マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

Summary

液滴界面の脂質二重層に対するマイクロ流体噴射は、膜の非対称性、膜貫通タンパク質の取り込み、および材料のカプセル化を制御して小胞を生成するための信頼できる方法を提供します。この技術は、区画化された生体分子が所望される生体系の様々な研究に適用することができる。

Abstract

ボトムアップ合成生物学は、潜在的に生化学系と、最小限の生物を調査し、再構成するための新しいアプローチを提示します。この新興分野は、下から上に複雑な、機能してシステムへの基本的な生物学的なコンポーネントを設計し、組み立てる技術者、化学者、生物学者、物理学者を行っています。このようなボトムアップのシステムは、基本的な生物学的問い合わせや、革新的な治療法^1,2人工細胞の開発につながる可能性があります。巨大単層小胞（GUVs）は、それらの細胞様膜構造とサイズに合成生物学のためのモデルのプラットフォームとして機能することができます。マイクロ流体吐出、又はmicrojettingは、制御された大きさ、膜組成、膜貫通タンパク質の取り込み、およびカプセル³を有するGUVsの生成を可能にする技術である。この方法の基本原理は、懸濁リットル変形するピエゾ作動式インクジェット装置によって生成された複数の高周波流体パルスの使用であるGUVに重層をIPID。プロセスは、石鹸膜でシャボン玉を吹くに似ています。噴出液、包含する溶液の組成、および/または成分の組成を変化させることによって二重層に含まれる、研究者は、カスタマイズされた小胞を作成するためにこの技術を適用することができる。本稿ではmicrojettingにより液滴界面二重層から簡単な小胞を生成するための手順について説明します。

Introduction

これは、細胞生物学の分子から細胞への我々の理解を統合することが含まマルチスケール問題であることがますます明らかになってきた。その結果、分子が個別に動作し、正確にどのように知ることは複雑な細胞の挙動を理解するには十分ではない。これは^、5を抽出するアフリカツメガエルにおける脂質二重層小胞^4、紡錘体とアクチンネットワーク相互作用の再構成によって例示されるように、部分的には多成分系の射出挙動の存在であり、細菌の細胞分裂機械⁶の空間的なダイナミックス。生体系の分子プロセスを解剖の還元主義のアプローチを補完する一つの方法は、生物学的要素の最小セットを使用して細胞挙動を再構成する逆のアプローチを取ることです。このアプローチの重要な部分は、限られた量の生体分子の信頼性の高いカプセル化、細胞の重要な機能が含まれます。

e_contentは">いくつかの戦略は、バイオミメティックシステムを研究するための生体分子をカプセル化するために存在する。最も生物学的に関連システムは、細胞の細胞質膜によって課される生化学的および物理的な制約を模倣する脂質二重膜、である。電鋳⁷による巨大単層小胞（GUVs）の形成、精製タンパク質を操作するための問題である可能性がありGUV世代¹⁴のために最も広く使用される技術の一つは、通常、高塩緩衝液⁸との互換性がないため不十分な封入収率を持っています。電鋳でも大量....

Protocol

1。無限チャンバー製作

1. コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して（その形状にちなんで命名）​​無限室を設計し、それがレーザーカッターと互換性があるように、ファイルを保存します。レーザーカッターで透明なアクリルで1/8- 3月16日からチャンバをカット0.15インチの中心間距離でこの形​​状、直径0.183の別々の二つの円を作成します。無限の形状は、液滴界面二重層形成および安定性を促進する。
2. 無限型のウェルにアクリルチャンバーの縁を通じて1月16日に穴を開けます。反対側に繰り返します。はさみで0.2ミリメートルのアクリルシートまたは井戸底として機能するように、レーザーカッターから小さな長方形をカットします。
3. 0.2ミリメートルのアクリルの片面に速乾性接着剤の薄いが完全な層を適用し、チャンバーの底に接着します。室の底にしっかりと所定の位置に0.2ミリメートルのアクリルを保持し、分配する接着剤は、シールを作成しても表示領域を覆う回避することを可能にする界面での接着剤。その縁がチャンバ壁の端と同一平面であり、それは完全に無限室カットアウトを覆うようにアクリルを合わせてください。これは、十分なジェットの浸透を可能にし、ウェルの漏洩を防ぐことができます。
4. 開けた穴をカバーするために天然ゴムの2小片をカット。穴の周囲速乾性の接着剤を適用します。確保にピンセットですべての領域に穴を押し上でゴムを配置します。両方開けた穴について、この手順を繰り返します。漏れを防....

Results

私たちは、機械加工部品や手動マイクロメートルから組み立てたカスタムステージ（ 図1）と、従来の倒立蛍光顕微鏡でミクロ流体噴射セットアップを組み立てています。インクジェットの特性評価は、小胞の生成プロセスへの洞察を提供します。インクジェットノズルと脂質二重層との間の距離を変化させることにより、力が膜の変形を生じさせるために適用影響を及ぼす。二重層のすぐ近くには、ジェット気流を当て、離れて小胞の発生点からのエネルギーを分散させることから、膜を防ぐことができます。渦旅行我々の期待します（ 図2）と一致して圧電アクチュエータに印加される電圧に応じて増加する。小胞形成と代表は小胞は、図3に示されている噴出。 図3aは microjettingによって小胞形成のための代表的な画像シーケンスを示している。形成に続いて、小胞の安定性は、小胞diameteに変化する傾向があるrは、小さな小胞は、より安定である。

Discussion

多くの技術が電鋳、エマルション、液滴発生^14-16を含む、小胞の生成のために開発されている。ただし、新しい実験技術は、生体系に成長して類似性を有する生物学的システムの設計を可能にするために必要です。特にマイクロ流体の方法は近い生物学にベシクルモデルをもたらし、膜unilamellarity、サイズの単分散性、および内部のコンテンツ^17,18を管理するコントロールのレベルの増加を提供してきました。さらに、マイクロ流体噴射を使用して特徴付けおよび実験は、有効配向膜タンパク質の組み込み、膜非対称、およびカプセル化^3,13を示している。

この手法は簡単ですが、注意すべきであるいくつかのステップが含まれています。アクリル板と天然ゴムの両方が製造中に無限室を完備し、シールを形成しなければならない。そうでなければ、無限型のウェルが漏れるとrますISK二重層の安定性。実験準備中に、研究者は最初に、各コンポーネントを取り付けた後、完全に空気の注射器を真空に確認する必要があります。このアセンブリ内の気泡は、ジェット内の圧縮可能ボリューム.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
圧電インクジェット	MicroFab技術	MJ-AL-01-xxx	xxxはミクロン単位のオリフィス直径を示します
ジェットドライブIIIコントローラ	MicroFab技術	CT-M3-02
高速カメラ	ビジョン研究	MiroEX2
DPhPC脂質 クロロホルム	Avanti	850356C	の小さなアリコートで注文
フィルター、0.2 & マイクロ;m	フィッシャー サイエンティフィ	SLGV033RS
1 ml シリンジ	フィッシャー サイエンティフィ	14823434
n-デカン	アクロス オーガニック	111871000
グルコース	アクロス オーガニック 410950010
ショ糖	Sigma-Aldrich	S7903-1KG
メチルセルロース	フィッシャー サイエンティフィック サイエンティフィ	ック NC9084958
1/8 インチ アクリル	マクマスター カー	8560K239	無限大のチャンバーの CAD デザインはご要望に応じてご利用いただけます
0.2 mm アクリル	アストラ製品	クラレックス クリア 001
アクリル セメント	TAP プラスチック	10693
ロックタイト 495 瞬間接着剤	フィッシャー サイエンティフィ	NC9011323
ロックタイト 3494 UV 強化接着剤	ストロベル供給	30765
天然ゴム	マクマスター	カー85995K14
カスタムステージ	自家製	N / A	CADデザインはリクエストに応じて利用可能です