このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色

12.6K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/51528

⸱

2014年8月14日

 ,  , 
1Department of Biology, College of William & Mary

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

免疫染色は、組織内の特定の細胞タイプやタンパク質を可視化するための効果的な技術です。超音波処理を利用することにより、ここに記載されているプロトコルは、免疫染色の前に後期胚および幼虫からショウジョウバエ・メラノガスター組織を解剖する必要性を軽減する。私たちは、ホルムアルデヒド固定全マウント幼虫の免疫染色のための効率的な方法を提供します。

要約

キイロショウジョウバエの胚および幼虫において行われた研究は、このような細胞の運命仕様と器官形成などの発生過程に重要な洞察を提供する。免疫染色は、組織および器官の開発の可視化を可能にする。しかし、胚発生の最後に形成した保護キューティクルは後期胚および幼生への抗体の浸透を防ぐことができます。免疫染色の前に切開を定期的にショウジョウバエ幼虫の組織を分析するために使用される小さな組織を見つけて単離することは困難であるので、それはいくつかの分析のために非効率的な証明する。超音波処理は、幼虫ショウジョウバエの免疫染色プロトコルにおける解剖の代替手段を提供します。これは、後期胚および幼虫の大量の迅速、同時処理を可能にし、 その場で 、形態に維持します。ホルムアルデヒドで固定した後、試料を超音波処理する。次いで、試料を、抗原特異的な一次蟻で免疫染色が施されるibodiesおよび蛍光標識した二次抗体は、蛍光顕微鏡を介して標的細胞型および特定のタンパク質を可視化した。超音波処理の過程で、上記サンプル音波処理プローブ、ならびに超音波処理の持続時間および強度の適切な配置は重要である。標準免疫染色プロトコルへのadditonal小さな変更は、高品質の汚れのために必要とされ得る。対雑音比が低い信号を有する抗体については、より長いインキュベーション時間は、典型的には必要である。この超音波処理促進性プロトコルのためのコンセプトの証明として、発達段階の範囲で3の組織型（精巣、卵巣、および神経組織）の免疫染色を示している。

概要

ショウジョウバエの胚および幼虫は多くの器官および組織中の発達過程を研究するための優れたモデルを提供する。個別の細胞のイメージングは​​、細胞が発達する複雑な環境を確認するために、これらの研究においてしばしば必要である。組織中の細胞の可視化は、免疫染色により達成することができる。プロトコルは17時間産卵（AEL）1-3の後、胚ショウジョウバエ組織 <のために存在する免疫染色よく記載。有効な抗体の浸透を防止胚発生の終了に向かったが、保護キューティクルフォーム、。したがって、これらの免疫染色のプロトコルは、後期胚における組織の分析においてと幼虫の発育（ 第 1齢（L1）、2 番目の齢（L2）、及び第3齢（L3））のその後の段階で非効率的である。この非効率性は、この拡張された発育期間4中に発生した動的プロセスの理解に対する障壁を課している。 TISSUE郭清はこの障壁5-7を回避するために広く使用される技術である。しかし、解剖は非効率的な証明することができます。抽出は、胚および幼虫の組織を配置するか、単離することの難しさによって妨げてもよい。また、標的組織の物理的除去は、それらを破壊するか、またはその全体でそれらを抽出するために失敗することによって損傷を与える可能性がある。

超音波処理は、分子間相互作用を妨害するために音波を用いる方法である。これは、神経細胞型6を開発する免疫染色するために、 ショウジョウバエの幼虫クチクラの完全性を破壊するために使用されている。このプロトコルは、直径8〜10には50μmと小さくすることができ、後期胚および幼虫の生殖腺を、免疫染色するようになってきた。このような研究により、男性生殖細胞系列幹細胞（GSC）ニッチ形成のプロセスは、後期に特徴づけられた幹細胞の発生とのdifを調節するショウジョウバエ胚 8-10とメカニズム後期胚性生殖腺と幼虫ferentiationは9-12解明されている。このように、超音波処理が原因組織サイズが難しいかもしれ組織切開への効率的な代替手段を提供します。さらに、生物全体のコンテキスト内のセルを残してその場の形態で維持し、 その場でショウジョウバエ組織の免疫染色を可能にします。ここでは、 その場での初期/中期のL3組織を後期胚の蛍光免疫染色のためのステップバイステップのプロトコルを記述します。 ショウジョウバエの生殖腺組織および神経組織の分析は、このプロトコルの有効性を実証する代表的な結果に示されている。さらに、この免疫染色プロトコルは、外側のキューティクルと他の生物において他のショウジョウバエ組織ならびに組織を分析するように適合され得る。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

コレクションケージの調製

  1. CO 2で、若い、肥沃なハエを麻酔。ケージに麻酔をかけたハエを転送します。最適な収率を得る4で生後2-7日に至るまで、100〜120大人のハエを使用するには、次の男性に、女性の1の割合。許可前固定のための試料を得るに〜24時間、適切な順応期間を飛ぶ。 48時間順応期間 - ケージは処女雌で設定されている場合は、使用36、オスと交配。
  2. ケージの開放端には、ケージの開口部に中央に酵母ペーストのダイムサイズのドロップで事前に準備されたリンゴジュース寒天プレートを配置。その後、テープで固定します。リンゴジュース寒天プレートとパラフィルムとケージとの間の接合部をシール。
  3. ベースとしてリンゴジュース寒天プレートと第2の容器にケージを置き、ハエが、実験によって決定される適切な期間のために定義温度で再現することができます。
    注：サンプル収集時間のWI変化しちゃう。後期胚/早期のL1幼虫収集する際に、例えば、（17から24時間）、ハエは25℃で17時間前に、サンプルの老化に25℃で7時間、リンゴジュース寒天プレート上に卵を産むことができます。同様に、半ば後半最初の幼虫の収集のため（36から48時間）ハエが25℃で36時間前に、サンプルの老化に25℃で12時間、卵を産むことができます。
  4. 期間が完了するとハエは麻酔なし離れリンゴジュース寒天プレートからドロップするように、テーブルの上にケージをタップします。すばやく酵母ペーストの低下を含む新鮮なものに用いられるプレートを交換してください。テープとパラフィルムで新しいプレートを固定し、ベースとしてリンゴジュース寒天プレートとケージを保管してください。
  5. 慎重に金属スパチュラで使用されるプレートから酵母のドロップを削除します。使用リンゴジュースプレートに置き、蓋と実験的に必要であれば、年齢にレイド胚を可能にする。
    注：サンプルをエージングしながら、より高い温度は、エクスペリない限り、このプレートを25℃で保存することができるLLY必要です。上記に記載されているコレクションのための胚を熟成する方法の例として（ステップ1.3のための注を参照）。老化をサンプリングする前に酵母ペーストの除去は、酵母にクロールおよびその下の寒天を分割から幼虫を防止するために行われる。残りのリンゴジュース寒天及び酵母ペースト残基は幼虫の成長のための栄養素を提供する。酵母ペーストに直接敷設胚酵母ペーストの除去によって失われているが、この損失は、染色効率を低下させることができ、サンプル中の酵母および寒天残留することが好ましい。一つは、酵母ペーストを除去しないことを選択すべきは、酵母はペイントブラシと混合し、リン酸緩衝液のTriton X-100（PBTx）で液化し、その後、固定前に、細胞ストレーナーを試料から除去することができる。

2。固定

  1. リンゴジュース寒天プレート上に置か胚は所望の時点に老化したら、慎重に目からサンプルを除去するためにリン酸緩衝液のTriton X-100（PBTx）水溶液で湿らせ、小さな絵筆を使う電子版。
    注：古い幼虫がモバイルであり、蓋の内側にクロールすることができる。このサンプルは、絵筆で除去することによって、同様に収集することができる。
  2. セルストレーナーの内側に面した尾根に対してサンプルを含んだ絵筆を拭きます。その後、PBTx溶液を含む噴霧ボトルとストレーナーの壁や絵筆をすすぐ。 PBTxソリューションをキャプチャするために、ストレーナの下にペトリ皿のカバーを置きます。
  3. すべてのサンプルは、ストレーナに転送された後に、メッシュからサンプルを調達するストレーナに十分なPBTxを注ぐ。そして、ストレーナを持ち上げ、廃液容器にペトリ皿の内容物を注ぐ。
  4. 酵母を除去し、サンプルと一緒に転送されている可能性があり、廃棄物を飛ぶために繰り返して、ステップ2.3三回。
  5. メッシュから幼虫を高めるために、ストレーナに十分な、50％の漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム）/水（のddH 2 O）水溶液を注ぐ。幼虫は5分間溶液に座ってできるようにします。その後、ストレーナを持ち上げ、tは注ぐ彼液体廃棄物容器内のペトリ皿の内容。
    注： - 絨毛膜を除去するために、22時間ブリーチのみ0歳胚のサンプルが必要である。古いサンプルへの漂白剤の塗布を省略することができるが、その含有は有害ではない。省略を希望する場合は、PBTxと、この工程で漂白剤を交換してください。希薄化後漂白剤は溶液調製の24時間以内に使用する必要があります。
  6. メッシュからサンプルを調達するストレーナに十分なPBTxを注ぐことにより、PBTxとストレーナでサンプルを洗浄します。サンプルは3分間溶液に座ってできるようにします。そして、ストレーナを持ち上げ、廃液容器にペトリ皿の内容物を注ぐ。
  7. 繰り返しステップ2.6の5倍。
  8. デイブセルストレーナーの乾燥の下​​部には、絵筆を使ってPEMS液1.75 mlを含むシンチレーションバイアルにサンプルを移す。
  9. 換気されたドラフト内で作業する、シンチレーションバイアルに37％ホルムアルデヒド250μlの試薬グレードのヘプタン8ミリリットルを追加します。
    注意：ホルムアルデヒドおよびヘプタンは危険です。 3.3 - 安全のため、換気されたドラフト内で作業し、ステップ2.9に適切な手袋を着用し続けています。
  10. バイアルを20分間200回転または同様の適度なスピードで振るようにします。
  11. 前の水相を除去することなく、シンチレーションバイアルに10mlのメタノールを加え、バイアルを1分間500rpmで激しく振りすることができます。
    注意：メタノールは危険です。換気されたドラフト内で作業し、適切な手袋を着用し続けます。
  12. シェーカーからバイアルを取り出し、すぐにフード内の液体廃棄物容器の上にセルストレーナーに内容を注ぐ。バイアルに余分なメタノールを追加し、すべてのサンプルが削除されていることを確認するために、必要に応じてセルストレーナーを介して実行。
    注：セルストレーナーがゆっくりと排出することができる。これを解決するには、より迅速にストレーナーを通して溶液を引くために、セルストレーナーの底に実験室の組織をタッチします。メタノール、ホルムアルデヒド、およびヘプタンであるべき施設のガイドラインに従って適切に廃棄するまで、適切な廃棄物容器に格納されている。
  13. 実験室の組織を用いて細胞ストレーナーの乾燥底部は、次いでメタノール0.5 mlを含む1.5mlのマイクロチューブにストレーナに取り込まれたサンプルを転送するために絵筆を使用しています。
    セルストレーナー上での乾燥からサンプルを防ぐために、一度に2.12と2.13 1バイアル複数のシンチレーションバイアルが使用されている場合は、手順：注意してください。
  14. 試料が微量遠心管に添加された後、ピペットを用いて、メタノールを除去。サンプルは、チューブの底に沈殿していることを確認してください。
  15. 試験管にメタノール約0.5ミリリットルを添加することにより微量遠心管中に試料をすすぐ。その後落ち着くピペットでメタノールを除去するためのサンプルのを待ちます。
  16. 繰り返しステップ15三回。
  17. 試験管にメタノールを0.5ミリリットルを追加し、後で使用するために℃の冷凍庫-20℃で保存する。

3。再水和および免疫染色用サンプルの調製

  1. チューブ内のサンプルを残して、ピペットを用いてマイクロチューブからメタノールを除去します。適正処理するまで、適切な廃棄容器に保管メタノール廃棄物。
    、超音波処理効率を向上させるために、試料のせいぜい3ミリメートルを1.5 mlマイクロチューブの底に沈降していない使用します。注意して​​ください。過剰のサンプルは、上記の再水和ステップを始める前に、ピペットを用いて別のチューブに移すことができる。清浄なカミソリの刃でピペットの先端をカットするピペットチップの目詰まりを防止するために使用することができる。
  2. 3分間、チューブやロックに50％メタノール/リン酸緩衝液のTween（PBTw）溶液1.0mlを追加します。
  3. 適切な廃棄容器にメタノール水溶液を取り出し、二回PBTwの1.0μlを洗い流してください。各リンス後、サンプルをピペットでPBTwをオフに描画する前に解決することができます。
  4. バイアルと岩に混ぜウシ血清アルブミン/リン酸緩衝トゥイーン（BBTw）の1.0ミリリットルを追加します。ロッカー上の3分後、SAMPを許可ルを沈降し、ピペットでBBTwを削除します。
  5. 繰り返しステップ3.4最後の洗浄後のサンプルを失うことなく、可能な限り多くのBBTwを削除するように注意しながら2回。
  6. チューブにBBTwの0.5ミリリットルを加え、チューブを氷上に置きます。

サンプルの4。超音波処理

  1. 10％最大振幅の超音波処理装置を設定し、2秒定数の超音波処理の実行時間を指定します。
    注：これらの設定は、材料および装置の表に示されている超音波処理装置に固有であり、異なる超音波処理の最適化が必要な場合があります。
  2. サンプルの超音波処理に先立って、50ミリリットルにプローブを洗浄するために、脱イオン水および実行ソニケーターで満たされたコニカルチューブをプローブ先端を配置することによって、超音波処理器プローブを清掃してください。走行後、実験室組織とドライ超音波処理器プローブ。
  3. それが位置するように、約3〜4ミリメートルのサンプルの上に試料を含有するマイクロチューブにプローブを浸し、超音波処理を開始します。
  4. Mを削除するicrocentrifuge管および超音波処理からの熱を放散し、試料を微量遠心チューブの底に沈降させるために、少なくとも30秒間、氷上に置く。
  5. 処理されているサンプルの年齢に基づいて、必要に応じて繰り返します4.3と4.4を繰り返します。
    注：最適な超音波処理のサンプル·ボリュームの場合、より若い17時間を胚は超音波処理を必要としませんが、17および24時間（ステージ17 /早-L1）との間のものが2超音波処理を必要とします。 36（初期/中期L1）、36 - - 48（中期/後期-L1）、48から60（初期/中期L2）、60から72（中期​​/後期-L2）、72から84（24との間の幼虫早期L3）、84から96（初期/中期L3）、96 - ）108（中期/後期-L3時間はそれぞれ5、9、11、13、15、18、22超音波処理を必要とする。超音波処理時間へのさらなる詳細のための議論を参照してください。
  6. BBTw回1.0ミリリットルで洗浄すること。各すすいだ後、サンプルがピペットでBBTwをオフに描画する前に解決することができます。
  7. バイアルと岩にBBTwの1.0ミリリットルを追加します。ロッカー上の3分後、サンプルをピペットでBBTwを解決して削除することができます。
  8. 繰り返しステップ4.7の2倍。

5。免疫染色

  1. マイクロ遠心チューブにBBTwで希釈した5％正常血清を添加することにより、サンプルをブロックします。 1時間ロッキング後のブロックを削除します。
    注：二次抗体が生成される種から正常血清を使用してください。
  2. 5％正常血清/ BBTw溶液中での作業濃度を適切な一次抗体を希釈します。
  3. 4℃で、または（約22°C、室温で少なくとも3時間、一次抗体溶液をOで岩石試料/ N。
    注：抗体インキュベーション時間および温度は変更になる場合があります。 O / NをRTで4℃でのインキュベーション、または3時間、典型的には十分である。しかし、2日間のインキュベーション期間は、特に古いサンプルまたは低親和性の一次抗体を使用すると、染色の品質を向上させることができる。より長いインキュベーションは、典型的には4℃で行われる。二次抗体を使用した場合、同様の考察は（5.10を参照）を行う必要があります。
  4. サンプルはに沈むことを許可マイクロチューブの底。ピペットを用いて一次抗体をオフに描画します。必要に応じて再利用するための抗体を保存します。
  5. 二回BBTwの1.0ミリリットルで洗浄すること。各すすいだ後、サンプルがピペットでBBTwをオフに描画する前に解決することができます。
  6. バイアルと岩にBBTwの1.0ミリリットルを追加します。ロッカー上の3分後、サンプルをピペットでBBTwを解決して削除することができます。
  7. 繰り返しステップ5.6の5倍。
  8. マイクロ遠心チューブに5％正常血清/ BBTw溶液を添加することによって、ブロックのサンプル。 1時間に30分間ロッキング後のブロックを削除します。
    注：この追加のブロッキング工程は必須ではありませんが、特異的な抗体の染色品質を向上させることができる。
  9. 5％正常血清/ BBTw溶液中での作業濃度を適切な二次抗体を希釈する。
  10. 露光に起因する退色低減するためにアルミホイルでマイクロチューブを包みます。 4℃で12時間〜48用の二次抗体溶液中またはRT（約22℃で少なくとも3時間岩石試料。
  11. サンプルはマイクロチューブの底に沈殿することを許可する。ピペットを用いて二次抗体をオフに描画します。
  12. 二回PBTwの1.0ミリリットルで洗浄すること。各すすいだ後、サンプルがピペットでPBTwをオフに描画する前に解決することができます。
  13. バイアルと岩にPBTwの1.0ミリリットルを追加します。ロッカー上で5分後、サンプルをピペットでPBTwを解決して削除することができます。
  14. 繰り返しステップ5.13三回。
  15. オプション：PBTw 1,000：DAPIは1に希釈し追加します。岩石試料は、3分間のアルミホイルに包まれ;その後ピペットでDAPI溶液を取り除く。サンプルはピペットでPBTwを削除する前に沈降させ、PBTwの1.0ミリリットルで5回洗浄します。
  16. -20℃でのマイクロ遠心チューブとストアに1,4 - ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン（DABCO）溶液100μl - 80を追加する。
    注：別のグリセロールベースの​​アンチフェード剤は、置換されていてもよい。

6。分析

  1. DABCO / P-フェン10μlの - スライド上にサンプルをマウントする前に、余分な5を追加メチレンジアミン（PPD）マイクロチューブに退色防止ソリューションを提供します。
    注：サンプルは、切開せずにスライドに添加することができる。スライドに添加された試料体積は、カバースリップの大きさによって変化する。スライド上にサンプルをピペッティングすると、ピペットチップは、試料の剪断を防止するために、カミソリの刃を用いて切断することができる。それは簡単な分析のために列にサンプルを並べることが有用であることが多い。付加的な退色防止剤としてPPDの添加は必要とされないかもしれないが、サンプルは長期間保存した場合、光退色を防止することができる。
  2. 静かにサンプル上のカバーガラスを配置します。マニキュアを使用して適切な位置で、安全なカバースリップ。
  3. ビューは、蛍光顕微鏡を使用してサンプルをマウントした。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

その場での後期胚および幼虫の組織の分析において超音波処理ベースの免疫染色の有効性を実証するために、野生型の胚および幼虫は精巣、卵巣、および神経組織の免疫染色のために処理した。サンプルは、共焦点顕微鏡を介して画像化した代表的な結果は、（ 図1及び図2）が示されている。結果は、記述されたプロトコルは、 ショウジョウバエの開発の初期/中期のL3段階を経て、後期胚の間に形態学的特徴だけでなく、 その場における個別の細胞を可視化するために有効であることを明らかにした。

精巣イムノ結果：
精巣の発達は、精巣の成熟が幼虫の発育を通じて動的であるため、プロトコルの有効性を説明するための特に良いシステムです。大人のショウジョウバエの精巣は、13を参照してください（生殖細胞系列幹細胞（GSC）ニッチが配置さ1盲端とコイル状の管を形成レビューのための14）。このニッチでは、GSCsは、ハブと呼ば...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

このプロトコルは、成功したので、解剖の必要性を排除し、 その場でターゲットショウジョウバエ胚および幼虫組織を免疫染色する方法を提供する。初期胚の1,2,3を染色するための従来のプロトコルに従って、絨毛膜は、50％の漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム）を用いて除去される。サンプルは、ホルムアルデヒドおよびメタノール中で固定されている。幼虫のクチクラ古いサンプルが浮いてしまうため、試料全体はその後幼虫保持を確実にするために、セルストレーナーを通過させる。サンプルは、化学グレードのメタノール中に、必要に応じて、格納されている。再水和した後、適切に実装され、超音波処理プロセスは、幼虫のクチクラの完全性を破壊する。これは免疫染色のために必要な抗体の十分な浸透を可能にするためにキューティクルを形成した後に非常に重要です。 5％正常血清でサンプルを、抗体を適用する前に、ロッキング/ BBTw溶液は、過剰な非特異的抗体結合を防ぎます。一次抗体は、特定のタンパク質EXPRESを検出するために追加される標的組織内のsed。未結合一次抗体を除去するために洗浄した後、フルオロフォアに結合した二次抗体が結合した...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

私たちは親切ヴァーサとトラフィック·ジャム抗体を供給ルースリーマンとDorthea Godtに感謝しています。私たちは、NICHDの後援の下で開発し、アイオワ大学によって維持提供株式や発達研究ハイブリドーマバンクを維持するためのインディアナ大学ブルーミントンストックセンターを承認したいと思います。私たちは、彼らのアドバイスとサポートのためにWawersikラボのすべてのメンバーに感謝します。この作品は、モンロー学者プログラムグラントとNSF（AFとLBに）（MW）のIOS0823151を付与することによって資金を供給された。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
表1:試薬と緩衝液
リン酸緩衝液 Triton X-100 (PBTx)5 L用:500 ml PBS 10X、4.45 L ddH2O、50 ml Triton 10%.RTで保管してください。
リン酸緩衝液生理食塩水10X(PBS 10X)dH2Oの1Lの場合:80 g NaCl、2 g KCl、14.4g Na2HPO4、2.4 g KH2PO4。コンポーネントを追加し、適切な体積まで充填します。4°Cで保管してください。
トリトン10%50mlの場合:トリトン5ml、PBS 10X5ml、ddH2O45mlを混ぜる。RTで保管してください。
PEMS0.1 M パイプ (pH 6.9)、2.0 mM MgSO4、1.0 mM EGTA。RTで保管してください。
パイプ0.25 M溶液(pH 6.9)400 mlの場合:30.24 gパイプdH20 NaOH。パイプを300mlのdH2Oに溶解し、NaOHでpH6.9に調整します。dH2Oとオートクレーブで総容量を400mlにします。RTで保管してください。
ホルムアルデヒドメタノール中の37重量%ホルムアルデヒド。ホルムアルデヒド、ヘプタン、メタノール廃棄物の混合物は、施設のガイドラインに従って廃棄する前に、ヒュームフード内の密閉容器に保管してください。
ヘプタンCAS 142-82-5n-ヘプタン。ホルムアルデヒド、ヘプタン、メタノール廃棄物の混合物は、施設のガイドラインに従って廃棄する前に、ヒュームフード内の密閉容器に保管してください。
メタノールCAS 67-56-1RTで保管 ホルムアルデヒド、ヘプタン、およびメタノール廃棄物の混合物は、機関のガイドラインに従って廃棄する前に、ヒュームフード内の密閉容器に保管してください。
リン酸緩衝液Tween(PBTw)1 Lを作るには:100 ml PBS 10X、890 ml ddH2O、10 ml Tween 10%。すべてのコンポーネントを追加した後、滅菌をろ過します。4°Cで保管してください。
Tween 10%For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. 混ぜる岩。RTで保管してください。
ウシ血清アルブミン/リン酸緩衝液Tween(BBTw)1 Lを作るには:100 ml PBS 10X、890 ml ddH2O、10 ml Tween 10%、1 gウシ血清アルブミン(BSA)。BSAを添加し、0.2 μM真空フィルターユニット。4°Cで保管してください。
正常なヤギ血清 (NGS)ackson ImmunoResearch Laboratories005-000-12110 mlを作るには: 正常なヤギ血清 10 ml ddH2O. NGSのバイアルにddH2Oを加え、0.2 μm syrningeフィルター。アリコートは-20°Cで保管してください。
1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン価(DABCO)CAS:281-57-9100 mlを作るには:25 ml ddH2O、1 ml Tris HCl(1M、pH 7.5)、2.5 gのDABCO固体、3.5 ml 6N HCl、250 μl 10N NaOH、70 mlグリセロール。攪拌棒付き250mlビーカーに、ddH2O、Tris HCl、DABCOを加えます。攪拌し、6N HCl、10N NaOH、およびグリセロールを加えます。次に、溶液がpH 7.5に達するまで10N NaOHを滴下します。因数。アリコートは-20°Cで保管してください。
DABCO + p-フェニレンジアミン(PPD)溶液1.765 ml NaHCO3、0.353 Na2CO3、0.02 g PPD(CAS:106-50-3)。PPDをNaHCO3およびNaCO3溶液に溶解します。60 μ を加算します。PPD溶液のlを500μDABCOのl。アリコートは-20°Cで保管してください。
りんごジュースプレート~200枚のプレートを作るには:45 gの寒天(CAS#9002-18-0)、45 gのグラニュー糖(店で購入)、500 mlのリンゴジュース(で買った)、15 ml Tegosept 10%、1.5 ml ddH2O. 4 LフラスコでddH2Oに寒天を加え、30分間オートクレーブします。リンゴジュースの混合物をオートクレーブ保存した寒天に徐々に加えます。加熱した攪拌板で混合し、10 mlの容量を35 mmのシャーレに分注し、RTで静止させて固めます。4°Cで保管してください。
テゴセプト10%100mlを作るには:テゴセプト10g、エタノール100ml。アリコートは-20°Cで保管してください。
イーストペースト~50gの乾燥活性酵母。酵母を含むビーカーにddH2Oを徐々に加え、ペースト状の粘稠度に達するまで攪拌します。4°Cで保管してください。
表2:染色材料
DAPIInvitrogenD35711:1000、5 mg / mlで保存。
ウサギの反ヴァーサ1:250、ルース・レーマンからの贈り物。
マウス抗ファシクリンIII発達研究ハイブリドーマバンク(DSHB)7G101:10
マウス抗1B1発達研究ハイブリドーマバンク(DSHB)1B11:4
グニエア豚抗トラフィックジャム1:2500、Dorthea Godtからの贈り物(Li et al、2003)。
マウス抗プロスペロ発生研究 ハイブリドーマバンク(DSHB)プロスペロMR1A1:10
ラット抗ELAV発達研究 ハイブリドーマバンク(DSHB)7EBA101:30
マウス抗レポ発生研究 ハイブリドーマバンク(DSHB)8D121:10
ヤギ抗ウサギ Alexa546InvitrogenA110101:500
ヤギ抗マウス Alexa488InvitrogenA110291:500
ヤギ反グニエア豚 Alexa633InvitrogenA211051:500
ヤギ抗ラット Alexa488InvitrogenA110061:500
表3:材料と機器
手作りのフライケージ;ジェネシー・サイエンティフィック・コーポレーション該当なし。ボトル:32-130;既製のケージ:59-101クリアキャストアクリルチューブ(直径1 3/4インチ)を400rpmのコンパウンドマイターソーで4インチの高さのセグメントに切断することによって作られました。超微細ステンレス鋼のスクリーニング(アクリルコンパンド接着剤で浴槽の一端に取り付けられました。空のフライフードボトルを使用する別の方法は、Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4にあります。ケージは、ジェネシー・サイエンティフィック・コーポレーション(Genesee Scientific Corporation)からも購入できます。
ソニケーター:ブランソン250デジタルソニファイアブランソンモデル:ブランソンデジタルソニファイア250
ソニケータープローブブランソンモデル#:102C(CE)EDP:101-135-066;S/N: OBU06064658
シリンジ フィルターNalgene190-25-200.2 μmセルロース、アセテートメンブレンフィルター
イメージングシステム:多色光源付きスピニングディスク共焦点顕微鏡、デジタルCCDカメラ、イメージングソフトウェア顕微鏡:オリンパス、光源:Lumen Dynamics、カメラ:Q-Imaging、イメージングソフトウェア:(株)インテリジェントイメージング顕微鏡:DSUスピニングディスクを装備したBX51、光源:X-Cite 120Q、カメラ:RETIGA-SRV、イメージングソフトウェア:Slidebook 5.0
フィルターユニットNalgene450-00200.2 μMセルロース硝酸塩メンブレンフィルター
真空

参考文献

  1. Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila. Development. 125, 667-678 (1998).
  2. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).
  3. Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis. Development. 130, 4417-4426 (2003).
  4. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).
  5. Blair, S. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).
  6. Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).
  7. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J Vis Exp. , (2011).
  8. Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 294, 92-103 (2006).
  9. Sheng, X. R., et al. Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis. Dev Biol. 334, 335-344 (2009).
  10. Sinden, D., et al. Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis. Dev Biol. 372, 5-16 (2012).
  11. DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad. Dev Cell. 14, 275-286 (2008).
  12. Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis. Dev Biol. 367, 114-125 (2012).
  13. Fuller, M. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).
  14. Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  15. Williamson, A., Lehmann, R. Germ cell development in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).
  16. Jemc, J. C. Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline. Genesis. 49, 753-775 (2011).
  17. Spradling, A. C. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).
  18. Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2, 45(2011).
  19. Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).
  20. Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
  21. Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202(2011).
  22. Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary. Mech Dev. 130, 241-253 (2013).
  23. Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
  24. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
  25. Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. BioEssays. 26, 739-751 (2004).
  26. Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila. Development. 133, 2639-2648 (2006).
  27. Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell. 10, 441-449 (2006).
  28. Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell. 124, 1241-1253 (2006).
  29. Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila. Dev Biol. 283, 191-203 (2005).
  30. Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila. Neural Dev. 7, 14(2012).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。