単離された血液灌流ラットの肺の準備にシングル微小血管透過性を定量化する

Summary

孤立した血液灌流肺準備が肺表面上の微小血管ネットワークを可視化することが実現可能になります。ここでは、リアルタイムの蛍光画像を用いて単離された肺における単一微小血管の透過性を定量化するためのアプローチを記載する。

Abstract

単離された血液灌流肺製剤が広く可視化し、単一の微小血管内シグナリングを定義するために使用される。リアルタイムイメージングにより、この調製物を結合することによって、個々の肺微小血管透過性における変化を決定することが可能となる。ここに我々は、ラットの肺を隔離し、自己血でそれらを灌流する手順について説明します。その後、我々は小さな肺領域にマイクロカテーテルを経由してフルオロフォアまたは薬剤を注入するための手順の概要を説明します。記載され、これらの手順を使用して、我々は、細菌のリポ多糖の注入を受けてラット肺微小血管内の透過性の増加を決定した。データは、リポ多糖の両方細静脈や毛細血管の微小血管セグメントにわたって流体の漏れを増加させたことを明らかにした。したがって、この方法は、血管透過性のセグメント間の応答を比較することが可能となり、従って、応答内の任意の不均一性を規定する。肺の透過性を定義するために一般的に使用される方法は、肺組織サンプルの後処理を必要としながら、リアルタイムイメージングの使用は、本方法から明らかなように、この要件を回避する。このように、リアルタイムで画像化と組み合わせた孤立性肺準備が肺微小血管透過性を決定するために、従来の方法に比べていくつかの利点を提供しています、まだ開発し、実装するための簡単​​な方法です。

Introduction

肺における微小血管透過性の増加は、浮腫および肺胞の妥協ガス交換の開発につながり、急性肺損傷^（ALI）1-3の主要な特徴である。従って、血管透過性の推定値は、肺損傷および提案された治療的介入の有効性の範囲を定義する上で重要である。このような血中遊離肺のウェット対ドライ比と微小血管ろ過係数として重量分析は、広く浸透性^4,5を推定するための方法を使用します。他の方法は、肺組織中の^6-8放射性または蛍光プローブの保持を定量することが挙げられる。しかしながら、上記の方法は、透過性データを解明に向けて肺組織サンプルのpostexperiment処理を必要とする。一匹の動物は、単一の治療プロトコルに使用することができるので、大型動物番号は完全な研究のために必要とされ得る。上記の方法の共通の特徴は、彼らが平均血管透過性を決定するということです組織サンプル内の全ての血管。しかし、周知の肺ミクロおよびマクロ血管が表現型的に異なっている⁹ことが確立されている。このため、透過性の応答は、同様に^9,10の様々な血管セグメントの中で異質かもしれません。このように、組織サンプル中のすべての肺血管の平均透過性を定量化することは十分にこの不均一性を反映しない場合があります。

単離された血液灌流肺製剤において、肺表面上の血管が正立顕微鏡^4,11,12によって可視化することができる。....

Protocol

テネシー大学健康科学センターの施設内動物管理使用委員会によって承認された動物で行われ、すべての実験であった。

灌流はラット肺の準備のための1。チューブ

1. 図1に示すように、圧力変換器（P23XL）を接続します。血液灌流用タイゴンチューブ（＃18）と配管システムを準備し、顕微鏡ステージ上にチューブを置きます。
2. 37℃の水浴温度を設定する
3. 肺の入口および出口はタイゴンチューブを一時的に接続する。

図1。血液灌流チューブ 。回路図は、孤立した肺の準備を通して血液を循環させるために使用される管のセットアップを示しています。また、示されたが、部品を通る配管I関連しているSがルーティングされた。心臓と肺の概略管および肺動脈（PA）、および左心房（LA）、カニューレ（青色破....

Results

灌流チューブおよび関連機器に接続された単離された血液灌流肺製剤が図2に示されている。本明細書に記載された手順は、任意のネズミ種を用いることができるが説明のために、我々は、スプラーグドーリーラットを使用した。左心房マイクロカテーテルを通して注入は、肺のわずかな領域に到達する。注入された領域は注入によって誘発される変色（ 図3）によって識別することができます。リアルタイムイメージングのために配置されるよう肺の調製は、図4に示されている。

図2。単離された血液灌流肺製剤 。写真は灌流チューブに接続し、自己血で灌流摘出ラットの肺を示しています。肺の横隔膜面がMIに直面している.......

Discussion

リアルタイムイメージングと相まって孤立血液潅流肺標本は、単一の肺の微小血管内の透過性の変化を測定するためのシンプルなツールを提供しています。我々は、LPSの注入に応じて透過性の変化を定義するには、この方法を適用した。我々のデータは明らかに、LPS注入は、微小血管透過性の増加を引き起こしたことを示唆している。また、データも、LPSによって誘導された透過性の変化は、細静脈や毛細血管の両方で類似していたことを示している。このように、この技術の主な利点は、単一の微小血管の漏出だけでなく、血管のグローバルネットワークを定義する機能です。この技術は、グローバル透過性の変化をもたらすことを考えると、そのような重量分析のような他の一般的に使用される方法を用いて得られたものと、これらの値を比較することが可能である。従って、本方法はまた、他の研究で報告されたものと微小流体漏れ情報の比較を可能にする。

と比較してより広く血管透過性の変化を決定するための技術を用い、実時間イメージングに基づく方法は、肺組織サンプルのno後処理を必要としない。蛍光団の保持の程度は、蛍光体の注入およびその後のウォッシュオフ中に.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
タイゴンチューブ	フィッシャーサイエンティフィ		#18
圧力トランスデューサ	データサイエンスインターナショナル	P23XL	必要数量 3
バタフライニードル	グライナー バイオワン	450081	21 G
蠕動ポンプ	コール パーマー	マスターフレックス L/S
PE-90 チューブ	ベクトン ディキンソン	427421	30 cm 必要
PE-10	ベクトン・ディッキンソン	427401	40 cmが必要
シリンジポンプ	ブレインツリー・サイエンティフィック	BS8000
Oリング			直径20mmの穴とOリングをホルダーに固定するためのハンドルでカスタムメイド
直立蛍光顕微鏡	オリンパスアメリカ	BX61WI
画像取得ソフトウェア	分子デバイス	メタモルフ
FITC デキストラン 20KD	シグマ アルドリッチ		0.5 mg/ml (試験実験で計算された透過性指数値に基づいて適合性が示された場合、分子サイズの異なるデキストランを選択できます)
リポ多糖類	シグマアルドリッチ		血清型0111:B4