子宮摘出標本から初代ヒト子宮内膜間質細胞の確立するための2つの方法

サマリー

子宮摘出標本からの一次子宮内膜間質細胞培養系を確立することは、貴重な生物学的な手法と先行研究の目的の広大な配列を追求する重要なステップである。ここでは、ヒト患者の外科的に切除された子宮内膜組織からの間質培養物を確立するために使用される2つの方法を記載する。

要約

多くの努力が、インビトロ細胞培養系で確立するために専念している。これらのシステムは、in vivoでの膨大な数のプロセスをモデル化するように設計されている。人間の子宮内膜のサンプルから生じる細胞培養システムも例外ではありません。アプリケーションでは、通常のサイクリックな生理的プロセスからこのような婦人科癌、感染症、生殖不備などの子宮内膜の病変の範囲です。ここでは、外科的に切除、子宮内膜子宮摘出標本からの一次子宮内膜間質細胞を確立するための2つの方法を提供する。第一の方法は、「削り法」と呼ばれ、第2の方法と呼ばれるのに対して、外科的または剃刀の刃を用いて機械的掻き取りを組み込んで、「トリプシン法」この後者の方法は、細胞の分離および原発を促進するために、トリプシンの酵素活性を使用し細胞伸長。私たちは、デジタル画像や顕微鏡を通してステップバイステップの方法論を示している。我々はまた、提供します：定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（定量PCR）及び免疫蛍光（IF）を介して、子宮内膜間質細胞株を検証するための電子例。

概要

ヒト子宮コーパス3層、子宮外膜（又は漿膜）、子宮筋層及び子宮内膜から構成されている。これらの層のそれぞれを区別することは、子宮内膜細胞株を確立するための重要なステップである。子宮外膜は子宮の最も外側の層であり、薄い、漿液細胞からなる。子宮筋層の厚さの中間層であり、平滑筋細胞からなる。子宮内膜は、子宮の内層として同定され、上皮および間質細胞集団を含む。

子宮内膜は、さらに、その幹細胞集団は、約28日ごとに¹ functionalis層を再増殖すると仮定されている基底層に細分される。ヒト子宮内膜のfunctionalis層は、ホルモンの循環に応じて、重要な生化学的および形態学的変化を受ける。これらのホルモンは、下垂体や卵巣から派生しています。

ザ·コー​​ディネートの生産と生殖周期におけるホルモンの結果のリリース。生殖周期は、潜在的な胚着床イベントの子宮内膜を作製するように設計されている。ヒトでは、生殖周期」は、月経周期」として知られており、3つの段階に分け - 増殖、分泌、および月経。分泌期がfunctionalis成熟によってマークされているのに対し、増殖期はfunctionalis子宮内膜層の増殖を伴う。具体的には、細胞外の変化、分泌物、および細胞分化は、潜在的な注入を知らせる。注入は分泌期の終了前に発生しない場合は、functionalis子宮内膜層は月経期の間に流されている。月経とfunctionalis層の脱落をトリガーするイベントの重要性はまだ議論されています。ヒトでは、月経が知られている特定の中間分泌期の分化事象の結果であると提起されている「自発的脱落膜化^」2など。本稿では、両方の子宮内膜間質細胞の単離方法の詳細な方法論を提供し、これらのアプローチの有効性を実証するために、免疫蛍光、デジタル画像の組み合わせを使用する。加えて、我々は一般的に適用される子宮内膜間質細胞の単離を確認するために、自発的な脱落膜化のインビトロモデルにおいて使用される。

プロトコル

本稿で使用し子宮摘出標本は、IRB - HSR＃14424の番号が大学のIRB承認された倫理プロトコルの一致に集めた。

臨床ソースから1。サンプル取得

1. 開始前に政府と制度に基づく倫理指針と承認の文書を入手します。
2. 無菌状態のすべての手順を実施しています。
3. サンプルはすぐに培養中に処理できない場合は、4℃で50ミリリットルチューブにメディア（RPMIまたはDMEM /高グルコース）中で、患者由来の組織を維持する。サンプルは、24時間の最大この状態で保存することができる。
4. 1X滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で組織試料を3回洗浄し、洗浄の間、溶液を捨てる。

スクレイピング方式を使用して、プライマリ細胞株の2。準備

1. 成長培地（RPMI、10％ウシ胎仔血清および1％ペニシリン - streptomyを補充したDMEM /高グルコース4-10 mlを加えCIN）組織に、30分間ファンギゾン（0.25μg/ mlの最終濃度）を追加します。
2. 増殖培地を廃棄する。
3. 1X PBSで2回組織を洗浄します。
4. 子宮筋層と子宮内膜層（図にさらなる説明のために図2A〜図2Cを参照）との間で区別するために6cmの細胞培養プレート上の組織を置く。子宮内膜を分離する。
5. 6cmの細胞培養皿上に引っ掻きながらメスまたはカミソリの刃を用いて小片に組織を離断。これらの傷は、新興主要な子宮内膜細胞の付着を促進する。トリプシン法と比較して、より多くの組織を（近似図2Dを参照）が必要である。
6. 優しく、傷ディッシュ（組織片が見え、理想的に引っ掻き運動から固定化されます）に増殖培地の2ミリリットルを追加します。
7. 指定された細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO _2）、プレート（単数または複数）を転送する。離れてOTHから、一次細胞株のための場所を指定するER細胞培養皿。初代培養は、感染および汚染に敏感です。
8. 毎日、光学顕微鏡下で細胞を調べます。細胞の小集団がスライスされた組織（図3Bを参照）の周囲から一日2または3で出現する必要があります。
9. 、文化を維持し、1X PBSで優しく洗って3日ごとに新鮮な増殖培地（2ミリリットル）を追加する。時増殖速度が増加すると、追加の増殖培地（3-4 ml）を6cmの培養プレート（単数または複数）に添加することができる。
   注意：洗濯やメディアの変更時には、組織片は、おそらく吸引されます。これは接着細胞の成長に影響を与えません。新しいコロニーが1週間後に出現する可能性は低いように組織片は、次の工程（2.10）により吸引しなければならない。
10. 0.05％トリプシンを用いて80％コンフルエント（図3B参照）、通路- 6cmのプレートは、約75である場合。初代細胞は無限に継代することができません - 2または3のプレートがMAであるとすぐに、細胞の1プレートを下に凍結intained。複数の通路が必要な場合は、（参考文献³に概説されている）不死化プロトコルに従う。

トリプシン法を使用して、プライマリ細胞株の3。準備

1. カナマイシン（0.03 mg / mlの最終濃度）を添加した0.25％トリプシン2mlに子宮内膜組織の小片（近似図2Dを参照）を配置します。
2. 30分間回転台上で37℃で組織をインキュベートする。
3. 簡単に言えば、組織をボルテックスする。
4. 2分間200〜400×gでサンプルを遠心分離し、上澄みを捨てる。
5. 新鮮なトリプシンおよびカナマイシンを追加します。
6. 時間回転させながら37℃で組織をインキュベートする。
7. 5月10日秒のための組織をボルテックスする。
8. トリプシンを不活性化する（10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充した）増殖培地を2mlを加える。
9. 2〜3分間200〜400×gで遠心分離細胞。
10. 上清を捨て、成長の2ミリリットルを追加ペレット化した細胞への番目のメディア。
11. 6cmの細胞培養皿にプレート。 スクレイピング方式を使用して、プライマリ細胞株を調製する工程2.5のようにプレートをこすることは必要ありませんが、初代培養の取り付けと成長を強化します。
12. 毎日、光学顕微鏡下で細胞を監視します。細胞（図3C参照）24〜48時間後に光学顕微鏡では通常表示されます。
13. 文化を維持するために、細胞を監視し、ステップ2.9のように2〜3日ごとにメディアを変更。
14. 細胞が75〜80％の集密度（図3cを参照）に達したときに通路に細胞は、0.05％、0.25％トリプシンを使用しています。

4。追加分析のための組織（スナップ凍結し、ホルマリン固定）を保存する

1. 1X PBSで2回サンプルを洗ってください。
2. 可能な限り液体として吸引除去する。
3. スナップ凍結のため、（図2Fおよび2Gを参照してください）1.7遠心管に子宮内膜組織サンプルを置く。 1.7を配置遠心分離管10秒間液体窒素中またはまで、組織を凍結していることがわかる。
   注：サンプルを調製する際に、直接液体窒素に触れないように注意してください。サンプルは、さらなる処理または分析するまで-80℃で保存することができる。
4. ホルマリン固定のために、（図2H参照）子宮内膜組織の小片にカットし、10％緩衝ホルマリン中で亜鉛沈める。 24時間後、ホルマリンを破棄し、さらなる処理まで組織サンプルに70％エタノールを加える。

5。免疫蛍光（IF）

1. 細胞固定
   1. 培養スライドまたはプレート上の細胞を準備します。
   2. 優しく、1×PBSで細胞を洗浄。
   3. 5分間予め冷却（4℃）メタノール及びアセトン（1:1の比で混合）を添加する。
   4. 空気が進む前に、スライドを乾燥させます。必要に応じて、スライドは1〜2週間4℃で保存することができる。
2. 処理IF
   1. 10分間、1X PBSで細胞を再水和する。 FOのためにllowingは回転プラットフォーム上のすべての洗浄およびインキュベーションを行って、1〜6を繰り返します。
   2. 1X PBSを使用してブロックを1％ウシ血清アルブミン（BSA）を補充し、室温（RT）で30分間、1％の種特異的血清（2 ^回目の抗体の供給源）。
   3. （抗体希釈用の製造業者の推奨を参照）一次抗体でインキュベートする。特異的な抗体のための材料を参照してください。ステップ5.2.2のように新鮮なブロッキング緩衝液中で一次抗体を希釈します。このインキュベーションはRTで、または一晩4℃で少なくとも2時間行うことができる
   4. 5分ごとに1×PBSで3回洗浄する。
   5. 二次抗体でインキュベートする（抗体希釈用の製造業者の推奨を参照してください）​​。ステップ5.2.2のように新鮮なブロッキング緩衝液中で二次抗体を希釈します。光退色を防止するために、光の非存在下でこの以降の処理を行うことが重要である。
   6. 5分ごとに1×PBSで3回洗浄する。
   7. ThoroughlYは、スライドを乾燥させます。
   8. 封入剤およびDAPI対比溶液を加える。
   9. カバースリップを適用し、シール剤（複数可）を使用してエッジをシールする。スライドは2週間まで、暗所で4℃で保存することができる。

6。RNA抽出

1. 遠心分離により1×10 ⁷細胞をペレット化。このプロトコルのすべての材料および試薬は無しRNaseする必要があります。
2. 溶解の1ミリリットルTRIZOL試薬中の細胞および核タンパク質複合体の解離を完了するために、室温で10分間均質化したサンプルをインキュベートする。
3. TRIZOLの1ミリリットル当たり200μlのクロロホルムを追加します。 15秒間、手でよく振るし、室温で2〜3分間インキュベートする。
4. 4℃で15分間、最大速度（15,000×g）で遠心分離する3つの層が発生します。
5. 新しいマイクロチューブに上部の水相を転送します。 RNA収量を高めるために1μlのグリコーゲンを追加します。しかしながら、このステップは必要なときに小RNAの量が予想される。
6. 水層にイソプロピルアルコール0.5ミリリットルを追加し、サンプルを3〜5回転倒。室温で10分間、サンプルをインキュベートする。収率を増加させるために、試料を30分間、-20℃または-80°Cに配置することができる。
7. 4℃で10分間最大速度で遠心分離する
8. この時点で、RNAの小さなペレットが表示されるはずです。上清を捨てる。
9. 75％エタノール1mlでRNAを洗ってください。
10. 5分間最大速度で遠心し、上清を捨てる。サンプルは、無機汚染物質を取り除くためにもう一度洗浄することができますが、この手順は必要ありません。
11. RNAのペレットが乾燥するまで簡単に言えば、（通常は7月10日分かかります）RNAペレットを乾燥させます。
    注：One追加の工程は、無機物質を減少させ、乾燥時間を減少させるために使用することができる。追加分吸引残液の最大速度でエタノール洗浄、スピンサンプルから上清を捨てた後。ペレットを吸引しないように注意してください。
12. RNAペレットのサイズに応じて、RNaseを含まない水にRNAを溶解する。ボリュームは、一般的に10〜50μLの範囲です。
13. 10分間55℃でサンプルをインキュベートし、RNAの濃度を測定する。
14. さらなる処理まで-20℃で保存したサンプル。

7。逆転写

1. H ₂ Oで9μLの容量にサンプルRNA（1-3μgのを）持って来る
2. 10分間70℃に加熱するRNA。
3. のdNTP5μlの（50μMの作業濃度）、N6のDNAオリゴの5μL（80μmの作用濃度）、5×AMVバッファーを5μl、およびAMVの1μL：AMVマスターミックスを生成するには、以下の試薬を組み合わせて。このマスターミックス溶液は、1サンプルあたりに設計されている。
4. 加熱されたRNAにマスターミックス16μLを加える。最終反応容量は25μl反応であろう。
5. （第1段階）で90分間42℃で、（駅：逆転写のため、以下のPCR条件を使用し5分、さらなる処理まで（第3段階）、4℃ためシチズン2）95°C。

8。リアルタイムPCR

1. 表1に示すプライマーアニーリング温度、サイクル数、および試薬を用いてPCR反応を行う。
   注：（ 材料会社、カタログ番号を参照）PCR試薬を使用する際に、製造業者の指示に従うことが理想的です。

図9（参考文献⁴および⁵由来） インビトロ脱落膜化プロトコル

1. 子宮内膜細胞をプレート。
2. 75から85パーセントの集密度まで成長する。
3. 細胞がコンフルエントになった後、1×PBSで1回洗浄。
4. すぐに、（フェノールを含まないRPMI 5％の木炭ストリップFBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充した）ホルモンを含まない培地を追加します。
5. 24時間後、1μMおよび8 - ブロモアデノシン3の最終濃度で酢酸メドロキシプロゲステロン（MPA）を補充したホルモンフリー培地 '、5'を追加-環状一リン酸（cAMP）を0.5mMの最終濃度で。
6. 少なくとも48時間後、反応を停止し、さらなる処理のために、プレート（単数または複数）を保存する。

結果

プロトコルセクションで強調したように、ヒト組織を処理し、準備する際にすべての政府の下での方法、制度的、および倫理指針を実施するようにしてください。

この原稿に含まれる一次子宮内膜培養物を確立するために使用される「スクレイピング方法」の一般的なワークフロー（ 図1A）および「トリプシン法」（ 図1B）を示す図である。これらの方法は、 プロトコルのセクションに詳細に記載されている（部分1を参照-図3）。どちらの方法でも、原発内膜培養物の増殖に成功したことを証明。 「スクレイピング方式」の利点は、短縮準備時間である;と比較して4倍長い - しかし、それは生存細胞を観察するのにかかる時間は、通常2である「トリプシン法」。

組織の調達から受信した最初のヒト組織のデジタル画像が提供される。子宮層によって区別す​​ることができる層の粗さは、子宮筋層が厚いと筋肉で、子宮内膜が薄く、より収量すなわち<...

ディスカッション

他のグループについておよびコラゲナーゼ^{4,12,13,15-18を}利用するほとんどが子宮内膜間質培養物を調製するための方法を適応している。本稿では、我々は経済的な理由とトリプシンの便利な利用可能性および/またはカミソリの刃のために私たちの研究室で利用され、どちらも2単純化された主要な子宮内膜間質培養法のための方法論と証拠を提供した。

我々の2つの方法を比較すると、両方が成功し実行可能な初代培養を生成する。当社の好ましい方法は、より小さなサンプルサイズの要件に、より高い収量が一般的に存在するようにトリプシン法である。準備時間が限られている場合トリプシン法を用いて細胞をプレーティングする時間半以上かかるのに対し、しかし、掻き取り方法は、30分を要する。

また、注目すべきは、子宮内膜生検とは対照的に、我々は子宮摘出標本で、これらの方法を示すことである。子宮内膜バイオpsiesは、有意な侵入せずに採取し、小さい試験片を製造する傾向がある。それでも、この原稿（特にトリプシン法）に記載された方法は、子宮内膜生検からの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25トリプシンまたは0.05%トリプシン	Hyclone	SH3023602 or SH30004202
1.7 micro Centrifuge Tube	ジェネシーサイエンティフィック	22-272A
1 & マイクロ;L、20 µL、200 mlおよび1,000 &l ピペット	ジェネシー・サイエンティフィック	24-401,24-402, 24-412, 24-430
15 ml コニカルチューブ	Hyclone	339650
50 mlコニカルチューブ	ハイクロン	339652
6cm細胞培養皿	Thermo scientific	12-556-002
8ウェルチャンバー	Thermo Scientific	AB-4162
アセテート	フィッシャーサイエンティフィック	C4-100
AMV RT酵素/バッファー	Bio Labs	M077L
ウシ血清アルブミン (BSA)	フィッシャーサイエンティフィック	BP-1605-100
緩衝亜鉛ホルマリン	サーモ	59201ZF
チャコールストリップFBS	フィッシャー	NC9019735
クロロホルム	フィッシャーサイエンティフィック	BP1145-1
カバースリップ	フィッシャーブランド	12-544D
サイクリックAMP(cAMP)	シグマ	B7880
DMEM/高血糖	ハイクロン	SH30243FS
dNTP	バイオライン	BIO-39025
ロバ対ヤギ -TRITC	サンタクルス	SC-3855
ドンキーセラム	ジャクソン研究室	017-000-002
E カドヘリン抗体	エピトミクス	1702-1
エタノール	フィッシャーサイエンティフィック	BP2818-1
シ胎児血清(FBS)	フィッシャーサイエンティフィ	03-600-511
ファンジゾン アムホテリシン B	Gibco	15290-018
GAPDHプローブ	ライフテクノロジー	HS99999905
グリコーゲン	5Prime	2301440
ヤギ アンチ マウス - FITC	ジャクソンs ラボ	115-096-003
イソプロパノール	フィッシャーサイエンティフィック	BP2618-1
カナマイシン	フィッシャーサイエンティフィック	BP906-5
ドロキシプロゲステロンアセテート(MPA)	Sigma	M1629
MeOH(メタノール)	フィッシャーサイエンティフィック	A4-08-1
封入剤 (DAPI付)	ベクターラボラトリリー	H-1500
N6 DNAオリゴ	Invitrogen
Number 15 スクレーパー	BD	371615
パンサイトケラチン マウスmAB	細胞シグナル伝達	4545
PBS (リン酸緩衝生理食塩水)	フィッシャーサイエンティフィック	BP-399-4
ペニシリン-ストレプトマイシングルタミン溶液100X	ハイクロン	SV30082.01
PML アンチヤギ アンチボディ	サンタクルス	SC-9862
プライマー	ユーロフィンRPMI
	ハイクロン	SH30027FS
RPMI(フェノールフリー)	Gibco	11835
Sybr Green	Thermo Scientific	AB-4162
Taqman	サーモ	AB-4138
トリゾール	ライフテクノロジー	ズ 15596018
ビメンチン抗体	エピトミックス	4211-1