その後のホールマウントのための完全な脊髄損傷や脳解剖プロトコルその場で幼虫海ヤツメウナギにおけるハイブリダイゼーション

サマリー

ヤツメウナギは、完全な脊髄損傷後の運動を回復する。しかし、いくつかの脊髄投射ニューロンが良い再生器であり、そうでないものもあります。本稿では、完全な脊髄離断を生成し、in situハイブリダイゼーションのためのホールマウントの脳や脊髄の準備、住宅海ヤツメウナギの幼生（最近変換された大人）のための手法を例示する。

要約

完全な脊髄損傷後、最初は海のヤツメウナギは離断のレベル以下に麻痺している。しかし、これらは数週間後に歩行をリカバリし、これを脊髄固有の軸索および脳幹から脊髄に突出する軸索の短い距離再生（数mm）を伴う。 36大の識別可能脊髄投射ニューロンの中には、優れた再生器であり、他は悪い再生器である。これらのニューロンは、最も容易にホールマウントCNS調製物中で同定することができる。有利ニューロン固有のメカニズムを理解または脊椎動物CNSにおける損傷後の軸索再生を阻害するためには、良い、悪い再生器との間の遺伝子発現の相違を決定する方法、および発現は、脊髄切断によって影響される。本稿では、顕微鏡のビジョンの下で、完全な脊髄離断を生産、住宅幼虫のための技術と新鮮な水タンク内の最近変換された大人の海のヤツメウナギを示しており、BRの準備AINおよびin situハイブリダイゼーションのための脊髄wholemounts。簡単に述べると、動物を16に維持される  C°、ヤツメウナギリンガーで1％ベンゾカインで麻酔し。脊髄は背側アプローチを介して、虹彩切除鋏で切開され、動物は23℃の真水タンクに回復させる。 in situハイブリダイゼーションのために、動物を再麻酔され、脳と脊髄は背側アプローチを介して除去。

概要

哺乳動物では、脊髄損傷（SCI）は、負傷した軸索がトラウマゾーンを通って再生し、それらの適切なターゲットに再接続していないため、損傷部位以下の機能の永久的な損失につながる壊滅的な条件である。哺乳類とは対照的に、ヤツメウナギは、完全な脊髄損傷後の運動を回復^。1興味深いことに、ヤツメウナギは、それらの大きなサイズのホールマウント脳調製物において個別に識別可能なニューロンを投影する36脊髄のセットを持っている^2,3（ 図1） 。これらの脊髄投射ニューロンのすべてが高レベルの完全な脊髄離断により軸索切断されている。私たちのグループとその他の以前の研究では、他の人は通常、損傷部位を通じて軸索を再生しながらでも、これらのニューロンのいくつかは非常に低い再生能力を示し、SCI後の機能回復の存在下で、（彼らは "悪い再生器を」と考えられている）ことを示している（それらが考慮される「グラムOOD再生器^」）。2,3この特性は、ヤツメウナギ面白い脊椎動物モデルは今度にしようとする神経細胞の本質的な再生能力の違いにつながる良い面と悪い蓄冷脊髄投射ニューロン間の遺伝子発現の違いを研究することができます同じ外因環境での軸索を再生^。1

このモデルを用いて、私たちは、以前にそれぞれネトリンとRGMの阻害作用を媒介しUNC5 ^4,5及びネオゲニンなどの軸索ガイダンス分....

プロトコル

このプロトコルで使用されるすべての材料については、表1を参照してください。

実験は、テンプル大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された。

1。動物

1. 野生型幼虫の海ヤツメウナギ（Petromyzonマリナス L.）を取得し、10 -メイン州のデラウェア川（ペンシルベニア州）またはストリームへの支流から、ミシガン湖の供給流れから- （7歳4）長さが14センチ。
2. 16℃で50ガロンの淡水タンク内の100の動物 - 研究室では、50のグループで幼虫を維持する。ライン砂利のインチでタンク幼虫が中に穴を掘るためにのために、水を炭濾過し、その中にヤツメウナギを置く前に、塩素や他の不純物を除去するために、少なくとも48時間、エアストーンで調整されている。使用する日まで、自らの残骸をリサイクル動物を供給する必要はありません。

2コンプリート脊髄コー​​ド離断

1. 脊髄手術の前に以下の組成を有するヤツメウナギリンゲル液の準備：110のNaCl、2.1のKCl、2.6のCaCl _2、1.8mMのMgCl ₂および10mMのトリス緩衝液を; pHは7.4。
2. 脊髄切断を行うために、小さな容器に幼虫を置き氷冷....

結果

この方法を使用するときに得られる結果は、識別可能な脊髄突出におけるネオゲニン転写物の発現を示すwholemounted脳の代表画像の一例として、制御のニューロンおよび2週間後の病変幼虫海ヤツメウナギは、 図2に示されている。読者は、完全な脊髄離断および完全な詳細については、海のヤツメウナギの神経細胞を投影する識別可能な脊髄の再生能力の後ネオゲニンの発現との関係を報告して、以前の研究⁶と呼ばれている。簡単に述べると、結果は、損傷後に識別脊髄投射ニューロンにおけるネオゲニン受容体の発現に変化があることを示している。二週間M1、I1、I2、I4、またはM番目のニューロン様ネオゲニン受容体を優先的に悪い再生器中で発現される完全な脊髄離断後（ 図2Bを参照）これらの結果は、結果を実証プロトコル及びネオゲニン受容体がこれらの細胞の再生の障害に関与し得ることを示唆している。

ディスカッション

ここでは、幼虫の海のヤツメウナギで完全な脊髄離断および後脳の解剖を実行するために詳細なプロトコルを提示する。この手順では、in situハイブリダイゼーションホールマウント脳による脊髄損傷後のニューロンを投影する識別可能な脊髄の間の遺伝子発現の差を分析することができる。手順における重要なステップはstereomicrocope下、脊髄の切断端を観察することによって制御され、穏やかに一対の幼虫の鼻に触れることにより24時間後に確認することができる完全な脊髄切断の正確な性能である鉗子損傷部位への移動、尾がないかどうかを確認します。また、手術のために使用されるハサミは鈍ではない、動物の回復のための重要かつシングルとクリーンカットが完全に脊髄を横断するために行われていることである。

損傷後の動物の生存は非常なアニメーションを維持することによって改善され手術中の最初の24時間空気乾燥した後、氷冷水中に傷を可能にするために使用時間中に氷上でALS。この期間の後、創傷を閉じ、動物が既に室温で淡水をタンクに移すことができる。

動物のより大部分.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリカインメタンスルホン酸	スペクトル	TR108	ベンゾカイン飽和溶液PBS犠牲メス用
#3	ファインサイエンスツール(FST)	10003-12
用ブレード:#11	ファインサイエンスツール	10011-00
カストロビエホハサミ #8	ファインサイエンスツール	15002-08
鉗子 #4 & #5	デュモン、スイス	Roboz RS4955	#4 脊髄の解剖用; #5 menninges
解剖顕微鏡	オリンパス	SZ51
シルガード	ダウ コーニング Co.	184
昆虫ピン 0.15, 0.20 mm	Austerlitz	カタログなし #	0.15 mm 脳と脊髄のピン留め用; 0.20 mm 本体用 0.20 mm
7 ml HDPE シンチレーションチューブ キャップ付き	Fisher Scientific	03-337-1
パラホルムアルデヒド 16%	Electron Microscopy Science (EMS)	19210	PBS で 4% に希釈