方法論記事

ネズミ異心臓移植技術

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DOI：

10.3791/51511

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2014年7月8日

 , 
1Colorado Center for Transplantation Care, Research and Education and Division of Pulmonary Sciences and Critical Care Medicine, University of Colorado Denver

この記事について

サマリー

原稿は、マウスで異所性心移植を実行するために必要な手順について説明します。

要約

この技術は最初のコリー、ウィンとラッセルによって報告されて以来、現在では40年以上です。それは中に習熟し、この技術を利用する他のラボのために数年かかったが、それは現在では広く世界中の多くの研究室で使用されます。独自の技術への重要な改良点は、開発され、新見によって2001年に報告された。ここで説明する私たちの中心部にある3外科医（Plenter、グラツィア、ピエトラ）の手に10年以上にわたって進化してきた技術である。これらの技術は、現在、外科医と研究者の若い世代に渡されている。

詳細我々は他の人がこの非常に有用なモデルを使用することができる場合があり、このような方法で、ここに関係するように努力する - 主に新見の経験に基づいて、使用される手順は、細部に進化してきた。新見のように、我々は学習へのビデオの援助が初心者のための貴重な資源であることを発見した。

概要

時代には、マウスにおいて、腎臓、肺、肝臓および膵臓の移植を行うことが可能である場合、1973 1-4歴基本臓器移植および免疫学の研究の基礎は、マウスにおける異所性心臓移植モデルのままである。現在に至るまでいくつかの論文は、この手順の改善/改良5,6を詳細に発表されている。

固形臓器、主に血管新生移植のモデルとして、この手順では、誰にも劣らない。一度マスターして、この手順では、同種の拒絶反応7、慢性血管障害8および虚血再灌流障害9のメカニズムの開発に研究に適しています。

正常にこの手順を学習するためのキーは、他の手術、インストラクターや細部への研修生と注意側の忍耐のようなものです。プロセスの開始時に新しい外科医は、そのTを見つけるちょっと各移植に多くの時間を過ごすことになります。経験が得られるように、外科倍、したがって虚血は、大幅に削減されます。すべてのステップの詳細に注意を払って、遅かれ早かれ、成功につながる。

インストラクターは渡すために最善を行うことができ、かつ、これらの手術の間に遭遇する可能性のあるピットの滝のすべてを予測する一方で、「創造的な」訓練生は、おそらく、自分のいくつかを見つける！

手順は以下の通りの基本です。大動脈弓昇順ドナーは、受信者の腹部下大静脈（IVC）に吻合、端側である受信者腹部大動脈およびドナー肺動脈に吻合、端側である。血液は冠動脈へのドナーの大動脈を通して逆行で受信者の大動脈から流れます。血液は、それが冠静脈洞を介して右心房に排出する冠状系を介して流入した後、右心室に送り込まれ、受信者IVCに肺動脈を介して。このようにして、冠動脈のシステムは、動脈血を供給され、洞調律は、再灌流の1〜2分以内に移植片に戻ります。心臓の左室が下にロードされた本質的圧力であるため、左心室自由壁は、時間の経過とともに萎縮します。

プロトコル

全ての動物は、動物実験委員会の承認の下でコロラド大学のバーバラデイビスセンター動物施設での病原体を含まない条件下で飼育し、NIHガイドラインに従って世話された。

手順開始後麻酔の深さは、最初に足指のピンチによって、および呼吸速度の遵守によって判断される。

1。ドナー心臓の収穫

  1. ペントバルビタール（60 mg / kgのIP）を注入することにより、ドナーマウスを麻酔。
  2. 4ウェイの制約により、マウスを固定し、毛皮をクリップ。アルコールで皮膚を拭きます。
  3. 肌を離れて解剖した後、横隔膜のすぐ下横切開を行うことによって、腹腔を開きます。
  4. 沿岸挿入にダイヤフラム後部をカットし、前方および上方に心をさらす前胸壁を持ち上げます。
  5. 胸の左右に後側方胸腔をカット全層を拡張します。
  6. 隔離する下大静脈（IVC）と右心房への挿入に隣接し、IVCの周りの緩い5-0絹縫合糸を配置。
  7. IVCに4℃のヘパリン化生理食塩水（200 U / CC）の1.0 CCを注入し、5-0絹縫合し、分裂と血管を結紮する。
  8. 同様の方法で右上大静脈（RSVC）を単離と5-0絹縫合および除算と連結する。
  9. 静かに動物の右側に向かって心をロールと左上大静脈（lSVC）を単離、5-0絹縫合糸で結紮し、左肺動脈を露出する分割。
  10. 胸腺が離れて主肺動脈（PA）と左右のPAの枝から鈍い解剖している間に濡れたガーゼの下に心を確保し、大動脈弓の昇順。
  11. 周囲の組織の大動脈弓自由を解剖鈍らせる。マイクロはさみは右上腕橈側動脈に大動脈近位に分割するために使用される、すなわち心と分裂の間には枝があってはならない大動脈のポイント。
  12. 大動脈弓のこのセクションでは、注入プロセスのための動脈カフを形成する。
  13. PAのトランクとPAの左右の枝を露出させ下方大動脈カフを反映している。
  14. 離れて、可能な限り心臓から周囲の組織から、左右のPAの枝を解剖鈍らせる。これは、周囲の組織からのPAトランクを容易に解剖することができます。
  15. 、などの遠位に可能な限り、その分岐部のすぐ近くのPAトランクを分割します。肺動脈のこのセクションでは、注入プロセスのための静脈カフを形成する。
  16. ハートとネクタイのベースの周りに5-0絹縫合糸を配置します。心臓は、次いで塩基で遊離切断し、4℃の生理食塩水中に置かれる。総収穫期は約です。 10〜15分。

2。ハートインプラント技術

  1. （必要に応じて60 mg / kgのIP初回投与、25 mg / kgのIP補足用量）ペントバルビタールとレシピエントマウスを麻酔。
  2. 毛皮をクリップ4ウェイの制約により、マウスを固定化し、滅菌方法でポビドンヨードやドレープで皮膚を取
  3. 2センチメートル正中垂直腹部切開を行い、腹腔を入力してください。
  4. 上方腸を撤回し、胸に上の外部化。ケース全体に無菌湿ったガーゼ（滅菌生理食塩水）に包まれて保管してください。
  5. 吻合部位に劣るし、腎血管下の腹部大動脈と下大静脈（IVC）を分離し、大動脈の周りに4-0綿のネクタイを配置し、IVC優れた。
  6. フィールド内の任意の腰椎血管を特定し、10-0ナイロン縫合糸で結紮。
  7. 綿の絆を結び、最初劣るが、優れた。このようにして、いくつかの血液は、大動脈切開を容易に製造する大動脈内に保持される。
  8. 大動脈の内腔を入力するように30gの針で大動脈切開を形成している。約2mmの長さに細かいマイクロハサミで切開を拡張します。この切開は長いに沿って直線的に作られている容器のitudinal軸。
  9. 以下の方法で受信者の大動脈にドナーの大動脈の側吻合に終止符を作る。ドナーの大動脈内および受信者の大動脈とネクタイの切開の下角に10-0ナイロン縫合糸滞在ステッチを配置します。ドナーの大動脈と腹部大動脈とネクタイの切開の優れたコーナーに最初に反対の第二10-0ナイロンを配置します。
  10. 大動脈の側壁に優れたから下位まで実行されている縫合線を作成し、以前に置か滞在ステッチに対して接続します。あなたはステッチとして一緒intimas（内容器面）必ず持参してください。次に、実行中のファッションやネクタイに内側を縫合。それぞれの側の最初と最後のステッチは、可能な限り滞在ステッチの近くに配置してください。その後、5ステッチの合計を作る、これら二つの間3等間隔のステッチを持っていることを目指しています。
  11. 以下の方法で受信者にIVCドナー肺動脈の側吻合に終止符を作る。 PunctURE 30gの針でIVCと約ための切開を延長する。細かいミクロはさみで2ミリメートル。この切開部は、容器の長手方向軸に沿って直線状に形成されている。
  12. 10-0ナイロンでIVCを切開の劣るコーナーにドナー肺動脈を結ぶ。ドナー動脈とIVCとネクタイの切開の優れたコーナーに最初に反対の第二10-0ナイロンを配置します。
  13. 肺動脈とIVCとタイの間で実行されている縫合線を作る。それぞれの側の最初と最後のステッチは、可能な限り滞在ステッチの近くに配置してください。その後、7編目の合計を作る、これら二つの間5等間隔のステッチを持っていることを目指しています。
  14. 静脈流を再確立遠位4-0綿のネクタイを離します。
  15. 静脈吻合部の止血が観察された後、近位4-0綿ネクタイを徐々に緩め、動脈吻合は、止血のために観察される。両方の吻合が安全であると考えているときは、Cを削除マウスのオットン絆。
  16. 腹部に腸を返します。腹壁を実行している様式で5-0シルク縫合糸を用いて2層に閉じられる。
  17. クロージングの際に輸液蘇生などの腹部に、滅菌、温かい生理食塩水1.0ミリリットルボーラスを投与して、生理食塩水0.8ミリリットルを手術後に皮下注射する。これ以外の支援策は、手術中に必要とされない。加温ブランケットに動物を回復する。総インプラントの時間は約です。初心者のための90〜120分、経験のある45〜60分。ブプレノルフィン鎮痛、0.05 mg / kgで、サウスカロライナ、手順の最初に0.1〜0.2ミリリットルと72時間後にOPごとに6月12日時間を管理する。

3グラフト査定

  1. 腹を触診により毎日の移植片機能を評価する。
  2. それは腹腔内注射を与えるべきであるかのように、マウスを押したままにします。
  3. 優しく腹壁に対する人差し指の先端を押して、鼓動strを確かめる移植片のengthと規則性。
  4. （非拍動が移植片を拒絶した）0に触診品質4（通常の振幅と周波数）からスコアを与える。

重要事項：

すべての楽器は、滅菌され、滅菌手袋は作業中は身に着けられているし、無菌のフィールドが維持されている。ドナーとレシピエントの手術は、手術用顕微鏡を用いて行われる。吻合が「クリーン」であることを確認してください。即ち、ステッチを配置するときに背面壁が捕捉されないということである。これは重要なくびれが麻痺肢の後肢に失敗した移植片にし、極端な場合には、その意志を超える可能性が高い結果が流れるようになります。また、全層が血管外膜と縫合針の内膜が達成されるなど、渡すことが極めて重要です。エッジのEvertionもシールや吻合の治癒を助ける内膜への内膜の接触があることを保証します。別の極めて重要な事実または吻合縫合線の張力も最適であることを保証されている。緩すぎると不可逆的な漏れがあるでしょう、きつすぎると流れるように狭窄が発生します。動脈側の場合は混雑の心はなり静脈側にあれば、これは、移植片の不十分な灌流になります。

結果

この手術法の利用は、単純な移植片生/除去の研究、または非常に複雑な実験プロトコルのどちらかの道を開きます。以下に簡単に図に記載の研究では、（もしあれば）のFasおよび/またはCD4 T細胞媒介心臓拒絶反応の機序として、パーフォリン、関与を定義しようとした。これは、今日利用可能なマウス系統の異常な配列によって可能になりました。結果は、CD4エフェクターT細胞による心臓同種移植片の拒絶反応は、移植片の直接Fas発現とT細胞のパーフォリン発現の代替的な寄与を必要とすることを実証する。我々の知る限り、これは、CD4 T細胞による細胞溶解活性は、 インビボでの一次急性同種移植片拒絶のための絶対的な役割を果たすことができるという最初の実証である。

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。図1パーフォリンおよびFasが （Fasリガンド欠損）CD4 T細胞が、B6 ラグを再構築するために利用された偏性およびCD4 T細胞媒介心臓拒絶 B6、B6 PFPKO（パーフォリンノックアウト）とB6のGLD の平行した経路を表現 - / -心臓同種移植片LPR C3H野生型またはFasを欠損C3Hの受信者。 CD4 T細胞からのドナー心臓または除去または単独のパーフォリンから一人でのFas（コントロール重量C3H + B6 CD4 T細胞対♦、P = NS）の除去（制御重量C3H + B6 CD4 T対■、P = NS細胞）が拒絶反応を排除しませんでした。興味深いことに、エフェクターCD4 T細胞からのFasLの除去は（●はp <有意重量C3H + B6 CD4 T細胞対0.02、p <重量C3H + B6 PFPKO CD4 T細胞、およびp対0.01 <0.01対を遅延拒絶反応を行った。のC3H のlpr + B6 CD4 T細胞）。しかし、ほとんどの同種移植はまだ（5の4）拒否されました。重要なことに、両方のドナーのFasおよびCD4 T細胞のパーフォリンの同時除去完全に抑止拒絶（○はp <0.002対対照重量C3H + B6 CD4 T細胞、C3H重量+ B6 PFPKO CD4 T細胞、およびC3Hのlprを B6 CD4 + T細胞）。この廃止は大幅に、より堅牢なCD4 T細胞のFasLの個々の除去以外だった（○、P <0.003対コントロール重量C3H + B6のGLD CD4 T細胞）。グラツィアら 10から。許可を得て転載。

ディスカッション

この手術法は、習得することは容易ではないが、一度マスターして、強力な研究ツールである。研究者/外科医は技術の一貫性により、細部へのこだわりによって報われる。学習段階の間に忍耐が鍵となります。新見3によって発行され、ビデオベースの学習ツールを用いてそれが最初に成功した手順を達成するための試みが11〜90％の成功率を達成するために78試行の平均をとる。動画は、手術11,12の重要な教育ツールとなっている。

トラブルシューティング

吻合から出血は発生し、これが原因縫合糸で正しい緊張の欠如、または少なすぎ、縫合糸のいずれかに思われることがあります。このようなゲルフォームなどの凝固誘導剤は、リークを低減するために有用になることができますが、我々は、外科医が得意技に頼ることをお勧めします。混雑した非拍動している心臓は、特に静脈側にあまりにもタイトな吻合に最も一般的である。非beatiNG、非灌流移植片は、一般的に冠状動脈の1に移動した気泡が原因で発生します。これは、血管への気泡の侵入を避けるために湿らせたツーぬれ場を維持することが重要である。

技術の限界

研究者は、完全に機能する心臓への影響を調査したい場合、この手法は適していない。それは、現在までに実行することは不可能証明された同所移植技術を必要とするでしょう。

既存の方法に関して意義

1は、マウスで完全に血管新生し、固形臓器移植への影響を研究することを希望した場合、心臓モデルは、おそらくマスターするのが最も簡単です。肺、腎臓および肝臓移植のマウスモデルが存在するが、多くを学ぶことが困難と完璧ですか。

プロトコル内での重要なステップ

それは非常に重要であることを全層P血管外膜と縫合針の内膜を含むロバが達成される。エッジのEvertionもシールや吻合の治癒を助ける内膜への内膜の接触があることを保証します。別の極めて重要な要因は、吻合縫合線の張力も最適であることを保証することである。緩すぎると不可逆的な漏れがあるでしょう、きつすぎると流れるように狭窄が発生します。動脈側の場合は混雑の心はなり静脈側にあれば、これは、移植片の不十分な灌流になります。

なかでも、繰り返し、手順や細部への継続的な注意の一貫性は素晴らしい結果とfundableと発行可能なデータが得られます。

開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

著者は、私たちの研究室で彼の前の仕事のために博士ビアジオピエトラに感謝したいと思います。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
InstrumentRoboz #Fine Science Tools #Arosurgical #
Straight micro-discutting sersip #5RS-501511295-51
湾曲したmicro-discuting 鉗子 #7RS-504711297-00
湾曲した鋸歯状鉗子RS-513711052-10
バンナスマイクロ解剖ハサミ、ショートRS-561009.140.08
マイクロ解剖ハサミ、ストレート、シャープ、ロング11.602.11
マイクロスプリングハンドルニードルホルダー11.549.15
ストレート蚊鉗子91308-12
マイクロ解剖ハサミ、ストレート、鈍いRS-596214078-10
マイクロ解剖ハサミ、湾曲、鈍いRS-598114079-10
マイクロリトラクターRS-6540
計器トレイ、10インチ x 6 ½”x ¾"RT-1350S
シルク縫合糸、5/0、22.5 m スプール18020-50
10/0 ナイロンT4A10Q07
5/0 シルクE19A05N
グローブバイオゲル from Medex Supply
DrapesPrecept, #64-9012-9
SyringesB-D 1 cc インスリン、#329424
コットンアプリケーターフィッシャーブランド、#23-400-100
ポビドン-ヨウ素綿棒PDI、#B40600
4/0 コットンタイ器具付きオートクレーブ滅菌済み 国産コットン

参考文献

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