このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

「ノープリウスの動きを分析する

9.9K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/51502

⸱

2014年7月15日

 ,  ,  , 
1Photonics and Optoelectronics Group, Ludwig-Maximilians-Universität

この記事について

サマリー

私たちは、水生生物の周波数の動きを調査し、特徴づけるためにプラズモニックナノ粒子の光学式トラッキングを使用しています。

要約

私たちは、光ピンセット、小さな水生生物の移動により発生する流体振動を解析するための高感度なツールを提供してもよい方法を示しています。光ピンセットによって保持され、単一の金ナノ粒子は、水サンプルにノープリウス幼生（ アルテミア·サリナ ）のリズミカルな運動を定量化するためのセンサとして使用されている。これは、ノープリウス活性の結果として、捕捉されたナノ粒子の時間依存性の変位を監視することによって達成される。ナノ粒子の位​​置のフーリエ解析を観察した種の動きに特徴的な周波数スペクトルが得られる。この実験は、それらを直接観察し、トラップされた粒子についての幼虫の位置に関する情報を得るために必要とせず、小さな水生幼虫の活性を測定し、特徴づけるため、このメソッドの機能を示しています。全体的に、このアプローチは、水生Eで見つかった特定の種の活力に洞察力を与えることができるcosystemおよび水試料を分析するための従来の方法の範囲を広げることができる。

概要

化学的および生物学的指標に基づく水質評価は、水生生態系1-3の状態や環境条件に洞察を得るために基本的に重要である。水化学分析のための古典的な方法は、官能的性質又は物理化学的パラメータの決定に基づいている。生物学的指標は、他の一方で、その存在および生存能力、彼らは生物指標の典型的な例インチ起こる生態系のための環境条件や汚染物質の影響に関する洞察を提供することができますカイアシ類、小さな水の甲殻類のグループである動物種であるほぼすべての水の生息地4,5に記載されてい。水試料からのこれらの種の活性及び生存率を観察し、したがって生態系5の全体的な状態に関する情報を得るために使用することができる。ノープリウスと呼ばれているカイアシ類の幼虫は、そのアンテナのリズミカルなストロークを使用します（それぞれの幼虫がappendaの3組を持っている自分の頭領域におけるGES）は、水6で泳ぐ。これらのストロークの頻度と強度は、それによって、年齢、フィットネス、および動物7月10日の環境条件の直接的な指標である。これらの標本上の任意の調査は通常、直接ノープリウスのアンテナストロークを観察し、カウントすることにより、顕微鏡を用いて行われます。そのサイズ（〜100〜500ミクロン）11には、これは多くの場合、測定を行うために必要とするいずれか1つずつ、または基板への単一ノープリウスを修正する。

ここでは、超高感度検出器として、光学的にトラップされた金ナノ粒子を用いて水試料中カイアシ類幼虫の活性を観察するための新たなアプローチを実証する。光ピンセットは、通常、ピコニュートンの範囲12から14まで分子間力を加えるか、測定するための細かい実験ツールとして、多くのグループによって使用されています。さらに最近では、光ピンセットのための応用範囲は、音響振動を観察し、解決するために拡張されました光学トラップ15内に閉じ込められるナノおよびマイクロ粒子の動きを監視することにより、液体培地でのNTの変動。液体中に浸漬される粒子は、ブラウン運動に供される。光トラップの内側に、しかし、この運動は、部分的に強く、レーザ誘起勾配力によって減衰される。したがって、光トラップの剛性およびレーザ光の焦点内の粒子の局在は、レーザーパワーによって調整することができる。同時に、それはトラップポテンシャルに関する特性を明らかにするために、トラップ内の時間依存性の粒子運動を監視することにより、粒子と分子の相互作用を分析することが可能である。このアプローチにより、周波数、強度、及びその液体環境中で移動する物体によって生成された流体運動の方向をピックアップしてレンダリングする。我々は、この一般的な考えは必要条件ではなく、個々のノープリウスの運動の周波数スペクトルを得るために適用することができる方法を示して直接試料に干渉する。この実験的なアプローチは、非常に敏感な方法で水生標本の運動性行動の観察のための新しい一般的な概念が導入されています。生物指標種の観察のために、これは水の分析のための現在の方法論を展開することができ、健康や水生生態系の保全についての情報を得るために適用することができる。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1。実験装置

  1. 開口数（NA）と直立顕微鏡および暗視野オイル冷却器を使用= 1.2暗視野照明のために。粒子観察と捕獲のための100倍の倍率とNA = 1.0と水浸対物レンズを使用してください。ノープリウスの動きに追従するために10倍の倍率とNA = 0.2と空気の目的に使用します。
  2. 直立顕微鏡に接続された1064 nmの連続波レーザーと光ピンセットのセットアップを使用してください。 （対物後の電力計で測定）は100mWに光トラップのレーザーパワーを設定します。
  3. 光トラップとノープリウスの動きに金粒子の動きを検出し、映像にCMOS高速カメラやデジタル一眼レフ（DSLR）カメラを使用してください。
  4. カメラに入るのを防止するために、レーザノッチフィルタを使用する。
  5. 対物レンズの後にレーザパワーを測定するパワーメータを使用する。

2。サンプル調製

  1. 顕微鏡用スライドガラス上の水滴（180μl）をピペット暗視野顕微鏡にサンプルを配置する。
  2. 水滴に小さな水タンクからノープリウスをピペット。
  3. 溶液中のノープリウスの動きを観察し、ビデオストリームを記録するために10倍の空気対物レンズを使用。
  4. ノープリウスで生成された流体の動きを観察する検出器として60ナノメートルの直径を有する金ナノ粒子を使用してください。約つの粒子が100×水浸対物レンズとの視野で見ることができるようになるので、水滴中に高度に希釈された粒子溶液5μlを加える

3。粒子追跡実験

  1. 光ピンセットでトラップ1金ナノ粒子。このため、顕微鏡ステージを移動することによって溶液中に拡散されて、金ナノ粒子の近くに1064 nmのレーザートラッピングをもたらす。魅力的な光の力は、目の焦点に向けた金ナノ粒子を引っ張る電子レーザービーム。トラップされた粒子は、その位置を維持し、もはや、むしろ拡散されていません。 30秒間、50Hzのフレームレートでデジタル一眼レフカメラで捕捉されたナノ粒子のビデオストリームを取る。
  2. 光ピンセットのレーザーをオフにして、トラップから金ナノ粒子を解放する。
  3. ビデオストリームの各フレームで光学的にトラップされた金粒子の位置を読み出しに粒子追跡プログラムを使用します。経時的に、粒子の位置のxyの高速フーリエ変換（FFT）は、周波数スペクトルを明らかにする。
    注記：ここでは、自己形成 'IGOR PRO'コンピュータプログラムコードは、経時的及びFFT分析のためのxy平面での粒子の中心位置を分析した。
  4. 自己書かれたIGORコードの代替として、映像中の粒子を追跡するための自​​由に利用できる「ビデオスポットトラッカー」プログラムを使用します。追跡データのフーリエ変換を実行するために、商用ソフトウェア「起源」を使用します。
    1. オープンプログラムのビデオスポットトラッカー」にビデオファイルをドラッグします。
    2. ビデオストリームと関心が現れるの円形領域の最初の写真で見られる粒子をマウスでクリック。
    3. 「対称」を選択して、粒子の追跡を最適化するためにtopコマンドプロンプトウィンドウで「最適化」。
    4. マウスは、topコマンドプロンプトウィンドウに「ログイン」をクリックして、データを保存するフォルダを選択します。追跡データは、データスプレッドシートとして保存される。
    5. マウスは、追跡プログラムの左側のコマンドプロンプトウィンドウの「動画再生」をクリックし、ビデオのすべてのフレームが分析されるまで待ちます。
    6. プログラムを終了し、「起源」で保存されたデータのスプレッドシートを開きます。 「Y 1」と「Y 2」と、列の値を設定します。
    7. 「原点」データスプレッドシートの「X」などの各映像フレームの時間ステップを設定します。
    8. マークX-位置欄とtopコマンドプロンプトウィンドウに「データ解析」と「FFT」を選択することで、FFTを実行する。 y位置列の手順を繰り返します。
    9. 周波数に対するx方向及びy方向に計算されたFFT信号の振幅をプロットする。

4。数値シミュレーション

  1. コンピュータプログラム「Mathematicaを 'を使用して60 nmの金粒子の分極率αを計算する。
    1. ：式（1）桑田らによれば分極率を算出し16を使用
      figure-protocol-1 （1）
    2. 金粒子、ナノ粒子の半径、および周囲の媒質の屈折率の波長依存性複合誘電関数：プログラムコードで、次の3つのパラメータを定義します。
  2. 電気の記述を使用Agayan らによると、集束ガウスビームのトリC電界分布17 60 nmの金粒子に作用する光学力を計算する。：
    figure-protocol-2 （2）
    1. 利用方程式（3） - （6）Agayan ら 17の両方を計算するために、勾配及び粒子に作用する力を散乱させる。
      figure-protocol-3 （3）
      figure-protocol-4 （4）
      figure-protocol-5 （5）
      figure-protocol-6 （6）
    2. プログラムコードは、レーザパワーのパラメータを定義し、開口数のobjective、およびナノ粒子の複雑な分極率。
    3. 光トラップ中の金粒子に作用する全光力を計算するために、勾配力と散乱力をまとめる。
  3. 同時に「制御」を押して、シミュレーションを実行し、 "Enter"を。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

実験装置の概略図を図1Aに示されている。暗視野構成では、光学的トラップ15における60nmの金粒子の変位を検出する必要がある。トラッピング用レーザ波長1064nm、検出器12,14の金粒子の安定な閉じ込めを保証するために選択される。顕微鏡のビームスプリッタは、対物レンズを通してトラッピングビームを集束するために使用され、ノッチフィルタは、実験の検出素子内に入るトラッピングレーザを防止する。ノープリウスは、光学的にトラップされた金ナノ粒子（ 図1B）を囲む水溶液中で運動を行っていた。動物によって生成される流体振動は、液体媒体中を伝播し、光学的にトラップされた粒子と相互作用します。

図2Aは、bはトラップされ、単一の60nmの金ナノ粒子の暗視野像を示すYレーザービーム。暗視野照明の下で緑がかった色は、その波長範囲での散乱周波数を示す。デジタル一眼レフカメラで捕捉された粒子の色を観察すると、第二の粒子の捕捉によるプラズモンカップリングの色の変...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

暗視野顕微鏡は、金属ナノ粒子の散乱断面積は、幾何学的断面積（cp.の図2A）18 を超えているため、光の回折限界以下の寸法を有する金ナノ粒子を可視化するための強力なツールである。ピンセット設定では、このアプローチは、さらに粒子間のプラズモンカップリングプラズモン共鳴周波数が15の赤方偏移を引き起こすためにのみ、単一または複数の金ナノ粒子がレーザービームによって捕捉されるかどうかを区別することを可能にする。光ピンセット構成の暗視野顕微鏡は、したがって、多数の新しい、非常に有用な実験の可能性を提供しますが、組み合わせは自明ではありません。三次元の光トラップの原点は、光電界密度の勾配によって引き起こされるので、安定した光トラッピングのために強く集光されたレーザ光は、必要とされる。通常、高い開口数（NA = 1.3〜1.4）との目標は、ピンセットのために使用されているレーザー19のフォーカシングタイトを達成するためのセットアップ。市販の暗視野オイルコンデンサーの最高NAは、しかし、1.2である。これは、より高いNA対物レンズ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

ナノシステム·イニシアチブミュンヘン（NIM）を介して、DFGによる高度な研究者グラントHYMEM、通ってSonderforschungsbereich（SFB1032）を通じて、ERCによる財政支援、プロジェクトA8が感謝して承諾されます。私たちは、博士アレクサンダーOhlinger、サポート、実りある議論のための博士ソルCARRETERO-パラシオスやスパNedevに感謝しています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
顕微鏡 ツァイス Axio Scope.A1カールツァイス490035-0012-000暗視野照明
水対物レンズ アクロプランカールツァイス440087100倍の倍率、NA = 1.0
空気対物レンズ エピプランカールツァイス44293410倍の倍率、NA = 0.2
ダークフィールドオイルコンデンサーカールツァイス445323NA = 1.2
コボルトルンバ CW1,064 nm DPSSLCobolt1064-05-01-2000-5001,064 nm, CW, λ = 1,064 nm, 2 Watt, TEM00
ビームエキスパンダーEdmund Optics部品番号 1064 2-8X 64414
ハイスピードカメラ Dimax HDPCO.ドイツ
カラーカメラCanon EOS 500 D キヤノンFAQ-ID:8201395700
ノッチフィルターStopLine 532/1064SemrockA11149-711265部品番号NF01-532U
水面 
Nauplius Artemia salina
金コロイドBB国際バッチ13741 直径 60 nm
MQMieバージョン3.2 Dr. Michael Quinten
Mathematica 8.0Wolfram
Comsol Multiphysics 4.0 株式会社コムソル

参考文献

  1. Hellawell, J. M. Biological indicators of freshwater pollution and environmental management. , Elsevier Applied Science Publishers. (1986).
  2. Diamond, J. M., Barbour, M. T., Stribling, J. B. Characterizing and comparing bioassessment approaches and their results: A perspective. Journal of the North American Benthological Society. 15, 713-727 (1996).
  3. Carlisle, D. M., et al. The quality of our Nation’s waters—Ecological health in the Nation’s streams, 1993–2005. U.S. Geological Survey Circular. 1391, (2013).
  4. Boxhall, G. A., Defaye, D. Global diversity of copepods (Crustacea Copepoda) in freshwater. Hydrobiologia. 595 (1), 195-207 (2008).
  5. Ferdous, Z., Muktadir, A. K. M. A Review: Potentiality of Zooplankton as Bioindicator. American Journal of Applied Sciences. 6 (10), 1815-1819 (2009).
  6. Andersen Borg, C. M., Bruno, E., Kiørboe, T. The Kinematics of Swimming and Relocation Jumps in Copepod Nauplii. PLoS ONE. 7 (10), (2012).
  7. Gilchrist, B. M. Growth and Form of the Brine Shrimp Artemia Salina. Journal of Zoology. 134 (2), 221-235 (1960).
  8. Boone, E., Baas-Becking, L. G. M. Salt Effects on Egga and Nauplii of Artemia Salina L. Journal of General Physiology. 14 (6), 453-763 (1931).
  9. Drewes, C. Quantitative investigations of hatching in brine shrimp cysts. Association for Biology Laboratory Education. 27, 299-312 (2006).
  10. Williams, T. A. A model of rowing propulsion and the ontogeny of locomotion in Artemia larvae. Biological Bulletin. 187, 164-173 (1994).
  11. Croghan, P. C. The Mechanism of Osmotic Regulation in the Artemia Salina (L.): The Physiology of the Branchiae. Journal of Experimental Biology. 35, 234-242 (1958).
  12. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics Letters. 11 (5), 288-290 (1986).
  13. Svoboda, K., Block, S. M. Optical trapping of metallic Rayleigh particles. Optics Letters. 19 (13), 930-932 (1994).
  14. Hansen, P. M., Bhatia, V. K., Harrit, N., Oddershede, L. Expanding the Optical Trapping Range of Gold Nanoparticles. Nano Letters. 5 (10), 1937-1942 (2005).
  15. Ohlinger, A., Deak, A., Lutich, A. A., Feldmann, J. Optically Trapped Gold Nanoparticle Enables Listening at the Microscale. Physical Review Letters. 108 (1), (2012).
  16. Kuwata, H., Tamaru, H., Esumi, K., Miyano, K. Resonant light scattering particles: Practical analysis beyond Rayleigh approximation. Applied Physics Letters. 83 (22), 4625-4628 (2003).
  17. Agayan, R. R., Gittes, F., Kopelman, R., Schmidt, C. F. Optical trapping near resonance absorption. Applied Optics. 41 (12), 2318-2327 (2002).
  18. Klar, T., Perner, M., Grosse, S., von Plessen, G., Spirkl, W., Feldmann, J. Surface-Plasmon Resonances in Single Metallic Nanoparticles. Physical Review Letters. 80, 4249-4252 (1998).
  19. Ohlinger, A., Nedev, S., Lutich, A. A., Feldmann, J. Optothermal Escape of Plasmonically Coupled Silver Nanoparticles from a Three-Dimensional Optical Trap. Nano Letters. 11 (4), 1770-1774 (2011).
  20. Urban, A. S., Lutich, A. A., Stefani, F. D., Feldmann, J. Laser Printing Single Gold Nanoparticles. Nano Letters. Nano Letters. 10 (12), 4794-4798 (2010).
  21. Urban, A. S., Fedoru, K. M., Nedev, S., Lutich, A., Lohmueller, T., Feldmann, J. Shrink-to-fit Plasmonic Nanostructures. Advanced Optical Materials. 1 (2), 123-127 (2013).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

光ピンセット金ナノ粒子流体振動フーリエ解析パーティクルトラッキング暗視野顕微鏡水浸対物レンズ周波数スペクトル水生生物の運動
「ノープリウスの動きを分析する
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。