トランジスタロジック
V =電圧
VTA =腹側被蓋領域
ディスカッション
現在記載されたレーザセットアップとテザリング戦略は齧歯類行動試験の広い範囲と互換性があります。確かに、行動試験の様々な少数を示すために、次の、または付随する、in vivoでの感情、行動のタスクを含む光遺伝学的刺激、行動の調節、学習および記憶パラダイム、睡眠、覚醒、そして食欲のタスクを使用されている（（ニー·チョン） らを参照してください。包括的な見直しのための6）。光遺伝学は、伝統的な行動試験は、複数の日の研究で行われている方法は、今5「オフ」対「オン」光の明確なエポックの間に、被験者内、動作が比較される単一のセッションに凝縮することができます変更されました。注目すべきは、出入り口を含む行動の装置は、閉じた区画または他の障害物が係留繊維の通過に適応するように修正されなければならないことがある。
記載されテザリング戦略許可のSi単一のレーザから複数のマウスのmultaneous刺激。ハイスループット光遺伝学的行動試験は、従って、複数のレーザ及び試験装置を使用して達成することができる。同時に刺激することができる動物の数は、しかしながら、各ファイバ先端に達成できる最大の光パワーによって制限される。ファイバ先端での最大出力は、レーザの1）開始パワーに依存する。 2）カップリング効率及び3）ビーム分割数。 200μmのコア、0.22 NAファイバパッチコードを使用する場合〜80％ の結合効率を有すると（ 図4Cに示されるように）4、ビーム分割、ファイバ先端の平均電力最大100mWの青色レーザ5~10ミリワットの間の範囲であり得る（ロータリージョイントから伝送損失が<15％であることが期待NB）。オプシンは、光に対する感受性が異なるので、光出力密度（mWのように、ファイバ先端に光出力を測定することは、オプシンの活性化のために十分な光パワーを決定するために必須である活性化のために必要な11個/ mm 2）。例えば、安定した階段関数オプシン（SSFO）は、光子アキュムレータとして作用するので、活性化のための非常に小さな光パワー密度（<8μW/ mm 2以上） を必要とする8。活動電位を誘発するための光の1ミリワット/ mm 2で最小を必要とする伝統的なチャネルロドプシン（ChR2を）とこれを比較2。 表1は 、現在最も一般的なオプシンをアクティブにするために必要な知られている最低限の光放射照度のクイックリファレンスとして提供されている使用しています。最後に、人はその光散乱を考慮し、より多くの光パワーをより深く脳構造3のために必要とされるように、脳組織を通って移動するように吸収しなければならない。便利なオンラインリソースがで入手できますhttp://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.phpに取ることによって脳組織を通じて様々な深さでの光強度を計算し、そのファイバ先端にファイバコアサイズ、開口数、使用する光の波長、および出発光パワーを占めている。これらの計算の基礎となる理論的な原則の優れた概要については、Foutz らを参照してください。 （2012）12。実験設計にこれらの原理および計算を適用する方法の例としては、（2007年）3。Aravanisらに実証さタイら。（2012）13される。実験の開始前に、これらの計算を実行することはオプシンの活性化のための適切な光放射照度を確保することが重要である。これらの考察を考慮すると、十分な出力を確保するために高出力レーザを購入することが有利である。 100-200ミリワットの間の電力出力を有するレーザは、小さなコア繊維、複数の繊維を分割、結合効率の悪さを補償するのに一般に十分であり、送信は7を失う。高出力レーザーを使用する場合は、しかし、注意は、神経の損傷または熱と光会合を避けるように注意しなければならない長期化および/ または高出力光照明7で発生する可能性があるDアーティファクト。 in vivo実験のための安全な範囲は、75ミリワット/ mmの2までである。14
考慮すべき多くの要因があるとして購入するレーザーの種類を決定することは複雑な問題であることができる。例えば、ダイレクトダイオードレーザは、ダイオード励起固体（DPSS）レーザが何よりも安定的で反復パルス出力を提供し、ラボ環境で時間をかけて、より信頼性が高い。しかし、場合によっては、ダイレクトダイオードレーザは、指令電圧が、レーザの制御電子回路によってダイオードに送られる一定のバイアス電流を0 Vである場合であっても、より低い光パワーを放出する、〜0.1mWでよい。この「自発的な」放出は、同じレーザからレーザ放射の場合よりも広いスペクトルを持っているので、特にレーザーとカプラとの間の狭いバンドパス（または「クリーンアップ」）フィルタ（部品リストを参照）をインストールすることによって低減することができる。このフィルタは、意志レイジング時〜50％の電力出力を低減し、それに応じ、より高いパワーのレーザーを購入する。それは黄色のDPSSレーザーは非常に敏感であり、動作が不安定になることができ、迅速にパルス発生器によって変調された場合には、寿命が減少していることに留意すべきである。黄色のレーザーパワーの調整は、TTL +モードでレーザーを動作させながら、ビーム経路（1.7節 ）に配置された外部の濃度フィルタホイールを介して行われるべきである。また、緑の532 nmのDPSSレーザーを購入することはhalorhodopsinsとarchaerhodopsins両方を活性化することができる費用対効果の高い代替手段です。
ファイバの開口数（NA）は、レーザアセンブリのセットアップのための繊維成分を設計し、購入する際に考慮することが重要である。光ファイバのNAは、光ファイバの先端に受け入れ、放出することができる光の角度を決定する。高NAファイバは、低NAファイバに交配された場合、重大な損失がその界面で発生するので、それは一貫してのWiすることが重要ですシングルセットアップ内番目の繊維NA（またはNAは、光路に沿って上昇することを確実にするため）。脳組織は高度に散乱し、レーザ光源からの結合された光が「アンダーフィル」高NA繊維になる傾向があるので、照射されているので、脳組織の体積に対する繊維NAの効果は、それほど重要ではない。 0.22および0.37のNAを有するが、光ファイバは、一般的に使用される。同様に、より小さなコアファイバの大きなコアからの結合はまた、常に動物のインプラントにレーザ光源から進行したときに増加または同等のコア径を使用してください、大きな損失になります。一般的なノートでは、ファイバ端部は、常に使用しない塵埃及び粒子の蓄積を防止するためにキャップされたときにすべきである。それは、最大の光出力を確保するために、そして毎日の実験を開始する前に、「ダミーインプラント 'を介して光出力をテストするために（70％イソプロピルアルコールがうまく動作します）定期的にクリーンなファイバ端部とコネクタに良いアイデアです。
">行動試験中は、ステップは、ウイルス感染、外来タンパク質の発現、可視光、および動物の行動上の可能な組織加熱効果及びアーチファクトの影響を制御するために取られることが不可欠であるため、適切な対照群の動物からなるべき同一の光刺激パラメータを受信する対照ウイルス（ 例えば、GFP、のeYFP、mCherryを）で形質導入実験検証解析のために使用される行動データなどの重要な最終ステップは、関心領域内の適切なオプシンおよび光ファイバ配置に完全に依存している具体的には、動物に全く免疫組織化学的信号が検出されない場合、又は信号又は繊維の配置は、関心領域内にない場合、その動物のためのその後の行動データは、実験から除去されるべきである。さらに、それはの光出力をテストすることが不可欠であるファイバ先端外科的移植前とオプシンの活性化のために十分な光パワーを確保するために、もう一度、死後の両方。アニマで重度の光損失が実験（> 30％）9の後にファイバを通って発生したLSは、その動物のためのデータは、除去のために考慮されるべきである。除去のための基準は先験的に確立されるべきである。最後に、1は、標的とされる脳の構造と神経細胞のサブタイプに依存し、神経発火を調節するのに必要なパルス周波数を、考慮しなければなりません。公開された光遺伝学的光刺激パラメータは、しかしながら、神経発火を調節する能力は、独立して、インビボまたは脳切片電気生理学的記録によって確認されるべきであり、複数のニューロンのサブタイプが存在する。一つは、レーザーの使用、レーザー設定アップの変形例熟達になるように、異なる波長の組み合わせは、単一の動物の複数の繊維に繋留またはコンビナトリアル光遺伝学8に対して同じ光ファイバを下に送達することができる。多波長刺激は、赤方偏移の急速な発展与えますます重要になるEDのchannelrhodopsins 8、ブルーシフト過分極オプシン15のエンジニアリング、双安定階段関数オプシン8,16,17、および個別の活性化スペクトル11とオプシンの一般的な拡大リストを使用。光遺伝学的ツールボックスのこの拡張は、複雑な行動の状態を支配する中で自分の役割を決定するための脳領域内および間の両方で、複数の神経サブタイプの前例のない制御を可能にします。
開示事項
著者には報告すべき利益相反はありません。
謝辞
これらの研究は、NIHから受け取った助成金によって資金提供されました（MH082876、DA023988。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1. レーザーセットアップ | |||
| 100 mW 473nm または 488nm ダイオードレーザーシステム , <2% 安定性 (数量: 1) | オミクロン | Luxx/Phoxx 473/488-100 | オプションのアクセサリーにはリモコンが含まれています キースイッチおよびLED表示 |
| 100 mW 594nm DPSSレーザーが付いている箱(量:1) | Colbolt | 0594-04-01-0100-300 | 04-01シリーズ黄色レーザー; 後方反射に敏感 ファイバーから |
| 200 mW 532 nm DPSS レーザー; 5% 出力安定性 (数量: 1) | Shanghai Lasers | GL532T3-200 | 黄色 DPSS レーザーに代わる費用対効果の高い代替品 ハロロドプシンの活性化と archaerhodopsins |
| 非接触型レーザー - マルチモードファイバーカプラー (数量: 1) | OZ Optics | HPUC-23-400/700-M-20AC-11 | デュアルレーザーセットアップ用;仕様:33 mm 外径400 - 700 nm;FCレセプタクル、f=20mmレンズ ポストマウントレーザーヘッドアダプター付き#11 |
| アルミブレッドボード、12 "x 18" x 1/2 "、1/4" -20スレッド(数量:1) | Thorlabs | MB1213 | レーザーシステム用 |
| アルミブレッドボード、10 "x 12" x 1/2" 1/4 "-20スレッド(数量:1) | Thorlabs | MB1012 | レーザーシステム用 |
| アルミブレッドボード、4 "x 6" x 1/2 "、 1/4 インチ -20 スレッド (数量: 2) | Thorlabs | MB4 | 青色レーザー用; デュアルレーザーシステム |
| コンパクト高さ可変クランプ、1/4 インチ -20 タップ (数量: 4) | Thorlabs | CL3 | |
| 3/4 インチ ステンレス ポスト (数量: 1) | Thorlabs | TR075 | |
| 1 インチ ステンレス ポスト (数量: 4) | Thorlabs | TR1 | |
| ポスト ホルダー スプリング式六角ロック付きつまみネジ(数量:2) | Thorlabs | PH1 | |
| 台座ベースアダプター(数量:3) | Thorlabs | BE1 | |
| 小型クランプフォーク(数量:3) | Thorlabs | CF1253 | |
| 1インチ光学系用キネマティックマウント、可視レーザー品質ミラー付き(数量:3) | Thorlabs | KM100-E02 | |
| ニュートラルフィルター密度ホイール(数量:1) | Thorlabs | NDC-50C-2M | |
| 1インチ ロングパス ダイクロイック ミラー 50% (数量: 1) | Thorlabs | DMLP505 | |
| 1インチ 光学系用キネマティック マウント (数量: 1) | Thorlabs | KM100 | ダイクロイック ミラー用 |
| スタンド付き 20 ピース六角レンチ キット (数量: 1) | Thorlabs | TC2 | |
| 1/4"-20 キャップ スクリューとハードウェア キット (数量: 1) | Thorlabs | HW-KIT2 | |
| 取り付けベース 1インチ x 2.3インチ x 3/8インチ (数量: 1) | Thorlabs | BA1S | |
| FC/PC から FC/PC L-ブラケット 嵌合スリーブ (数量: 2) | Thorlabs | ADAFCB1 | デュアル FC/PC L ブラケットも利用可能 |
| ブレッドボード リフティング ハンドル (数量: 3) | Thorlabs | BBH1 | |
| Ø1 "バンドパスフィルター、CWL = 450 ±2 nm、FWHM = 10 ±2 nm (数量: 1) | Thorlabs | FB450-10 | 自発的にダイオードレーザーと併用 emit |
| 2.レーザーカップリング | |||
| !レーザー保護メガネ(数量:各波長のユーザーごとに1つ) | いろいろ | !適切に確認するために、レーザープロバイダーに相談してください 最大限に提供されるアイウェアの選択 購入したレーザー | |
| 光ファイバーケーブルテスターの光減衰(数量:1) | Eclipse | 902-186N | |
| ワンステップファイバーコネクタクリーナー(数量:1) | Thorlabs | FBC1 | |
| カプラーパッチコード(0.75メートル)(数量:1) | Thorlabs | 0.75 m 200 μmコア、0.22 NA、FC / PCコネクタマルチモードファイバー。デュアルレーザーシステム用 | |
| カプラーパッチコード(0.5メートル)(数量:1) | Thorlabs | 0.5 m 200 μmコア、0.22 NA、FC / PCコネクタ、マルチモード。シングルレーザーシステム | |
| 用 Doric mini cube (数量: 2) | DORIC | DMC_1x2_FC-2FC | |
| コンパクトパワーおよびエネルギーメーターコンソール (数量: 1) | Thorlabs | PM100D | デジタル 4" LCD |
| C シリーズスリムパワーセンサー 5 - 500 mW (数量: 1) | Thorlabs | S130C | 複数の検出器タイプが利用可能です。 ベンダー |
| 3. In vivo 光遺伝学的刺激 | |||
| マルチモードファイバースプリッター (数量: 2) | FONT Canada | 大型コア光ファイバー 1 x 2 スプリッター、50/50 比、FC コネクタ、堅牢。長さ、コアサイズ、開口数は注文時に指定できます。費用 対 効果 より小さなコアサイズが利用可能 | |
| 任意波形関数発生器(2チャンネル) (数量:1) | Rigol | DG1022 | 一度に最大2つのレーザーを制御可能 |
| 光ファイバーロータリージョイント(整流子) (数量:6 - 8) | DORIC* | FRJ_1X1_FC-FC | *ThorlabsおよびPrizmatix |
| アニマルパッチコード(10mmフェルール、FC/PCコネクタ付きカスタムモノ光ファイバーカニューレ)(数量:8) | DORIC | MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5 | 長さ、コアサイズ、開口数 注文時に指定してください。あるいは、これら 社内でカスタムメイドにすることができます( スパルタ et al. 2012)9. |
| PFPセラミックススプリットスリーブ、内径2.5mm、長さ11.40mm(25個入り)(数量:1) | 精密繊維製品 | SM-CS1140S1 | 埋め込み型光ファイバーの取り付けに使用 動物に光を届ける繊維パッチコードに フラットクリーブ(FC)エンド |
| Øのクリアダストキャップ。2.5 mm フェルール (25/pkg) (数量: 1) | Thorlabs | CAPF | |
| FC/PC および FC/APC 嵌合スリーブ用金属キャップ (数量: 1) | Thorlabs | CAPF1 | |
| 厚ジャケットパッチコード (カスタムオーダー) (数量: 4) | Thorlabs | 200 μmコア、0.22 NA、FC / PCコネクタマルチモードファイバー。長さ、コアサイズ、開口数をご注文時に指定可能 |
参考文献
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