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方法論記事

光ピンセットによる単一のRNA分子のナノマニピュレーション

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DOI:

10.3791/51542

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2014年8月20日

 ,  ,  , 
1Nanoscale Engineering Graduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 2Nanoscale Science Undergraduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 3Nanobioscience Constellation, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 4The RNA Institute, University at Albany, State University of New York, 5Department of Biological Sciences, University at Albany, State University of New York

この記事について

サマリー

光ピンセットは、個々の分子を5'末端と3'末端から引き伸ばすことにより、RNAの折り畳みを研究するために使用されてきました。ここでは、ピンセット用のRNA分子を合成するための一般的な手順、装置のキャリブレーション、および単一分子を操作する方法について説明します。

要約

ヒトゲノムの大部分は転写されるが翻訳されていません。このポストゲノム時代においては、RNAの調節機能は、ますます重要であることが示されている。 RNAの機能は、多くの場合、別の構造を採用する能力に依存するので、シーケンスから直接RNA三次元構造を予測することは困難である。単一分子は、一度に一つの分子の分子構造を監視することにより、RNA構造多型の問題を解決するためにショーの電位に近づく。この作品は、正確に光ピンセットを用いて単一のRNA分子のフォールディングおよび構造を操作するための手法を提案する。まず、単一分子力学的仕事に適した分子を合成する方法が記載されている。次に、光ピンセットの業務の適正を確保するために、さまざまなキャリブレーション手順が説明されています。次に、さまざまな実験が説明されている。技術の有用性を実証するために、機械的に展開するRNAヘアピンの結果や単一のRNAキーシングラム複合体は証拠として使用される。これらの例では、ナノマニピュレーション技術は、独立して、二次および三次構造を含む各ドメインのフォールディングを研究するために使用した。最後に、制限及び方法の将来のアプリケーションが説明されています。

概要

光ピンセット技術の開発は、長い生物学的研究におけるその適用を伴っている。光閉じ込め効果が最初に発見された場合には、アーサーAshkinは汚染された水の中の細菌は、レーザーの焦点1に捕捉することができたことを観察した。それ以来、トラッピング細菌は生物物理学の学生の世代のために意図的で、楽しい実験だけでなく、微生物生理学2,3を研究するための本格的な研究ツールとなっています。光トラッピング技術は、顕微鏡対象物1を固定する集束レーザービームを使用する。実際には、また、トラップ（ΔX）の中心からの変位によって挟み込まれた物体に作用する力（F）を測定する光学春、などのレーザートラップ機能。短距離、F =κのxΔX内では、κトラップのバネ定数である。光トラップは、ミクロスにピコニュートン（pNで）精度の力を発揮するために使用することができコピックオブジェクトとナノメートル（nm）の精度でその位置を測定します。過去20年間では、光ピンセットは、生物物理学の中で最も使用された単一分子技術の一つとなっている。技術は、DNA 4-6、7-9、RNAおよびタンパク質10,11の折り畳みおよび力学を研究するために採用されている。光ピンセットはまた、DNA複製12、RNA転写13、及びタンパク質合成14,15、ならびに多くの他の生体分子のイベント16-18を観察するために使用されている。

単一分子アプローチは主にRNAの頑丈なフォールディングエネルギー地形を探索するRNA構造的研究に用いられている。 RNA配列は、通常によるRNAの単純な化学組成及びベースペアリングルールに、複数の安定した、相互に排他的な構造に折り畳むことができる。これは、長いRNA構造多型、すなわちリボスイッチ19,20に生じるような、遺伝子調節において重要な役割を果たしていることが知られている。 recenトンゲノムワイドの調査では数度と小さい温度変動が大きく、携帯トランスクリプトーム21の大部分の構造とタンパク質合成に影響を与えることを明らかにした。この例では、選択的RNAフォールディングの生物学的役割は、以前に想定よりもおそらくもっと重要かつ普及していることを示唆し。構造的多型は、しかし、多くの分子の平均的性質を調べ、従来の生化学的および生物物理学的アプローチ、のための課題を提起する。たとえば、「オン」とリボスイッチの「オフ」のコンホメーションは、相互に排他的です。異質の構造に由来し、平均化構造は、生物学的に関連する配座異性体のいずれかに似ている可能性は低い。また、非翻訳RNAおよびmRNAは通常、構造を形成する。タンパク質や調節RNAとの相互作用は、一般的な相互作用の一部として、既存の構造のアンフォールディングが必要です。そのため、RNAフォールディング/リフォールディングを研究することは、該当になるRNA生物学の問題。そのような課題に対応するために、単一分子アプローチは、時間22〜27時、一分子を研究することによって、RNAの構造多型を解明するために採用されている。

人気のある単一分子蛍光法と比較して、アンフォールディング機械ベースのピンセットは、個別の分子の立体配座は、加えられた力によって操作することができ、ナノメートルの精度で測定するという利点を提供する。このナノマニピュレーション能力は、大きなRNAの階層的なフォールディングが28を解剖することができるように個別の構造ドメインのアンフォールディング/フォールディングをモニターするために利用することができる。あるいは、一本鎖は、いくつかの配座異性体の一方に折り畳むように指示することができます。または既存の構造は、機械的に異なるコンフォメー29内にフォールディングするように誘導することができる。生物学的条件下で、RNA構造は、温度変化またはリガンドの結合の際に変化させることができる。直接操作する分子の能力体制は、RNAの構造研究の新しい会場をオープンします。原則として、そのような原子間力顕微鏡、磁気ピンセットのような他の機械的技術もまた、単一のRNA分子のフォールディングを研究するために使用することができる。しかし、このようなアプリケーションは、主に、比較的低い空間分解能30に制限されている。

光ピンセットの雇用は、RNA構造は機械的な力で展開することができます。

機械的な展開の利点は数倍である。金属イオンと配位子誘起フォールディングは主三次構造に限定されるのに対し、力は、二次および三次構造の両方を展開するために使用することができる。温度と変性剤が大幅に水と溶質の活動に影響を与えることができる。対照的に、力が分子構造を乱す局所的に適用される。周辺環境への力の影響は無視できる。また、熱溶融が最高の小さなRNA構造のフォールディングの熱力学を研究するために使用され、光ピンセットは、7塩基対テトラループヘアピン28から400ヌクレオチド、リボザイム31に至るまで、さまざまなサイズのRNA構造を研究するために使用されているのに対し。さらに、RNA構造は、機械的に中温の温度で展開することができる。対照的に、熱融解実験でRNAを展開するために、温度は、典型的にはかなりよく、特にはMg 2 +イオンの存在下で、RNAの加水分解を増大させる生理学的温度、より高くなる。

これは、力の機械的効果は、それが構造に適用される方法に依存することに留意することが重要である。加えられる力は折りたたみエネルギー地形を傾斜させる。例えば、力がヘアピンに適用した場合に、塩基対を順次、時間（ 図1a）少なくとも一つを破壊される。リッピングフォークは、加えられた力に垂直な螺旋軸に沿って進行する。最小限キス錯体は張力下にあるときとは対照的に、二つのキス加えられた力に平行な塩基対は、力の負荷を共有する（ 図1b）。異なるヘアピンの形状及び二次及び三次折り畳み28,32を区別するために利用することができ、それらの異なる機械的応答して、加えられた力の結果に複素比キス。メカニカルアンフォールディングの理論的側面 ​​は、以前に8,9,30概説されている。この作品は、設定および単一分子機械的アンフォールディングアッセイを実行するための基本的な方法の概要を説明します。

実験のセットアップ 。私たちの機械的引っ張りの実験では、ピンセットのためのRNA試料は二つの二本鎖DNA / RNAハンドルが隣接し、目的のRNA（ 図2）で構成されて7。分子全体は、それぞれ、ストレプトアビジン - ビオチンおよびジゴキシゲニン - 抗ジゴキシゲニン抗体相互作用を介して2つの表面コートされたミクロンサイズのビーズ（Spherotech）に係留することができる。一つのビーズは、力測定光学TRに保持されているAPが、他方はマイクロピペットの先端に保持されている。ビーズ間の相対距離は、トラップを操縦またはマイクロピペットを移動させることのいずれかによって変更することができる。このアプローチを使用して、ビーズをテザリング単一のRNA分子が引き伸ばされ、緩和することができる。

試料の調製 。ピンセットのためのRNA試料の合成は、いくつかの手順（ 図3）を含む。まず、関心対象のRNAに対応するDNA配列は、第一のプラスミドベクターにクローニングする。次に、3つのPCR反応は、2つのハンドルおよび転写のための鋳型を生成するために実行される。転写鋳型は、ハンドル領域および挿入された配列を包含する。全長RNAをin vitro転写により合成される。最後に、RNA及び化学的に修飾されたハンドルは、ピンセットのための分子を生成するために一緒にアニールされる。

キャリブレーションとピンセットの動作 。 Minitweezers利用の基本設計この作品におけるdはデュアルビーム光ピンセット33のことに従います。第一世代の光ピンセットに比べて多くの改善により、Minitweezers臨時安定性を示す。いくつかの国の研究グループの数は、それらの単一分子研究14,15,34-37にMinitweezersを使用しています。命令ビデオを含む建設、キャリブレーション、デバイスの動作の詳細は、「ピンセットラボ」のウェブサイト（http://tweezerslab.unipr.it）でご利用いただけます。ここで、毎日の塩基で実行する必要の改良や校正手順について詳細に説明する。

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プロトコル

単一分子ピンセットのためのRNA分子の調製

  1. 目的の配列のクローニング。ベクターへのRNAの構造に対応するDNA配列をクローニングする。
  2. 合成および転写鋳型の精製。 PCRによる転写鋳型を合成する。 [ここで、プレース表1]次に、PCR精製キットを用いてPCR産物を精製し、> 200 ngの/μlのサンプルを濃縮する。精製されたDNAを転写するために使用されているため、RNaseを含まない水が溶出及び濃縮の工程で使用されるべきである。
  3. インビトロ転写 。 RNAの収量を最大にするために37℃で一晩のin vitro転写によってRNAを合成する。転写した後、[ここの場所テーブル2]、私は37℃で15分間のDNA鋳型を消化するために1μlのDNA分解酵素を加える。シリカスピンカラムを用いてRNAを精製する。
  4. ビオチン化され、ハンドルAの合成は、まず、プライマーのAf及びAr濃を用いたPCRにより、未修飾ハンドルAを生成する> 200 ngの/μLに増幅されたDNAをentrate。次に、プライマー伸長反応を使用して、PCR産物にビオチン修飾を組み込む。 [場所ここで表3]備考：ビオチン化ハンドルA（ビオチン-HA）は精製することなく直接アニーリングで使用することができます。ビオチン-HAは、RNAとアニールされるように、両方の工程でのRNaseフリー水を使用することが重要である。
  5. ジゴキシゲニンで修飾されたハンドルB.論理合成の合成プライマーBfとし、ジゴキシゲニンで修飾されたオリゴ掘る-BR（ 図3）を用いたPCRによる修正されたハンドルBを（DIG-HB）をジゴキシゲニン。次に、PCR産物を精製し、> 200 ngの/μlにサンプルを濃縮。
  6. ハンドルへのRNAをアニール。ハンドルを有するRNAをアニール。 [場所の表4とここ5]
  7. 焼きなましサンプルを精製する。アニールされたサンプルの3容量のエタノールを加え、よく混ぜる。少なくとも1時間-70℃で混合物を保管してください。 15,800×gでスピンダウンし、上清を捨てる。凍結乾燥機を使用してペレットを乾燥させる。ペレットを溶解100μlのRNaseフリー水を。注：サンプルを使用する準備ができ、-20℃で保存することができる。

光ピンセットの2キャリブレーションと運用

  1. ビデオモニターのピクセルサイズのキャリブレーション
    1. 既知の径（サイズ標準）でビーズをトラップするために光トラップを使用してください。
    2. イメージングソフトウェアを使用して捕捉されたビーズの捕捉画像（ 図4）。
    3. 重心法に基づくイメージングソフトウェアを使用して、ビーズの直径を決定します。
    4. 異なるサイズのビーズの直径を決定するために、この手順を繰り返します。
    5. ピクセルの物理的サイズを得るために、線形回帰によってビーズの測定され、既知の直径を取り付けます。
  2. 距離校正を確認する
    1. トラップしたビーズを光トラップを使用してください。
    2. 画像キャプチャソフトでその重心の画素位置を決定し、Minitweezersを使用してその位置を記録。
    3. diffeにビーズステアポジションをレンタルし、位置決定を繰り返す。
    4. ビーズのX及びY位置は、較正されたピクセルサイズを使用して、m個の単位に画素からの変換。
    5. ビデオによって及びMinitweezersによって測定された位置の間で、XとYを比較してください。 2組の値が一致する必要があります。画像解像度は>0.1μmであるため、精度を確保するために測定値の間の1ミクロンのビーズの上を移動します。距離校正はMinitweezersに格納されている1つを比較することはできません場合は、機器を再校正。
  3. トラップ剛性リブレーション
    1. 光トラップを使用してビーズを捕捉し、まだそれを保持します。
    2. 3秒のための> 5 kHzのレートでバイパス、高速データ収集を使用して、トラップの力を記録します。
    3. ソフトウェアを使用して、ビーズの動きの記録からパワースペクトルを生成する。ローレンツ（ 図5）38にパワースペクトルをフィット：
      542 / 51542eq1.jpg "幅=" 200 "/>（式1）
      S（f）は周波数fでの電力である、f cとは、コーナー周波数であり、S 0は漸近的な力である。コーナ周波数f cは 、熱運動の力が漸近値の半分に減少している周波数である。 f cとレーザパワーとビーズのサイズに応じて変化するように、個別に捕捉されたビーズを較正する。
    4. F c からトラップのバネ定数、κを計算します。
      figure-protocol-1 （式2）
      においてγは、ビーズ（式3）の抗力係数である。力変化からのRNAの伸長の変化を決定するために、バネ定数を使用する。
  4. ストークスの法則をテスト
    1. 光トラップを使用してビーズをキャプチャします。異なる速度でバック·アンド·フォースビーズを移動します。
    2. ビーズの動きを記録し、Minitweezersを使用して強制的に。
    3. ビーズの半径を計算します。
      NOTE：摩擦力、流体中の球状粒子の運動によって発生F dは 、ストークスの法則によって記述することができる。
      figure-protocol-2 （式3）
      rは球の半径である、vは速度であり、hは 、参照表に見出すことができる流体の動粘度である。 F dとして測定された力を使用して、ビードの半径は、式を用いて計算することができる。 3（ 図6）と、画像取得ソフトウェアにより決定することに同意する必要があります。ストークスの法則·テストを効果的に全体的なキャリブレーションと計測器の性能をテストします。

単一のRNA分子の3ナノマニピュレーション

  1. 流体工学を作る。
    1. 2号のカバーガラス（ 図7a）上のドリル6穴（直径2mmずつ）とレーザー彫刻機を使用した両面ポリイミドテープ（ 図7b）内に3つのスリット（幅2mm）に切断。
    2. 両面カプトンテープの二つの層を持つ2つのカバーガラスを挟んでフローチャンバーを作成します。テープ（ 図7c）との間にマイクロピペットと2つのバイパス管を挿入します。
    3. 流体穴（ 図7d）を一致させることによって、金属フレームにフローチャンバーをマウントします。
    4. ポリエチレンチューブ（ 図7E）を介して、選択した緩衝液を満たした10ミリリットルの注射器チャンバの流体チャネルに接続します。
    5. 二つの目的の間の光ピンセットに全室をマウントします。流体チャネルとチャンバーの前面右に直面していることを確認してください。右の目的を引っ込めとtの取り付け穴にフレーム（ 図7E）の真鍮製のピンを差し込む彼はピンセット。チャンバー位置を固定するネジを締めます。
  2. アニールしたサンプルとビーズを混合する。抗ジゴキシゲニンコーティングビーズ（DIG-ビーズ）でアニールしたサンプルを混合し、混合物を5〜10分間、室温で滞在することができます。一般的には、アニールされたサンプルを1μlの緩衝液1mlに5μlのDIG-ビーズと混合されている。注：フローチャンバにロードされるビーズの量は、バイパス管から送達されるビーズの合理的な量を確実にするように選択されるべきである。ビーズへのアニーリングサンプルの比は、容易に定量化することができない。理想的なケースでは、ほとんどのビーズは、ビーズのごく一部がビーズごとに1つのRNA分子を有することができるように何RNAを持たない。アニールされたサンプルとビーズ懸濁液は、定量化が困難であるため、唯一の方法は、現在最善とは混合比を変化させ、ピンセットでの混合物をテストすることです。
  3. マイルの上に、 すなわち （フローチャンバ内の反応サイトに数μmのビーズを提供cropipetteチップ、 図7c）。
    1. 1ミリリットルの注射器にストレプトアビジンでコーティングしたビーズ（ストレプトビーズ）の懸濁液をロードします。
    2. フローチャンバー（ 図7a）の底部のチャネルに通じる流体チューブに注射器を接続します。
    3. チャンバー内に連鎖球菌ビーズを流す注射器を押してください。
    4. ボトムバイパス管の開口部（ 図7b）に近い光トラップを配置するモータ制御ソフトウェアを使用してチャンバ全体を移動します。その後、連鎖球菌ビーズを捕捉するためにトラックボールによって光トラップを運営しています。
    5. モータ制御ソフトウェアを使用してマイクロピペットの先端に近いビーズを移動します。
    6. マイクロピペットの上にビーズを吸うためにマイクロピペットに接続された注射器を引き出します。
    7. 余分な連鎖球菌ビーズを洗い流すために中間チャネルに注射器を押して、静かに流れを適用します。
    8. 同様に、チャンバの上部のチャンネルに（ステップ3.2参照）をサンプルとディグビーズの混合物を提供する。
    9. DIG-ビーズを捕捉し、光トラップを使用して、ストレプトビーズの近くにそれを持って来る。
    10. フローを適用することにより、中央のチャネルを清掃してください。 NOTE：strep-と掘るビーズは、それらが顕微鏡図（ 図4）の下で視覚的に区別できるように異なるサイズであるように選択される。
  4. 「ビーズのペア間の単一分子テザリング釣り。
    1. ストレプトビーズ（ 図4）の上に垂直に掘るビーズを配置します。
    2. トラップを操縦することによってダウンストレプトビーズに向かってDIG-ビーズを移動します。力の変化を可視化するために、コンピュータに力 - 距離プロットウィンドウを開きます。
    3. 2ビーズの接触すると、垂直方向に離れて連鎖球菌ビーズからDIG-ビーズを移動します。
    4. 具体的な接触がなされない場合には、力はほぼゼロのままである。つのビードが分子によって接続されている場合、力の増加は著しくつのビードを分離する。一般に「フィッシング」と呼ばれるこの手順は、しばしばパーフォレーションある効果的な単一分子テザーを見つけるために、ビーズの各ペアで複数回ormed。

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結果

スペースによって制限される、単一のRNA分子のナノマニピュレーションは、RNAヘアピン構造および三次構造を有するRNAの唯一の機械的な展開例を示すことにより実証される。

シングルヘアピン分子を操作する

テザーは、ビーズ間で確立されると、テザー上の拡張力は、ユーザ定義のプロトコールを使用して操作することができる。 4つの一般的な操作プロトコルが一般的に使用される。

フォース·ランプ実験 。単一のRNAを操作するための最も直感的で一般的な実験は、（垂直方向、図4に示すように）繰り返し伸ばし、ハンドルの螺旋軸方向に分子を緩和することである。力、F、およびトラップ位置、Yは 、時間の関数として記録される。トラのバネ定数であるF /κ、 -分子の延長、eは電子= Yによって計算することができるページ。引っ張り結果は、力-伸...

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ディスカッション

ピンセット試料の調製における変更とトラブルシューティング

クローニングベクターの選択 。ここに記載した一般的スキーム（ 図3）は 、特別なクローニングベクターを必要としないが、ベクターは、プロモーターが所望の位置にPCRを介して導入することができるような転写を容易にするために固有のT7またはT3プロモーターを持たないことが好ましい。

シーケンスとハンドルの長さ 。ハンドルには特異的な配列の要件はありません。しかし、AT比に近いGCは、ホモポリマー、高度に反復配列は避けるべきであるのに対し、好ましい。出版物では、2つのハンドルは、目的のRNA構造が中央に概ね配置されるような類似の長さとして保持される。以前の研究は、500〜10,000塩基対まで変化させ、ハンドルの全長が微妙に測定動態46,47に影響を及ぼすことを示している。

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開示事項

著者らは、開示することは何もない。

謝辞

この作業は、NSFの助成金（MCB-1054449）と、アルバニー大学のRNA研究所からPTXLへの学際的な共同パイロット研究プログラム賞によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Minitweezers StevenB. Smith Engineeringhttp://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition cardNational InstrumentsUSB-6351
ビデオカードNational InstrumentsPCI-1407
LabviewプログラミングソフトウェアNational Instruments
NI Vision Builderナショナルインスツルメンツ
レーザー彫刻機エピローグ レーザーシステムZing-16
PCR精製キットQiagen28104
MEGAscript T7キットLife TechnologiesAM1334
MEGAclearキットLife TechnologiesAM1908
Biotin-11-UTPThermo Fisher
T4 DNAポリメラーゼニューイングランド研究所M0203
ストレプトアビジンコーティングマイクロスフェアSpherotechSVP-20-5
アンチジゴキシゲニンコーティングマイクロスフェアSpherotechDIGP-20-2
サイズ標準マイクロスフィアSpherotechPPS-6K
KPPTDE-1Kaptontape.com カプトンテープ
No.2カバーガラスサーモフィッシャー12-543D
FERR0081

参考文献

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