後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

サマリー

免疫染色は、組織内の特定の細胞タイプやタンパク質を可視化するための効果的な技術です。超音波処理を利用することにより、ここに記載されているプロトコルは、免疫染色の前に後期胚および幼虫からショウジョウバエ・メラノガスター組織を解剖する必要性を軽減する。私たちは、ホルムアルデヒド固定全マウント幼虫の免疫染色のための効率的な方法を提供します。

要約

キイロショウジョウバエの胚および幼虫において行われた研究は、このような細胞の運命仕様と器官形成などの発生過程に重要な洞察を提供する。免疫染色は、組織および器官の開発の可視化を可能にする。しかし、胚発生の最後に形成した保護キューティクルは後期胚および幼生への抗体の浸透を防ぐことができます。免疫染色の前に切開を定期的にショウジョウバエ幼虫の組織を分析するために使用される小さな組織を見つけて単離することは困難であるので、それはいくつかの分析のために非効率的な証明する。超音波処理は、幼虫ショウジョウバエの免疫染色プロトコルにおける解剖の代替手段を提供します。これは、後期胚および幼虫の大量の迅速、同時処理を可能にし、 その場で 、形態に維持します。ホルムアルデヒドで固定した後、試料を超音波処理する。次いで、試料を、抗原特異的な一次蟻で免疫染色が施されるibodiesおよび蛍光標識した二次抗体は、蛍光顕微鏡を介して標的細胞型および特定のタンパク質を可視化した。超音波処理の過程で、上記サンプル音波処理プローブ、ならびに超音波処理の持続時間および強度の適切な配置は重要である。標準免疫染色プロトコルへのadditonal小さな変更は、高品質の汚れのために必要とされ得る。対雑音比が低い信号を有する抗体については、より長いインキュベーション時間は、典型的には必要である。この超音波処理促進性プロトコルのためのコンセプトの証明として、発達段階の範囲で3の組織型（精巣、卵巣、および神経組織）の免疫染色を示している。

概要

ショウジョウバエの胚および幼虫は多くの器官および組織中の発達過程を研究するための優れたモデルを提供する。個別の細胞のイメージングは​​、細胞が発達する複雑な環境を確認するために、これらの研究においてしばしば必要である。組織中の細胞の可視化は、免疫染色により達成することができる。プロトコルは17時間産卵^（AEL）1-3の後、胚ショウジョウバエ組織 <のために存在する免疫染色よく記載。有効な抗体の浸透を防止胚発生の終了に向かったが、保護キューティクルフォーム、。したがって、これらの免疫染色のプロトコルは、後期胚における組織の分析においてと幼虫の発育（ ^第 1齢（L1）、2 ^番目の齢（L2）、及び^第3齢（L3））のその後の段階で非効率的である。この非効率性は、この拡張された発育期間⁴中に発生した動的プロセスの理解に対する障壁を課している。 TISSUE郭清はこの障壁^5-7を回避するために広く使用される技術である。しかし、解剖は非効率的な証明することができます。抽出は、胚および幼虫の組織を配置するか、単離することの難しさによって妨げてもよい。また、標的組織の物理的除去は、それらを破壊するか、またはその全体でそれらを抽出するために失敗することによって損傷を与える可能性がある。

超音波処理は、分子間相互作用を妨害するため....

プロトコル

コレクションケージの調製

1. CO ₂で、若い、肥沃なハエを麻酔。ケージに麻酔をかけたハエを転送します。最適な収率を得る4で生後2-7日に至るまで、100〜120大人のハエを使用するには、次の男性に、女性の1の割合。許可前固定のための試料を得るに〜24時間、適切な順応期間を飛ぶ。 48時間順応期間 - ケージは処女雌で設定されている場合は、使用36、オスと交配。
2. ケージの開放端には、ケージの開口部に中央に酵母ペーストのダイムサイズのドロップで事前に準備されたリンゴジュース寒天プレートを配置。その後、テープで固定します。リンゴジュース寒天プレートとパラフィルムとケージとの間の接合部をシール。
3. ベースとしてリンゴジュース寒天プレートと第2の容器にケージを置き、ハエが、実験によって決定される適切な期間のために定義温度で再現することができます。
   注：サンプル収集時間のWI変化しちゃう。後期胚/早期のL1幼虫収集する際に、例えば、（17から24時間）、ハエは25℃で17時間前に、サンプルの老化に25℃で7時間、リンゴジュース寒天プレート上に卵を産むことができます。同様に、半ば後半最初の幼虫の収集のため（36から48時間）ハエが25℃で36時間前に、サンプルの老化に25℃で12時間、卵を産むことができます。
4. 期間が完了するとハエは麻酔なし離れリンゴジュース寒天プレートからドロップするように、テーブルの上にケージをタップします。すばやく酵母ペ....

結果

その場での後期胚および幼虫の組織の分析において超音波処理ベースの免疫染色の有効性を実証するために、野生型の胚および幼虫は精巣、卵巣、および神経組織の免疫染色のために処理した。サンプルは、共焦点顕微鏡を介して画像化した代表的な結果は、（ 図1及び図2）が示されている。結果は、記述されたプロトコルは、 ショウジョウバエの開発の初期/中期のL3段階を経て、後期胚の間に形態学的特徴だけでなく、 その場における個別の細胞を可視化するために有効であることを明らかにした。

精巣イムノ結果：
精巣の発達は、精巣の成熟が幼虫の発育を通じて動的であるため、プロトコルの有効性を説明するための特に良いシステムです。大人のショウジョウバエの精巣は^、13を参照してください（生殖細胞系列幹細胞（GSC）ニッチが配置さ1盲端とコイル状の管を形成レビューのための14）。このニッチでは、GSCsは、ハブと呼ば.......

ディスカッション

このプロトコルは、成功したので、解剖の必要性を排除し、 その場でターゲットショウジョウバエ胚および幼虫組織を免疫染色する方法を提供する。初期胚の^1,2,3を染色するための従来のプロトコルに従って、絨毛膜は、50％の漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム）を用いて除去される。サンプルは、ホルムアルデヒドおよびメタノール中で固定されている。幼虫のクチクラ古いサンプルが浮いてしまうため、試料全体はその後幼虫保持を確実にするために、セルストレーナーを通過させる。サンプルは、化学グレードのメタノール中に、必要に応じて、格納されている。再水和した後、適切に実装され、超音波処理プロセスは、幼虫のクチクラの完全性を破壊する。これは免疫染色のために必要な抗体の十分な浸透を可能にするためにキューティクルを形成した後に非常に重要です。 5％正常血清でサンプルを、抗体を適用する前に、ロッキング/ BBTw溶液は、過剰な非特異的抗体結合を防ぎます。一次抗体は、特定のタンパク質EXPRESを検出するために追加される標的組織内のsed。未結合一次抗体を除去するために洗浄した後、フルオロフォアに結合した二次抗体が結合した.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
表1:試薬と緩衝液
リン酸緩衝液 Triton X-100 (PBTx)			5 L用:500 ml PBS 10X、4.45 L ddH2O、50 ml Triton 10%.RTで保管してください。
リン酸緩衝液生理食塩水10X(PBS 10X)			dH2Oの1Lの場合:80 g NaCl、2 g KCl、14.4g Na2HPO4、2.4 g KH2PO4。コンポーネントを追加し、適切な体積まで充填します。4°Cで保管してください。
トリトン10%			50mlの場合:トリトン5ml、PBS 10X5ml、ddH2O45mlを混ぜる。RTで保管してください。
PEMS			0.1 M パイプ (pH 6.9)、2.0 mM MgSO4、1.0 mM EGTA。RTで保管してください。
パイプ			0.25 M溶液(pH 6.9)400 mlの場合:30.24 gパイプdH20 NaOH。パイプを300mlのdH2Oに溶解し、NaOHでpH6.9に調整します。dH2Oとオートクレーブで総容量を400mlにします。RTで保管してください。
ホルムアルデヒドメタ			ノール中の37重量%ホルムアルデヒド。ホルムアルデヒド、ヘプタン、メタノール廃棄物の混合物は、施設のガイドラインに従って廃棄する前に、ヒュームフード内の密閉容器に保管してください。
ヘプタン		CAS 142-82-5	n-ヘプタン。ホルムアルデヒド、ヘプタン、メタノール廃棄物の混合物は、施設のガイドラインに従って廃棄する前に、ヒュームフード内の密閉容器に保管してください。
メタノール		CAS 67-56-1	RTで保管 ホルムアルデヒド、ヘプタン、およびメタノール廃棄物の混合物は、機関のガイドラインに従って廃棄する前に、ヒュームフード内の密閉容器に保管してください。
リン酸緩衝液Tween(PBTw)			1 Lを作るには:100 ml PBS 10X、890 ml ddH2O、10 ml Tween 10%。すべてのコンポーネントを追加した後、滅菌をろ過します。4°Cで保管してください。
Tween 10%			For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. 混ぜる岩。RTで保管してください。
ウシ血清アルブミン/リン酸緩衝液Tween(BBTw)			1 Lを作るには:100 ml PBS 10X、890 ml ddH2O、10 ml Tween 10%、1 gウシ血清アルブミン(BSA)。BSAを添加し、0.2 μM真空フィルターユニット。4°Cで保管してください。
正常なヤギ血清 (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	10 mlを作るには: 正常なヤギ血清 10 ml ddH2O. NGSのバイアルにddH2Oを加え、0.2 μm syrningeフィルター。アリコートは-20°Cで保管してください。
1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン価(DABCO)		CAS:281-57-9	100 mlを作るには:25 ml ddH2O、1 ml Tris HCl(1M、pH 7.5)、2.5 gのDABCO固体、3.5 ml 6N HCl、250 μl 10N NaOH、70 mlグリセロール。攪拌棒付き250mlビーカーに、ddH2O、Tris HCl、DABCOを加えます。攪拌し、6N HCl、10N NaOH、およびグリセロールを加えます。次に、溶液がpH 7.5に達するまで10N NaOHを滴下します。因数。アリコートは-20°Cで保管してください。
DABCO + p-フェニレンジアミン(PPD)溶液			1.765 ml NaHCO3、0.353 Na2CO3、0.02 g PPD(CAS:106-50-3)。PPDをNaHCO3およびNaCO3溶液に溶解します。60 μ を加算します。PPD溶液のlを500μDABCOのl。アリコートは-20°Cで保管してください。
りんごジュースプレート			~200枚のプレートを作るには:45 gの寒天(CAS#9002-18-0)、45 gのグラニュー糖(店で購入)、500 mlのリンゴジュース(で買った)、15 ml Tegosept 10%、1.5 ml ddH2O. 4 LフラスコでddH2Oに寒天を加え、30分間オートクレーブします。リンゴジュースの混合物をオートクレーブ保存した寒天に徐々に加えます。加熱した攪拌板で混合し、10 mlの容量を35 mmのシャーレに分注し、RTで静止させて固めます。4°Cで保管してください。
テゴセプト10%			100mlを作るには:テゴセプト10g、エタノール100ml。アリコートは-20°Cで保管してください。
イーストペースト			~50gの乾燥活性酵母。酵母を含むビーカーにddH2Oを徐々に加え、ペースト状の粘稠度に達するまで攪拌します。4°Cで保管してください。
表2:染色材料
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000、5 mg / mlで保存。
ウサギの反ヴァーサ			1:250、ルース・レーマンからの贈り物。
マウス抗ファシクリン	III発達研究ハイブリドーマバンク(DSHB)	7G10	1:10
マウス抗1B1	発達研究ハイブリドーマバンク(DSHB)	1B1	1:4
グニエア豚抗トラフィックジャム			1:2500、Dorthea Godtからの贈り物(Li et al、2003)。
マウス抗プロスペロ	発生研究 ハイブリドーマバンク(DSHB)	プロスペロMR1A	1:10
ラット抗ELAV	発達研究 ハイブリドーマバンク(DSHB)	7EBA10	1:30
マウス抗レポ	発生研究 ハイブリドーマバンク(DSHB)	8D12	1:10
ヤギ抗ウサギ Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
ヤギ抗マウス Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
ヤギ反グニエア豚 Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
ヤギ抗ラット Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
表3:材料と機器
手作りのフライケージ	;ジェネシー・サイエンティフィック・コーポレーション	該当なし。ボトル:32-130;既製のケージ:59-101	クリアキャストアクリルチューブ(直径1 3/4インチ)を400rpmのコンパウンドマイターソーで4インチの高さのセグメントに切断することによって作られました。超微細ステンレス鋼のスクリーニング(アクリルコンパンド接着剤で浴槽の一端に取り付けられました。空のフライフードボトルを使用する別の方法は、Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4にあります。ケージは、ジェネシー・サイエンティフィック・コーポレーション(Genesee Scientific Corporation)からも購入できます。
ソニケーター:ブランソン250デジタルソニファイア	ブランソン	モデル:ブランソンデジタルソニファイア250
ソニケータープローブ	ブランソン	モデル#:102C(CE)	EDP:101-135-066;S/N: OBU06064658
シリンジ フィルター	Nalgene	190-25-20	0.2 μmセルロース、アセテートメンブレンフィルター
イメージングシステム:多色光源付きスピニングディスク共焦点顕微鏡、デジタルCCDカメラ、イメージングソフトウェア	顕微鏡:オリンパス、光源:Lumen Dynamics、カメラ:Q-Imaging、イメージングソフトウェア:(株)インテリジェントイメージング		顕微鏡:DSUスピニングディスクを装備したBX51、光源:X-Cite 120Q、カメラ:RETIGA-SRV、イメージングソフトウェア:Slidebook 5.0
フィルターユニット	Nalgene	450-0020	0.2 μMセルロース硝酸塩メンブレンフィルター

真空