ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法シロイヌナズナ

Summary

私たちは、免疫染色、蛍光in situハイブリダイゼーション 、ホールマウントシロイヌナズナ胚珠の量的、高分解能イメージングに続いてDNA染色のためにここに効率的で信頼性の高いプロトコルを提供する。この方法は、正常なクロマチン修飾および核構造を分析するために使用した。

Abstract

植物の開花では、体への生殖細胞の運命遷移は大人の植物の花器官における胞子母細胞（SMC）の仕様でマークされています。女性のSMC（大胞子母細胞、MMC）は胚珠原基に区別し、減数分裂を受ける。選択された一倍体大胞子は、その後一緒にアクセサリー細胞と、配偶子を生じるであろう多雌性配偶体、卵細胞と中央のセルを形成するために、有糸分裂を受ける。胚珠内部MMC、減数分裂細胞と雌性配偶体の限られたアクセス性細胞学的および細胞遺伝学的ための技術的に困難である単一細胞レベルで分析する。特に、携帯電話または核エピトープの直接的または間接的な免疫が植物細胞および単一細胞イメージング内部の試薬の貧弱な浸透によって損なわれては、ホールマウント組織における光学的透明性の欠如によってdemisedされる。

そこで、NUCLを分析する効率的な方法を開発したホールマウント組み込みシロイヌナズナ胚珠内の単一のセルの高解像度で耳の組織とクロマチン修飾。これは、顕微鏡スライド上のアクリルアミドゲルの薄層内の固定胚珠の解剖と埋め込みに基づいています。埋め込まれた胚珠は、免疫染色試薬、組織の透明度および透過性を向上させることを目指した化学的および酵素的処理に供される。これらの治療は、細胞のクロマチン組織、DNAおよびタンパク質のエピトープを保持します。サンプルは、クロマチン免疫染色、in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光 、およびヘテロクロマチンの解析のためのDNA染色を含む種々の下流の細胞学的分析のために使用することができる。 3D再構成に続いて、高解像度の共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）イメージングは​​、単細胞の解像度で定量的な測定を可能にする。

Introduction

顕花植物では、生殖系統の確立は、SMCの分化、女性MMCおよび男性の胞子母細胞から始まります。 MMCは胚珠原基の遠位先端のサブ表皮珠心細胞から発達し、小胞子母細胞は、深い花器官¹の内部に配置されている葯房に胞子形成組織から開発しています。平滑筋細胞は、その後、有糸分裂の際に配偶体を生じる一倍体胞子を生成する減数分裂を受ける。雌性配偶体、または胚嚢は、1卵細胞、1中央のセル、2助細胞と3 antipodalsで構成されています。雄性配偶体または花粉は一つの栄養細胞二つ精子細胞から構成されている。雄性配偶体は、比較的アクセス可能なオブジェクト·オブ·研究したまま雌性配偶体が胚珠内に埋め込まれ、それ自体が花の心皮で囲まれ​​、したがって、分子·細胞学的分析に固有の課題を提起する。しかし、近年、レーザ支援マイクロダイセクションは、トランスクリプトームは、MMCと女性の配偶体細胞^2-4で分析することができ、エレガントなソリューションを提供しました。候補遺伝子の発現に加えてin situハイブリダイゼーションまたはレポーター遺伝子アッセイにおいて、例えば RNAを用いて、分析において、細胞学的分析は、特定の直接的な細胞染色または間接的な免疫染色を用いて内因性の細胞成分の動態を調査することができる。特に、一緒にクロマチンの修正やクロマチンの構成要素の免疫染色で、魚やDNAの染色を用いて細胞遺伝学的染色は、 シロイヌナズナ

Protocol

手順は、 図1のワークフローに記載されており、組織の切開および埋め込 ​​みのためのセットアップを図2に示す。

1。組織固定

1. 氷の上で焼きたてのBVO固定液緩衝液を含むマイクロチューブに、20〜30心皮を集める。
2. 穏やかに室温で振とうしながら組織30分を修正します。
3. 400×gで卓上マイクロ遠心1分で固定液に心皮を含むチューブを回転。
4. 慎重に固定液緩衝液を除去し、PBTの1ミリリットルを加え、氷上にチューブを置きます。

2。解剖と埋め込み

1. 新たに作製した、5％アクリルアミドミックスのそれぞれ200μlで5エッペンドルフチュー​​ブを準備します。
2. 5スーパーフロストを70％エタノールで前洗浄し、鉛筆で標識摺動調製する。
3. 20％APSと氷上で20％のNaPSをそれぞれの1アリコートを解凍。
4. カットエンドチップで行われ4-5の心皮を取るきれいなスライド上に、液体の過剰を取り除く。
5. 細い針で縦カットを行い、 図2に示すように胚珠の行を解放する心皮の壁を切り離し、PBS（10μL以下で）で覆うことにより、乾燥を避ける。
6. すぐに、20....

Results

我々は全体のマウント中の細胞学的染色に適しシロイヌナズナ胚珠の大規模調製および処理のための堅牢なプロトコルを提供する。埋め込 ​​みのおかげで、胚珠が3次元構造（ 図3）を保持する。さらに、光の明確化など、組織処理は、高解像度で細胞内構造を画像化することができます。 図4は、ヘテロクロマチンが明るく表示され、明確に定義された目立つ巣（何デコンボリューションは、この絵のために使用されなかった）ホールマウント胚珠原基でDNA染色を示している。これらの画像は、MMCと珠心（ 図^4）21ヘテロクロマチン含量を分析するために使用した。

加えて、我々は成功して定量的に大胞子母細胞、機能的大胞子、開発、女性配偶体および初期胚^21、22〜24で免疫染色によりクロマチン動態を解析するために、このプロトコルを使用していました。 図5のシロイヌナズナ胚珠に免疫染色ホールマウントの代表的な結果を示している。 <.......

Discussion

顕花植物では、女性の生殖細胞系列は、このように技術的に困難なホールマウントで細胞学的染色をレンダリング、珠心や胚珠外皮を含むいくつかの細胞層に囲まれています。ここでは、このような全体マウントでのin situハイブリダイゼーション 、免疫染色、DNA染色および蛍光として細胞学的染色に適し胚珠多数の製造および加工を可能に効率的なプロトコルを提示する。我々が正常にシロイヌナズナ ^21,22における女性の生殖生殖細胞の分析のためにそれを使用していました。複数のスライドは、異なる染色のために並列に処理することができるように、この方法は非常に効率的である。また、堅牢でかつ均一な信号分布を与え、再現性のある定量分析が可能になります。このようなクロマチン構造の変性を伴うフォイルゲン染色などの古典的な方法とは対照的に、我々のプロトコルは、クロマチン組織と核エピトープを保持します。アプリケーションの追加ition、組織の明確化は、単一細胞レベルでの高解像度の信号を撮像可能にする。

花ではなくBVOバッファー（1.1）の4％パ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
溶液
BVO 固定バッファー (ベース32)			2 mM EGTA、pH 7.5、1% (v/v) ホルムアルデヒド、10% DMSO、1x PBS、0.1% Tween-20
PBT			1x PBS、0.1% Tween-20
PBT-F			1x PBT、2.5% (v/v) ホルムアルデヒド
30% アクリルアミド:ビスアクリルアミド			アクリルアミド3 g、ビスアクリルアミド0.33 g、PBS1個(10 mlを調製し、4°Cで保存します。C)
200 ml 5%アクリルアミド混合物、PBS			34 ml 30%アクリルアミド:ビスアクリルアミド、166 ml 1x PBS(30%ストックから新鮮に作る)
20%アンモニウムペルサルフト			0.2 g、1 ml滅菌水(1 mlでアリコートを準備し、-20°Cで保存します。C)
20%亜硫酸			0.2 g、1 mlの滅菌水(1 mlでアリコートを準備し、-20°Cで保存します。C)
細胞壁酵素ミックス			0.5% (w/v) セルラーゼ、1% (w/v) ドリセラーゼ、0.5% (w/v) ペクトリアーゼ
試薬および材料
ホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
エタノール	Schaurlau	ET00102500
メタノール	シャルラウ	ME03062500
キシレン	ROTH	4436.1
セルラーゼ	シグマ	1794
ドリセラーゼ	シグマ	D8037
ペクトリアーゼ	シグマ	P5936
Tween-20	メルク	8.22184.0500
EGTA	シグマ	E-4378
アクリルアミド		Σ A-3553
ビスアクリルアミド	ΣM2022	毒性
過硫酸アンモニウム	Σ	A9164
亜硫酸ナトリウム	フルーカ	71988
抗トリメチルヒストン H3 (Lys4)	アップステート	07-473
アンチモノメチルヒストン H3 (Lys27)	アップステート	07-448
Alexa Fluor 488~ヤギ ~抗 ~ウサギ (H+L)	Molecular Probe	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
ヨウ化プロピジウム	Sigma	P4170	有毒
DAPI	Sigma	D9542	有毒
RNAse A	Roche	10109169001
Coplin jar	Huber &CO	10.055
鉗子	DUMONT BIOLOGY
シェーカー	ハイドル	543-12310-00-0
モイストチャンバー			湿ったペーパータオルが入ったプラスチックの箱で、スライドを支え、スライドを水から守るためのプラスチック製のサポートが箱に入れられています。
スーパーフロストプラススライド	サーモフィッシャー	J1800AMNZ	メンゼル-GLäser
FISH Tag DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP booster	Chromotek