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方法論記事

縦二光子イメージングに続いてマウスの急性脳外傷

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DOI:

10.3791/51559

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2014年4月6日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Center, University of Helsinki

この記事について

サマリー

急性脳外傷は現在まで適切な治療を持っていない重傷です。多光子顕微鏡は、縦方向に急性脳外傷開発のプロセスを研究し、げっ歯類における治療的戦略をプロービングできます。脳のin vivo二光子イメージングに師事急性脳外傷の二つのモデルは、このプロトコルで実証されています。

要約

急性脳外傷は多くの場合、異なる事故頭部損傷に起因して、人口のかなりの部分に影響を与えますが、そのための有効な治療法がありません。現在使用されている動物モデルの制限は、病理メカニズムの理解を妨げる。多光子顕微鏡は、長手方向の生理学的および病理学的条件の下で、無傷の動物の脳内の細胞や組織を研究できます。ここでは、外傷後の条件下で脳細胞挙動の二光子イメージングによって研究急性脳損傷の2つのモデルを記載している。選択された脳領域は、脳実質内の制御幅と深さの外傷を生成するために鋭利な針でけがをされている。我々の方法は、同時薬物アプリケーションと組み合わせることができ、注射針で刺す定位を使用しています。我々は、この方法は、哺乳動物の脳における急性の外傷の病態生理学的影響の細胞機構を研究するための高度なツールとして使用することができることを提案する

概要

急性脳損傷は、自動車のクラッシュにおける損傷の高い発生率と有意な公衆衛生問題である落下又は暴行、およびその後の慢性障害の有病率が高い。脳損傷の治療に対する治療的アプローチは、このように、病院前の手術や救命医療の有効性を制限する、完全に症候性のまま。これは脳損傷の社会的·経済的影響が特に深刻になる。様々な理由のために、臨床試験のほとんどは、新規な治療アプローチを使用して脳損傷後の回復の改善を示すことができなかった。

動物モデルは、薬効が脳損傷を有する患者において予測することができるステージに向けて新たな治療戦略を開発するために重要である。現時点では、頭部外傷のいくつかの十分に確立された動物モデルは、制御された皮質衝撃1は、流体パーカッション傷害2、動的変形皮質3、体重低下を含む、存在する4とフォト損傷5。実験モデルの数は、頭部外傷に関連した病理学の特定の形態学、分子生物学および行動の側面を研究するために使用されてきた。しかし、単一の動物モデルは、新たな治療戦略の検証において完全に成功していない。脳損傷の、信頼性の高い再現性及び制御された動物モデルの開発は、複雑な病理学的プロセスを評価する必要がある。

最新の顕微鏡イメージング技術と遺伝的に符号化された蛍光レポーターの新規な組み合わせは、一次損傷、二次的損傷、および再生の広がり、原発傷害を含む脳損傷のすべてのフェーズを、調査する前例のない機会を提供しています。具体的には、in vivoでの 2光子顕微鏡は、げっ歯類の脳の深部皮質層の細胞でも細胞内構造をリアルタイムに可視化を可能にする独自の非線形光学技術です。細胞やORGAにはいくつかの種類Nelles社は、異なる蛍光マーカーを組み合わせることによって同時に撮像することができる。この強力なツールを使用して、我々は外傷後の条件での脳の生活の動的な形態学的および機能的変化を視覚化することができます。脳損傷の研究にin vivoでの 2光子顕微鏡の利点は、最近キーロフと同僚6によって実証された。軽度の焦点皮質挫傷モデルを使用して、これらの著者は、pericontusional皮質の急性樹状損傷がローカルの血流の減少によりゲート制御されることを示した。さらに、それらは挫傷部位の周囲の代謝的に損なわ皮質をさらに脱分極拡散によって損傷されることを実証した。この二次的な損傷は、外傷性脳損傷の影響がより深刻なこと、シナプス回路に影響を与えます。

ここでは、地元の頭脳のための高度なモデルとして、同時局所薬物のアプリケーションと組み合わせることができる注射針で刺す定位の方法を提案する傷害およびin vivoで哺乳動物の脳内の急性外傷の病態生理学的影響を研究するためのツールとして。

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プロトコル

ここで紹介するすべての手順は、動物のケア（動物実験2006分の62にフィンランドACT）のためのローカルのガイダンスに従って行った。動物ライセンス（ESAVI/2857/04.10.03/2012）は、地方自治体（ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA）から入手した。 1-3ヶ月齢の成体マウス、体重24〜38グラムは、認定大学の動物施設内の個々のケージで飼育し、餌と水を自由に与えた。

1。頭蓋窓を通して脳損傷イメージング

  1. 動物を麻酔し、演算フィールドを調製する
    1. フィルター滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH7.4中に溶解したケタミン（ケタラール、80ミリグラム/ kg）およびキシラジン（ロンプン、10 mg / kg）の混合物の腹腔内注射によりマウスを麻酔。麻酔の深さを確認するために、マウスの反射神経を定期的に（尾とつま先のピンチプローブ）を確認してください。適切なときに適切な麻酔を維持するために、投与量を増加させるがoverdを避けるOSE。
    2. 麻酔からの回復後に手術、撮像セッションと最初の1時間加熱パッドを使用して37.0℃で動物を維持する。
    3. 乾燥からマウスの目を保護するために、目の潤滑剤を塗布。
    4. 炎症や脳浮腫を軽減するために皮下注射することにより、デキサメタゾン（Rapidexon獣医、2 mg / kgの）を管理。
    5. 前または直後に手術後30分まで（Ketoprophene腹腔例えば）鎮痛剤を投与する。動物はこのような、移動飲食、または体重減少に難色として痛みの症状を示す場合、流涎、立毛、または異常な呼吸は、手術後、鎮痛剤の注射を繰り返し鳴ります。
    6. シェービングマシン（材料および装置を参照）、マウスの頭を剃る。ウィスカーの損傷を防ぐ。
    7. 剃毛領域をきれいにする70％エタノール溶液でマウスの頭部の皮膚を処置する。
    8. 外科はさみを使用して（材料とを参照してください。機器）と鉗子（材料および装置を参照）、額に耳の間の中間線から皮膚を切った。
    9. 優しく鈍い顕微刃で頭蓋骨に付着した結合組織を削り取る。
    10. 横皮膚の境界線をスライドさせて、わずかに頭と皮膚固定用の頭蓋骨の聴覚オリフィスに耳バーを引き出します。
    11. 次いで、滅菌綿棒、圧縮空気の組み合わせを使用して、頭蓋骨の表面を乾燥、滅菌PBSで頭蓋骨をきれいにし、0.5％グルコン酸クロルヘキシジンでマウスの頭に手術部位を治療。
  2. 刺す傷害の刑罰
    1. 位置動物ホルダーと小動物定位装置（材料および装置を参照）。
    2. 動物の頭蓋骨の表面に集中する次の定位固定装置に双眼顕微鏡の位置を調整します。
    3. 双眼顕微鏡を用いて、頭蓋骨にブレグマポイントを探します。
    4. レジオを識別定位座標を使用して、近隣のnである。
      注：直接表面的な皮質血管の上に配置された関心のある分野を避けてください。これらの破壊は強く外傷の進行に影響を与えることができる。
    5. 選択した領域の上の30のGの針を配置し、頭蓋骨の表面を引っ掻いて標的部位をマーク。
    6. 影響を受けた骨の表面領域の不要な拡大を避けるために、すべての可能な予防措置で頭蓋骨を開けます。顕微鏡下での高速外科ドリルを（材料および装置を参照）を使用します。液体が掘削領域に表示された場合に掘削を停止します。
    7. 針で掘削井戸の底に触れてください。
    8. プリック適用部位の座標に応じて0.5〜2.0ミリメートルの深さまで、脳（挿入率5〜10ミリメートル/分）にスムーズに針を浸します。
    9. 所望の深さに達した後、直ちに針を取り外します（後退速度5〜10ミリメートル/分）と小さなタンポンを刺す後に現れる血を拭く（SEE資機材）。
    10. マイクロシリンジポンプ（WPI）を使用して病変部位に100μMのローダミン101または関心のある他の化合物のマイクロインジェクションを行い、10μlのハミルトンシリンジをガラスピペットで組み立てる。
      NOTE：ホウケイ酸ガラス毛細管からガラスピペットの調製中に、10〜20ミクロンの直径に先端を鋭く。
    11. 2-5 NL /秒の速度で注射液の25​​0-1,500 NLを吹き込む。
      注：その後、ソリューションの流出を防ぐために、ゆっくりと慎重に取り外し、脳実質内に少なくとも5分間の注入の終了後に、ピペットのままにしておきます。
  3. 慢性頭蓋窓のため開頭
    1. 損傷部位の周りに円窓を作るためにゆっくりと、慎重に頭蓋骨を開けます。 3〜3.5ミリメートルの窓径を使用してください。
    2. w iを覆う皮質緩衝液滴（125mMのNaCl、5mMのKCl、10mMのグルコース、10mMのHEPES、蒸留H 2 O中2mMのCaCl 2および2mMのMgSO 4）し適用する表示ウインドウ。
    3. 頭蓋窓の丸いガラスカバースリップ（＃1.5厚さ）の位置にします。
    4. カバーガラスの周りの皮質バッファの過剰を取り除く。
    5. アクリル接着剤でカバースリップの端をシール（材料および装置を参照）。
      注：接着剤がカバーガラスの上面に塗布されていないことを確認してください。カバーガラスを接着剤で汚染されている場合は、慎重にマイクロブレードを汚染する接着剤を除去すると、ガラスを安定して頭蓋骨に接着されるまで待機し、ガラス表面に接着剤が乾く。
    6. 接着剤が枯渇せて5分間待ちます。
    7. 金属ホルダを配置することができるように、耳のバーの高さのネジを使用して、ヘッド位置を調整する。
    8. （材料および装置を参照）スチールホルダーのリングにアクリル接着剤の少量を適用します。
    9. 後方監督の金属ホルダーハンドルカバーガラスにスチールホルダーのリングを接着します。
    10. 接着剤が枯渇せて5分間待ちます。
    11. MIX歯科用セメントの粘性条件を達成するために3.5センチメートルペトリ皿（またはアナログ）にポリアクリル接着剤で（材料および機器を参照）。
    12. セメント+接着剤混合物を用いた頭蓋窓の境界をシールし、皮膚の国境まで同じ混合物で頭蓋骨の露出面をカバーしています。
    13. セメント+接着剤混合物が枯渇して、耳のバーを削除できるように15分間待ちます。
    14. それはプロトコル3に記載のように関心領域及び制御領域の二光子励起顕微鏡（テンソル積展開法）撮影を行う。
    15. イメージングの後、動物は加熱パッド上に麻酔から回復し、完全に回復するまで観察下に個々のケージにそれを維持することができます。ウェットフードは、咀嚼や水和を促進するために与えることができます。

2。間伐頭蓋骨を通して脳損傷イメージング

  1. 動物Anaesthetizingおよび演算フィールドを調製する
    1. マウスを麻酔し、外傷誘導のために準備工程1.1に記載のように。
  2. 頭蓋骨の間伐やプリック損傷の刑罰
    1. 位置動物ホルダーと小動物定位器（材料および機器を参照）。
    2. 動物の頭蓋骨の表面に集中する次の定位固定装置に双眼顕微鏡の位置を調整します。
    3. 双眼顕微鏡を用いて頭蓋骨にブレグマ点の位置を確認し、定位座標に基づいて画像化される脳領域を特定し、引っ掻いてそれをマーク。
      注：頭蓋骨の安定性は、それらの領域に侵害されたとしてスカル間伐位置は、頭蓋縫合の上または近くに配置するべきではありません。さらに、頭蓋骨縫合糸の下に位置する大皮質または髄膜血管および髄膜は、撮像アーチファクトを引き起こす可能性がある。
    4. 動物の頭蓋骨に関心のある領域上に接着剤で被覆された金属ホルダーを配置し、光の圧力を適用し、金属ホルダーがしっかりと頭蓋骨に接着されるまで5分間待ちます。
    5. 粘性の条件を達成するために3.5センチメートルペトリ皿（またはアナログ）にポリアクリル接着剤で（材料および機器を参照）歯科用セメントを混ぜる。
    6. セメント+接着剤混合物と金属ホルダーの境界をシールし、皮膚の国境まで同じ混合物で頭蓋骨の露出面をカバーしています。
    7. セメントや接着剤混合物が枯渇させるために15分間待ちます。
    8. 非重合接着剤の残りを洗い流すように、薄くなった頭蓋骨領域およびPBSで金属ホルダーの周囲の部分を数回すすいでください。
      注意：ホルダーに頭蓋骨の安定した取り付けを確実にするために非常に重要です。これは、撮影時の準備の安定性を可能にします。
    9. 双眼顕微鏡の高倍率モードを使用して、直径〜0.5〜1.5ミリメートルの薄くなった頭蓋骨領域を作成するために、高速マイクロドリルで頭蓋骨の上層を除去します。骨の破片を除去するために掘削中に圧縮空気を使用しています。掘削intermittentlを行う摩擦によって誘発される過熱を避けるために、間伐手順中Y。室温溶液を用いてドリルビットを冷却し、定期的に熱を吸収するために薄型化エリアへのバッファを適用します。
      注：皮質の損傷を回避するために、薄い層（<50ミクロン）まで大きな領域（> 1.5ミリメートル）上でドリルダウンしません。
      注：齧歯類頭蓋骨構造は、海綿骨の厚い層で分離された緻密骨の2の薄層で構成されています。海綿骨の小さな空洞が血管を含有する、同心円および細管を形成する。外部コンパクト骨層とスポンジ状の層のほとんどの両方を削除するために、マイクロドリルを使用しています。海綿骨内の血管の破壊は、出血を引き起こすことがあります。この出血を止めるために止血コラーゲンスポンジを使用してください。
    10. 海綿骨の大部分が削除されたかどうか検査するために第二高調波発生（SHG）イメージングを使用してください。残りの骨が目であることを確認して、過度の薄肉化を避けるように注意してください準備のこの段階では50μmよりicker。
    11. 薄くなった領域の上に暖かいバッファー（35〜37℃）の低下を置く。さらに、骨の層を除去し、〜20μmの骨の厚さ、直径〜700ミクロンの円滑なエリアを形成するためにバールを仕上げ顕微ブレードやマイクロを使用してください。このステップの間に、反復的なSHGイメージングを行い、定期的に骨の厚さを測定するために有用である。
    12. 関心領域とコントロール領域のためのテンソル積展開法の撮影を行う。
    13. 領域は厳密に水平に配置されて薄くなったように耳のバーの高さのネジを使用してヘッド位置を調整します。薄くなった領域の上に針を置き、標的部位の下に大きな船がないことを確認してください。
    14. 薄くなった頭蓋骨表面から0.5〜2.0ミリメートルの深さに、脳内に針を浸し、プリック適用部位の座標に応じによって病巣を作る。
    15. 針を外し、T後に現れる出血を抑える彼は止血タンポン（材料および機器を参照）脳損傷、急性。損傷部位での血の塊の形と血管の脈動が停止するまで待ちます。
    16. セクション1.2.10で説明したように、100μMのローダミン101または病変部位への関心の別の化合物のマイクロインジェクションを実行します。
    17. プロトコル3に記載のように損傷の進行および回復をモニターするためにテンソル積展開法撮影を行う。
    18. イメージングの後、動物は加熱パッド上に麻酔から意識を回復することができます。無人の動物を残し、唯一のフル物理復旧後にそのホームケージに戻すことはありません。

3。イメージング

  1. カスタム構築されたフレームに金属ホルダーを装着することにより、顕微鏡下で動物を置きます。
  2. イメージングのために、 例えばマイタイDeepSeeのレーザーとのin vivo二光子用に最適化さXLPLN 25X 1.05 NAの水浸対物レンズを搭載したFV1000MPE 2光子顕微鏡を使用イメージング。
  3. 広視野蛍光モードを用いて顕微鏡下で病変部位を同定する。脳血管系を視覚化し、血管の観察されたパターンに従って制御領域を選択するためにロングパスフィルタを使用する。
  4. 画像の第二高調波発生（SHG）信号、同調波長800nm​​のフェムト秒レーザー380から410 nmのバイパス·フィルタを用いて放出された光を集める。蛍光イメージングのために、放射された光を収集するためにバンドパスフィルタ（515から560 nm）を使用し、以下の波長が蛍光励起するために使用される：GFP-860 nmのYFP-950ナノメートル。
  5. 画像取得のためのFLUOVIEWソフトウェアを使用してください。
  6. ストアは、その後の反復的なイメージングのためのすべてのROIの座標。時間をかけて画像と同じ関心領域を、座標の画像の重なりを最大化するたびに調整してください。
  7. 適切なソフトウェア（ 例えば 。のImageJ）を使用して画像を分析します。ここに提示再構成は、IMARISソフトウェアを用いて行った。

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結果

トランスジェニックマウスにおける外傷後の脳の画像化のために、1）慢性頭蓋窓および2）頭蓋骨間伐：我々は2つ​​の操作方法を最適化しています。実験的製剤の模式図が図1に示されている。の0.3mm OD（G 30）のスチール針による穿刺外傷性は、当穿孔（ 図1A）に印加される。 THY1-YFP-の三次元再構成で示されているように頭蓋骨間伐は、約300ミクロン（ 図1C）の制限を課す傾向にあるのに対し、成功した頭蓋窓の準備は、軟膜表面（ 図1B）、以下の650ミクロンまでの深さでイメージングを可能にするHマウス皮質錐体ニューロン。

大脳皮質の制御された量の樹状突起と毛細血管網の破壊の排除におけるプリック外傷の結果。最初の2日間、病変領域が増加し、外傷誘導性樹状突起のブレブ形成および樹状後退bの形成perilesion領域のulbs、 インビボ多光子顕微鏡で （ 図2）...

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ディスカッション

脳外傷は突然の、予期できないイベントです。ここでは、このような神経変性、樹状突起の除去、脳浮腫、グリア性瘢痕、焦点くも膜下出血との透過性の増大と相まって、大脳皮質内の出血などの脳損傷後のヒト患者で観察病理学的変化のスペクトルを再現する動物モデルを記述する血液脳関門。プライマリとセカンダリの病因を研究だけでなく、外傷後の回復には、この損傷モデルは、細かい神経細胞とグリア構造物の生体内可視化の縦と一緒にした。トランスジェニックマウス系統は、（THY1-YFP-H）7、アストロサイト（GFAP-EGFP）8神経細胞で蛍光タンパク質を発現する、またはミクログリア（CX3CR1-EGFP）9が使用された。さらに、当社はSulfarhodamine 101 10と第二高調波発生（SHG）イメージングおよびアストロサイトのロードを使用していました。

ここで説明するモデルは、PENEを再現脳損傷のtratingタイプ。したがって、本モデルの制限は、閉鎖性頭部外傷のメカニズムに...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

私たちは、GFAP-EGFPおよびCX3CR1-EGFPマウス系統を提供するための博士フランクキルヒホッフに深く感謝しています。作品は、フィンランドの国際的な流動のセンター、技術庁、神経科学のフィンランド大学院（FGSN）、フィンランドアカデミーからの補助金によって支えられている。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2A-saダムピンセット、115 mmXYtronicXY-2A-SA
30 G ½ 針BDREF 304000
アニマルトリマー、シェービングマシンAesculapIsis GT420
双眼顕微鏡ZeissStemi 2000
ステンレス製加熱パッド付き生体温度コントローラーSupertechTMP-5b
鈍い顕微手術刃BDREF 374769
フィラメント付きホウケイ酸チューブSutter InstrumentsBF120-69-10ガラスピペット製造用
カルプロフェンファイザーリマジル獣医
クロルヘキシジンジグルコン酸シグマC9394
歯科用セメントDrguDent, DentsplyREF 640 200 271
デキサメタゾンFaunaPharmaRapidexon獣医
使い捨てドリルマイジンガーHP310 104 001 001 008
ダルベコ's PBS 10xシグマD1408
デュモン #5 鉗子、110 mmFST91150-20
イーリング マイクロ電極プーラーイーリング50-2013ガラスピペット製造用垂直プーラー
眼軟膏ノバルティスビスコティアーズ
フォアダムドリルコントロールフォアドムFM3545
フォアダム マイクロモーター ハンドピースマウス用ForedomMH-145
ガス麻酔プラットフォームStoelting50264定位固定装置に組み立て
止血 コラーゲンスポンジAvitene, Ultrafoam BARDRef 1050050
ImarisBitplane
KetamineIntervetKetaminol vet
Mai Tai DeepSee laserSpectra-Physics
金属ホルダー神経タール
マイクロドレッシング鉗子、105 mmAesculapBD302R
MicrofilWPIMF34G-5マイクロシリンジ充填毛細血管
鉱物油SigmaM8410
多光子レーザー走査顕微鏡オリンパスFV1000MPE
NanoFil シリンジ 10μlWPINANOFILハミルトン シリンジ
不織布綿棒 5 x 5Molnlycke ヘルスケアMesoft外科用タンポン
ポリアクリル接着剤ヘンケルロックタイト 401
丸型ガラス カバースリップ 電子顕微鏡科学
1.5 厚さ 
小動物定位固定装置用 David Kopf Instruments900
Stoelting マウスと新生児用ラットアダプターStoelting51625脳定位固定装置に組み立てられました。
学生用虹彩はさみ、ストレート11.5 cmFST91460-11
スルフォロダミン101プローブS-359
UMP3マイクロシリンジポンプおよびマイクロ4マイクロシリンジポンプコントローラーWPIUMP3-1マイクロインジェクターおよびコントローラー
キシラジンバイエルヘルスケアロンプン獣医
られた 分子

参考文献

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