マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

サマリー

液滴界面の脂質二重層に対するマイクロ流体噴射は、膜の非対称性、膜貫通タンパク質の取り込み、および材料のカプセル化を制御して小胞を生成するための信頼できる方法を提供します。この技術は、区画化された生体分子が所望される生体系の様々な研究に適用することができる。

要約

ボトムアップ合成生物学は、潜在的に生化学系と、最小限の生物を調査し、再構成するための新しいアプローチを提示します。この新興分野は、下から上に複雑な、機能してシステムへの基本的な生物学的なコンポーネントを設計し、組み立てる技術者、化学者、生物学者、物理学者を行っています。このようなボトムアップのシステムは、基本的な生物学的問い合わせや、革新的な治療法^1,2人工細胞の開発につながる可能性があります。巨大単層小胞（GUVs）は、それらの細胞様膜構造とサイズに合成生物学のためのモデルのプラットフォームとして機能することができます。マイクロ流体吐出、又はmicrojettingは、制御された大きさ、膜組成、膜貫通タンパク質の取り込み、およびカプセル³を有するGUVsの生成を可能にする技術である。この方法の基本原理は、懸濁リットル変形するピエゾ作動式インクジェット装置によって生成された複数の高周波流体パルスの使用であるGUVに重層をIPID。プロセスは、石鹸膜でシャボン玉を吹くに似ています。噴出液、包含する溶液の組成、および/または成分の組成を変化させることによって二重層に含まれる、研究者は、カスタマイズされた小胞を作成するためにこの技術を適用することができる。本稿ではmicrojettingにより液滴界面二重層から簡単な小胞を生成するための手順について説明します。

概要

これは、細胞生物学の分子から細胞への我々の理解を統合することが含まマルチスケール問題であることがますます明らかになってきた。その結果、分子が個別に動作し、正確にどのように知ることは複雑な細胞の挙動を理解するには十分ではない。これは^、5を抽出するアフリカツメガエルにおける脂質二重層小胞^4、紡錘体とアクチンネットワーク相互作用の再構成によって例示されるように、部分的には多成分系の射出挙動の存在であり、細菌の細胞分裂機械⁶の空間的なダイナミックス。生体系の分子プロセスを解剖の還元主義のアプローチを補完する一つの方法は、生物学的要素の最小セットを使用して細胞挙動を再構成する逆のアプローチを取ることです。このアプローチの重要な部分は、限られた量の生体分子の信頼性の高いカプセル化、細胞の重要な機能が含まれます。

e_contentは">いくつかの戦略は、バイオミメティックシステムを研究するための生体分子をカプセル化するために存在する。最も生物学的に関連システムは、細胞の細胞質膜によって課される生化学的および物理的な制約を模倣する脂質二重膜、である。電鋳⁷による巨大単層小胞（GUVs）の形成、精製タンパク質を操作するための問題である可能性がありGUV世代¹⁴のために最も広く使用される技術の一つは、通常、高塩緩衝液⁸との互換性がないため不十分な封入収率を持っています。電鋳でも大量の試料を必要とする（> 100μL）、 、および非効率的に近接した脂質層の間の拡散の困難さに起因する大きな分子を組み込んでいる脂質小胞を生成するためのいくつかのマイクロ流体アプローチが開発されている。層を水 - 油 - 水との間の2つのインターフェイスを介して構成要素を通過するダブルエマルション法を、（W / O / W）、Voの蒸発に依存しています脂質二重層の形成^9を駆動するlatile溶媒。他のものは脂質二重層小胞¹⁰または二つの独立したステップ¹¹での連続的なストリームを生成するマイクロ流体組立ラインを使用している。我々は、急速に制御されたサイズ、組成、およびカプセル化のGUVsを生成するために液滴界面二重層^12に流体パルスを印加することに基づいて、代替技術を開発した。マイクロ流体噴射として知られている我々のアプローチは、生物学的な様々な問題を調査するための機能的な生体分子システムを作成するためのアプローチを提供し、いくつかの既存の小胞生成技術の組み合わせの利点があります。

プロトコル

1。無限チャンバー製作

1. コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して（その形状にちなんで命名）​​無限室を設計し、それがレーザーカッターと互換性があるように、ファイルを保存します。レーザーカッターで透明なアクリルで1/8- 3月16日からチャンバをカット0.15インチの中心間距離でこの形​​状、直径0.183の別々の二つの円を作成します。無限の形状は、液滴界面二重層形成および安定性を促進する。
2. 無限型のウェルにアクリルチャンバーの縁を通じて1月16日に穴を開けます。反対側に繰り返します。はさみで0.2ミリメートルのアクリルシートまたは井戸底として機能するように、レーザーカッターから小さな長方形をカットします。
3. 0.2ミリメートルのアクリルの片面に速乾性接着剤の薄いが完全な層を適用し、チャンバーの底に接着します。室の底にしっかりと所定の位置に0.2ミリメートルのアクリルを保持し、分配する接着剤は、シールを作成しても表示領域を覆う回避することを可能にする界面での接着剤。その縁がチャンバ壁の端と同一平面であり、それは完全に無限室カットアウトを覆うようにアクリルを合わせてください。これは、十分なジェットの浸透を可能にし、ウェルの漏洩を防ぐことができます。
4. 開けた穴をカバーするために天然ゴムの2小片をカット。穴の周囲速乾性の接着剤を適用します。確保にピンセットですべての領域に穴を押し上でゴムを配置します。両方開けた穴について、この手順を繰り返します。漏れを防ぐために、すべての接着の接続が完了したシールであることを確認してください。
5. 針23 G、1を用いて、圧電方式のインクジェット先端部の挿入を容易にするために、チャンバの両側に天然ゴムに穴を突く。

2。実験の準備

-20℃の冷凍庫でクロロホルムに店頭在庫の脂質溶液。この研究では、1,2 - diphytanoどちらかイル-sn-グリセロ-3 -ホスホコリン（DPhPC）または1,2 -ジオレオイル-sn-グリセロ-3 -ホスホコリン（DOPC）を用いた。 25 mg / mlの脂質溶液は、一般的に、このプロトコル中で調製し、-20℃で保存した場合、2ヶ月間続くの2ミリリットル

1. n-デカン中の脂質を再懸濁するためには、最初の小さなガラスジャーにストックバイアルからそれを転送し、アルゴンまたは窒素下で乾いた。脂質がより速く乾燥させ、ガスにより多くの表面積を露出するように乾燥しながら角度でjarファイルを保持します。
2. わずかにねじ込まジャーのキャップを、乾燥した溶液は、1〜2時間デシケーター内で真空下に座ることができます。その後、25 mg / mlので脂質を再溶解するためにn-デカンを追加します。渦簡単に脂質溶液で15分間にわたり浴超音波処理器中でそれを超音波処理。 -20℃でn-デカン中に再構成する脂質を保存する
3. 株式ショ糖溶液を調製します。 1.5 mlのマイクロチューブに、300 mMスクロースの900μLと100μLを追加1％のメチルセルロース（MC）。メチルセルロースは、吐出するのに役立つ溶液の粘度を増加させるために添加される。オプションのステップ：それぞれ、撮像において、よりコントラストや蛍光を貸して暗い色の食用色素や蛍光ビーズのオプションの1を添加する。この溶液は、細胞の浸透圧を一致させ、microjettingの間にコントラストを提供するように設計300ミリオスモルスクロース溶液である。
4. 使い捨て1ミリリットルのプラスチックシリンジに溶液を描く。先端が上を向いて注射器を保持した状態で、先端に向かって気泡を追い出すために繰り返しシャフトをフリックして、閉じ込められた空気を排出するためにプランジャーを押してください。それが噴出する責任の適切な圧電収縮を妨害するように、先に進む前に、注射器からすべての空気を抜くようにしてください。
5. 注射器の端部に0.22μmのフィルターを取り付けます。フィルターに捕捉されるから空気を防ぐために、垂直方向に注射器を保持し、液滴がチップ上に形成されるまで、プランジャーを押してください。注：A33ミリメートル直径のシリンジフィルターユニットが最適に機能することが見出されたが、直径3mmのシリンジフィルターなどのような別の小さなフィルターはデッドボリュームを低減するために使用することができる。
6. インクジェットの雌ルアーアダプターを外し、しっかりとフィルターの端の上に所定の位置に押し込みます。ここでも、空気を閉じ込める防ぐために流体を噴射。インクジェットの上でねじ込みます。それが完全に取り付けられた後、流体は、インクジェットの先端に移動する必要があります。

3。機器を準備を進め

1. V-クランプを使用して、顕微鏡ステージ上で注射器アセンブリをマウントします。インクジェットコントローラ、インクジェットからのワイヤを接続します。注：カスタム·ステージは、このプロトコルのために構築した;ステージデザインは、ユーザによって決定することができるが、それは注射器及び試料ホルダのxy制御xyzの独立した制御を有することが重要である。
2. 所望の撮影を実現するために拡大し、必要なレンズの組み合わせを決定します。ここで、10×対物レンズおよび10倍の接眼レンズを使用する。
3. 噴射と小胞の生成を可視化するために高速度カメラ（≥千FPS）を使用します。イメージングに先立ち、必要に応じて、カメラのキャリブレーションを行う。画像キャプチャを開始するために、カメラのソフトウェア内の画像ベースの自動トリガーを使用しています。
4. 顕微鏡ステージ上に無限チャンバーをマウントします。ステージ上で所定の位置にテープでチャンバーを固定します。
5. （ 図1bを参照）、天然ゴムに穴をあけ穴にインクジェット先端を慎重に位置を合わせます。これを行うには、室内に近いインクジェットを持参し、目で位置を調整し、顕微鏡レンズを通してより正確な調整を行う。粗い動きがインクジェット先端に損傷を与えることができるよう、慎重に進んでください。
6. インクジェットが整列されると、ウェルのロード中に、インクジェットへの損傷を防止するために、離れてチャンバからシリンジ組立部品を再生する。それは、膜の穴に合うままであるように、インクジェットの運動が単方向であることを確認してください。
7. PLUNを軽く押して、インクジェットノズルでの小滴が形成されるまで注射器アセンブリのGER。これは、いくつかの初期背圧を提供する。
8. 入力噴射パラメータ。台形バイポーラ波については、以下のパラメータを使用：20kHzのパルス周波数、3マイクロ秒の立上り時間、35秒のパルス持続時間、3秒立ち下がり時間、65 Vの印加電圧（パルス振幅）、及びトリガ100ジェットパルス（パルス数） 。しかし、印加電圧（パルス振幅）およびパルス数（トリガ当たりのジェットパルス）小胞のサイズを制御するために変えることができる。

4。小胞の生成

1. 両方の井戸の全表面をカバーする、無限室にn-デカンに懸濁し25〜30μlの脂質溶液を追加します。
2. ピペッティングゆっくりとスムーズに、よく1の最も外側のエッジに（ショ糖溶液と同じ浸透圧モル濃度の）25μlのグルコースを追加します。グルコースおよび脂質溶液が混合しないので、堆積の際、グルコースの低下は、形成すべきである。別の25を追加1、別のドロップを作り、5〜10分以内に室内の中央にある脂質二重膜を形成することに反対でなく、グルコースのL。
3. 天然ゴムを介してインクジェットを挿入し、慎重に液滴界面二重層に向けて案内する。導入されたインクジェットボリュームを置換し、二重層を破壊することができるように、ゆっくりと二重層にアプローチ。
4. インクジェットは〜200μmの範囲内にある場合は、ステップ3.8で説明した設定で噴射を適用します。二重層からの距離が他のパラメータの中で、電圧およびパルス数に応じて、主に変化し得る。このプロトコルは、徐々に設定（電圧やパルス数）を増加し、二層の変形を観察することをお勧めします。

5。洗浄装置

1. 顕微鏡ステージから注射器を切り離し、1ミリリットルのプラスチックシリンジとフィルターを処分。
2. インクジェットをきれいにする、solutioに先端を浸漬することによって順番に次の解決策を吸引nは7〜10倍各々 ：70％エタノール、温水中の2％Neutrad溶液、70％エタノール、および蒸留H ₂ Oをインクジェットは、吸引ピペットに安全に収まらない場合は、アダプターを形成するために、ピペットチップをカット。
3. ティッシュでチャンバーを乾かします。 5〜10分間、2％（v / v）の温水にNeutrad、超音波処理して250ミリリットルのビーカーに無限室を配置します。超音波処理の後、完全に圧縮された空気の下に井戸を乾燥。ウェル中の水分は、脂質二重膜の安定性を損なうことができるので、それはまた、チャンバ15分間60℃のオーブン内に配置されることが推奨される。

結果

私たちは、機械加工部品や手動マイクロメートルから組み立てたカスタムステージ（ 図1）と、従来の倒立蛍光顕微鏡でミクロ流体噴射セットアップを組み立てています。インクジェットの特性評価は、小胞の生成プロセスへの洞察を提供します。インクジェットノズルと脂質二重層との間の距離を変化させることにより、力が膜の変形を生じさせるために適用影響を及ぼす。二重層のすぐ近くには、ジェット気流を当て、離れて小胞の発生点からのエネルギーを分散させることから、膜を防ぐことができます。渦旅行我々の期待します（ 図2）と一致して圧電アクチュエータに印加される電圧に応じて増加する。小胞形成と代表は小胞は、図3に示されている噴出。 図3aは microjettingによって小胞形成のための代表的な画像シーケンスを示している。形成に続いて、小胞の安定性は、小胞diameteに変化する傾向があるrは、小さな小胞は、より安定である。

ディスカッション

多くの技術が電鋳、エマルション、液滴発生^14-16を含む、小胞の生成のために開発されている。ただし、新しい実験技術は、生体系に成長して類似性を有する生物学的システムの設計を可能にするために必要です。特にマイクロ流体の方法は近い生物学にベシクルモデルをもたらし、膜unilamellarity、サイズの単分散性、および内部のコンテンツ^17,18を管理するコントロールのレベルの増加を提供してきました。さらに、マイクロ流体噴射を使用して特徴付けおよび実験は、有効配向膜タンパク質の組み込み、膜非対称、およびカプセル化^3,13を示している。

この手法は簡単ですが、注意すべきであるいくつかのステップが含まれています。アクリル板と天然ゴムの両方が製造中に無限室を完備し、シールを形成しなければならない。そうでなければ、無限型のウェルが漏れるとrますISK二重層の安定性。実験準備中に、研究者は最初に、各コンポーネントを取り付けた後、完全に空気の注射器を真空に確認する必要があります。このアセンブリ内の気泡は、ジェット内の圧縮可能ボリューム...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
圧電インクジェット	MicroFab技術	MJ-AL-01-xxx	xxxはミクロン単位のオリフィス直径を示します
ジェットドライブIIIコントローラ	MicroFab技術	CT-M3-02
高速カメラ	ビジョン研究	MiroEX2
DPhPC脂質 クロロホルム	Avanti	850356C	の小さなアリコートで注文
フィルター、0.2 & マイクロ;m	フィッシャー サイエンティフィ	SLGV033RS
1 ml シリンジ	フィッシャー サイエンティフィ	14823434
n-デカン	アクロス オーガニック	111871000
グルコース	アクロス オーガニック 410950010
ショ糖	Sigma-Aldrich	S7903-1KG
メチルセルロース	フィッシャー サイエンティフィック サイエンティフィ	ック NC9084958
1/8 インチ アクリル	マクマスター カー	8560K239	無限大のチャンバーの CAD デザインはご要望に応じてご利用いただけます
0.2 mm アクリル	アストラ製品	クラレックス クリア 001
アクリル セメント	TAP プラスチック	10693
ロックタイト 495 瞬間接着剤	フィッシャー サイエンティフィ	NC9011323
ロックタイト 3494 UV 強化接着剤	ストロベル供給	30765
天然ゴム	マクマスター	カー85995K14
カスタムステージ	自家製	N / A	CADデザインはリクエストに応じて利用可能です