Method Article

子宮摘出標本から初代ヒト子宮内膜間質細胞の確立するための2つの方法

DOI:

10.3791/51513

⸱

May 23rd, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Virginia, 2Department of Obstetrics & Gynecology, University of Virginia

In This Article

Summary

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子宮摘出標本からの一次子宮内膜間質細胞培養系を確立することは、貴重な生物学的な手法と先行研究の目的の広大な配列を追求する重要なステップである。ここでは、ヒト患者の外科的に切除された子宮内膜組織からの間質培養物を確立するために使用される2つの方法を記載する。

Abstract

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多くの努力が、インビトロ細胞培養系で確立するために専念している。これらのシステムは、in vivoでの膨大な数のプロセスをモデル化するように設計されている。人間の子宮内膜のサンプルから生じる細胞培養システムも例外ではありません。アプリケーションでは、通常のサイクリックな生理的プロセスからこのような婦人科癌、感染症、生殖不備などの子宮内膜の病変の範囲です。ここでは、外科的に切除、子宮内膜子宮摘出標本からの一次子宮内膜間質細胞を確立するための2つの方法を提供する。第一の方法は、「削り法」と呼ばれ、第2の方法と呼ばれるのに対して、外科的または剃刀の刃を用いて機械的掻き取りを組み込んで、「トリプシン法」この後者の方法は、細胞の分離および原発を促進するために、トリプシンの酵素活性を使用し細胞伸長。私たちは、デジタル画像や顕微鏡を通してステップバイステップの方法論を示している。我々はまた、提供します：定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（定量PCR）及び免疫蛍光（IF）を介して、子宮内膜間質細胞株を検証するための電子例。

Introduction

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ヒト子宮コーパス3層、子宮外膜（又は漿膜）、子宮筋層及び子宮内膜から構成されている。これらの層のそれぞれを区別することは、子宮内膜細胞株を確立するための重要なステップである。子宮外膜は子宮の最も外側の層であり、薄い、漿液細胞からなる。子宮筋層の厚さの中間層であり、平滑筋細胞からなる。子宮内膜は、子宮の内層として同定され、上皮および間質細胞集団を含む。

子宮内膜は、さらに、その幹細胞集団は、約28日ごとに1 functionalis層を再増殖すると仮定されている基底層に細分される。ヒト子宮内膜のfunctionalis層は、ホルモンの循環に応じて、重要な生化学的および形態学的変化を受ける。これらのホルモンは、下垂体や卵巣から派生しています。

ザ·コー​​ディネートの生産と生殖周期におけるホルモンの結果のリリース。生殖周期は、潜在的な胚着床イベントの子宮内膜を作製するように設計されている。ヒトでは、生殖周期」は、月経周期」として知られており、3つの段階に分け - 増殖、分泌、および月経。分泌期がfunctionalis成熟によってマークされているのに対し、増殖期はfunctionalis子宮内膜層の増殖を伴う。具体的には、細胞外の変化、分泌物、および細胞分化は、潜在的な注入を知らせる。注入は分泌期の終了前に発生しない場合は、functionalis子宮内膜層は月経期の間に流されている。月経とfuncti....

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Protocol

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本稿で使用し子宮摘出標本は、IRB - HSR＃14424の番号が大学のIRB承認された倫理プロトコルの一致に集めた。

臨床ソースから1。サンプル取得

  1. 開始前に政府と制度に基づく倫理指針と承認の文書を入手します。
  2. 無菌状態のすべての手順を実施しています。
  3. サンプルはすぐに培養中に処理できない場合は、4℃で50ミリリットルチューブにメディア（RPMIまたはDMEM /高グルコース）中で、患者由来の組織を維持する。サンプルは、24時間の最大この状態で保存することができる。
  4. 1X滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で組織試料を3回洗浄し、洗浄の間、溶液を捨てる。

スクレイピング方式を使用して、プライマリ細胞株の2。準備

  1. 成長培地（RPMI、10％ウシ胎仔血清および1％ペニシリン - streptomyを補充したDMEM /高グルコース4-10 mlを加えCIN）組織に、30分間ファンギゾン（0.25μg/ mlの最終濃度）を追加します。
  2. 増殖培地を廃棄する。
  3. 1X PBSで2回組織を洗浄します。
  4. 子宮筋層と子宮内膜層（図にさらなる説明のために図2A〜図2Cを参照）との間で区別するために6cmの細胞培養プレート上の組織を置く。子宮内膜....

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Results

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プロトコルセクションで強調したように、ヒト組織を処理し、準備する際にすべての政府の下での方法、制度的、および倫理指針を実施するようにしてください。

この原稿に含まれる一次子宮内膜培養物を確立するために使用される「スクレイピング方法」の一般的なワークフロー（ 図1A）および「トリプシン法」（ 図1B）を示す図である。これらの方法は、 プロトコルのセクションに詳細に記載されている（部分1を参照-図3）。どちらの方法でも、原発内膜培養物の増殖に成功したことを証明。 「スクレイピング方式」の利点は、短縮準備時間である;と比較して4倍長い - しかし、それは生存細胞を観察するのにかかる時間は、通常2である「トリプシン法」。

組織の調達から受信した最初のヒト組織のデジタル画像が提供される。子宮層によって区別す​​ることができる層の粗さは、子宮筋層が厚いと筋肉で、子宮内膜が薄く、より収量すなわち<.......

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Discussion

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他のグループについておよびコラゲナーゼ4,12,13,15-18を利用するほとんどが子宮内膜間質培養物を調製するための方法を適応している。本稿では、我々は経済的な理由とトリプシンの便利な利用可能性および/またはカミソリの刃のために私たちの研究室で利用され、どちらも2単純化された主要な子宮内膜間質培養法のための方法論と証拠を提供した。

我々の2つの方法を比較すると、両方が成功し実行可能な初代培養を生成する。当社の好ましい方法は、より小さなサンプルサイズの要件に、より高い収量が一般的に存在するようにトリプシン法である。準備時間が限られている場合トリプシン法を用いて細胞をプレーティングする時間半以上かかるのに対し、しかし、掻き取り方法は、30分を要する。

また、注目すべきは、子宮内膜生検とは対照的に、我々は子宮摘出標本で、これらの方法を示すことである。子宮内膜バイオpsiesは、有意な侵入せずに採取し、小さい試験片を製造する傾向がある。それでも、この原稿（特にトリプシン法）に記載された方法は、子宮内膜生検からの.......

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Disclosures

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著者らは、開示することは何もない。

Acknowledgements

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我々は彼らのイメージング顕微鏡設備の使用のために博士タオダンと彼女の研究室のメンバーの共同の努力に感謝します。我々はまた、子宮組織を私たちに提供するためのバイオレポジトリーおよび組織研究施設（BTRF）コア、ジェフ·ハーパー、バージニア大学の住民に感謝。私たちは、回路図の概要のヘルプはカロルSzlachtaに感謝します。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25トリプシンまたは0.05%トリプシン HycloneSH3023602 or SH30004202
1.7 micro Centrifuge Tube  ジェネシーサイエンティフィック22-272A
1 & マイクロ;L、20 µL、200 mlおよび1,000 &l ピペット  ジェネシー・サイエンティフィック24-401,24-402, 24-412, 24-430
15 ml コニカルチューブ Hyclone339650
50 mlコニカルチューブ ハイクロン339652
6cm細胞培養皿 Thermo scientific12-556-002
8ウェルチャンバー Thermo ScientificAB-4162
アセテート フィッシャーサイエンティフィックC4-100
AMV RT酵素/バッファー Bio LabsM077L
ウシ血清アルブミン (BSA) フィッシャーサイエンティフィックBP-1605-100
緩衝亜鉛ホルマリン サーモ59201ZF
チャコールストリップFBS フィッシャーNC9019735
クロロホルム フィッシャーサイエンティフィックBP1145-1
カバースリップ フィッシャーブランド12-544D
サイクリックAMP(cAMP) シグマB7880
DMEM/高血糖 ハイクロンSH30243FS
dNTP バイオラインBIO-39025
ロバ対ヤギ -TRITC サンタクルスSC-3855
ドンキーセラム ジャクソン研究室017-000-002
E カドヘリン抗体  エピトミクス1702-1
エタノール フィッシャーサイエンティフィックBP2818-1
シ胎児血清(FBS) フィッシャーサイエンティフィ03-600-511
ファンジゾン アムホテリシン B Gibco15290-018
GAPDHプローブ ライフテクノロジーHS99999905
グリコーゲン 5Prime2301440
ヤギ アンチ マウス - FITC ジャクソンs ラボ115-096-003
イソプロパノール フィッシャーサイエンティフィックBP2618-1
カナマイシン  フィッシャーサイエンティフィックBP906-5
ドロキシプロゲステロンアセテート(MPA) SigmaM1629
MeOH(メタノール) フィッシャーサイエンティフィックA4-08-1
封入剤 (DAPI付) ベクターラボラトリリーH-1500
N6 DNAオリゴ Invitrogen
Number 15 スクレーパー  BD371615
パンサイトケラチン マウスmAB 細胞シグナル伝達4545
PBS (リン酸緩衝生理食塩水) フィッシャーサイエンティフィックBP-399-4
ペニシリン-ストレプトマイシングルタミン溶液100X  ハイクロンSV30082.01
PML アンチヤギ アンチボディ サンタクルスSC-9862
プライマー ユーロフィンRPMI
 ハイクロンSH30027FS
RPMI(フェノールフリー) Gibco11835
Sybr Green  Thermo ScientificAB-4162
Taqman サーモAB-4138
トリゾール ライフテクノロジーズ 15596018
ビメンチン抗体 エピトミックス4211-1
ウック ズ メ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heller, D. in The endometrium: a clinicopathologic approach. Heller, D. , 56-75 (1994).
  2. Emera, D., Romero, R., Wagner, G. The evolution of menstruation: a new model for genetic assimilation: explaining molecular origins of maternal responses to fetal inva....

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