ソリッド検体からの原発性卵巣癌細胞を得る方法

その比較的低い発生率にもかかわらず、卵巣癌は婦人科疾患と女性の^1,2のがんによる死亡の第五の主要な原因の最も致命的である。これは主に忠実疾患³の開始および進行を再現信頼性の高いツールとモデルの不足が原因です。卵巣癌についての我々の知識今日のほとんどは、腹水から回収^4-7不死化卵巣表面上皮細胞（IOSが）、卵巣癌細胞株および原発性卵巣癌細胞の使用により可能であった。残念ながら、それらの使用は、不死化プロセスまたは体外路及び腹水製剤から得られた集団の異質性に関連する遺伝的および表現型変化の数など、いくつかの制限があります。

そのため、卵巣癌の特定可能な、特定の固体標本由来の初代卵巣癌細胞はuniquを表す卵巣癌の進行を研究するための電子ツール。

これらの悪性細胞の取得に必要な主な困難は、生存率およびこれらのEOC細胞の培養における増殖能力の早期不足の損失に伴う間質細胞や線維芽細胞の異常増殖によるものである。固形腫瘍からの単細胞懸濁液を作成するには、いくつかの方法が、現在、しかし、特定の技術が有利な結果⁸より多くの量が得られ、機械的手段または酵素的解離によって、存在しています。ここでは、実行可能な、線維芽細胞のないEOC細胞の効果的な回復のディスパーゼIIの結果とその酵素消化を示しています。このようにして得られたEOC培養物は、遺伝子操作を非常に受けやすいと薬物スクリーニング試験においても有用であり、これらのEOC培養物は、多くの下流の用途に適していることを示している。

倫理に関する声明
ヒト被験者の委員会（IRB）の承認：卵巣癌の固体試料は、治験審査委員会委員の後にミネソタ大学の組織調達機能（TPF）から得た。

1。試薬のセットアップ

1. 10％のFBS、100単位ペニシリン - ストレプトマイシンを含むDMEMを補充することにより完全DMEM培地を準備します。 4℃でメディアを格納し、温める37℃、使用前に。
2. 複数の凍結を回避するため5〜10 mlを別々のボリュームに分量のディスパーゼIIはnonfrostフリー冷凍庫に-20℃で解凍して保存。

2。組織採取

1. 肉眼的病理学者によって癌と識別領域から手術時に卵巣癌（サイズは〜5グラム）の固体の試料を収集します。臨床検体は、制度的なプロトコルに従って脱識別され、登録されている。
2. 無菌、サウスカロライナ州での試験片を置きREW蓋、ポリプロピレン、氷冷PBS 30mlで充填された容器を片。氷上での処理のための研究室に外科病理検査室からの検体を輸送し、検体採取（ 図1）から30分以内。

3。組織処理

1. （（2mm以下）、さらに可能な限り最小の断片に切断、無菌条件下で作業し、ペトリ皿（X 60ミリメートル60ミリメートル）、新鮮な、氷冷PBSの10ミリリットルを含有し、滅菌したカミソリの刃を使用して上にサンプルを転送図2Aおよび2B）。
2. DMEM中のディスパーゼII（2.4 U / ml）を（30分間37℃）温めておいた10mlのを含む15ミリリットルの円錐管に刻んだ組織を移し、30分間、5％CO _2、37℃でインキュベートする。標本の最適な消化を確実にするために、手動で細胞スラリーごとに5分を攪拌する。
3. 30分間のインキュベーション、移動（使用した後10ミリリットルの血清学的ピペット）セルストレーナー（70ミクロンメッシュ）上に細胞スラリーは、50ミリリットルコニカルチューブの上に配置し、シリンジプランジャを使用してメッシュに対する穏やかな圧力を適用します。 （メッシュの上に残っている）すべての未解離組織を捨て、50ミリリットルの滅菌コニカルチューブ内の得られた細胞懸濁液を収集します。 4℃（ 図3）で7分間320×gで遠心します。
4. 上清を捨て、10％のFBSを含むDMEMの10ml中に細胞ペレットを再懸濁する。
5. 5％のCO _2、37℃（ 図4）でのシャーレ中の細胞懸濁液をインキュベートする。
6. 最初のプレーティングから24時間後に培地を変更します。これは細胞片の除去及び培養物中に存在する赤血球の大半を可能にします。
7. メディアをプライマリEOCの文化が下流のアプリケーションのための準備ができているし、その後、次の2週間、3日ごとに変更します。

卵巣癌の臨床検体を、新鮮な細胞スラリーを構成する（ 図1）手術後に収集し、小片（ 図2Aおよび2B）に切断される。これは酵素処理への検体の最適な露出が可能になります。細胞スラリーを酵素消化に曝し、30分間37℃でインキュベートする。インキュベーション時間の間、スラリーは、（特に、各攪拌後）ますます濁り、これは、組織脱凝集のサインです。インキュベーション時間の最後に、スラリーは、任意の組織解離していない（ 図3）からEOC細胞を分離する細胞ろ過器上に転写される。回収した細胞懸濁液を、5％CO 2、37°C（Fのigure 4）に配置される。この段階で、細胞培養物の形態は、単一細胞懸濁液として、小塊の両方のEOC細胞の存在を明らかにする。この時点での培養もPRESENを明らかに赤血球と、図5に示すように、小さな破片のCE。 EOCがゆっくり（1〜3日の期間にわたって）プラスチックに付着する重要なのが、赤血球や細胞破片が、彼らは最終的かつ漸進的」文化から消え」になることはありません。最初のプレーティングから3日目までに、EOC培養は、接着性、EOC細胞クラスターと図6に示すように徐々に少なく赤血球や破片の増加を示している。一日6-7により、EOC細胞は、スワール状の形状（矢印）を形成し、 図7に示すように、EOC細胞の典型的な敷石状形態をもたらすより大きな多細胞凝集体を形成するためにプラスチックに拡散し始める。 14日までに、EOC細胞は、典型的にコンフルエント（ 図8）になり、現在は下流のテストとアプリケーションのための準備が整いました。

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図1の臨床検体の収集。卵巣癌の固体片は、手術時に採取し、氷冷PBS 30mlで充填し、滅菌したネジ蓋、ポリプロピレン検体容器内に配置される。

図2。臨床検体の処理。新鮮な氷冷した1×PBSを10ミリリットルを含むペトリ皿上に移しA）固体試料。さらに、サイズが2ミリメートル程度の断片に切断B）臨床検体。

図4 EOC細胞懸濁液を得られるのメッキは解離していない任意の組織を除去した後、細胞懸濁液を遠心分離し、DMEMの続き10mlに再懸濁aining 10％FBSおよび5％CO 2、37℃でペトリ皿中でインキュベートし

図5直ちに処理後のEOC細胞培養物のモルフォロジー。細胞懸濁液めっき（共に矢印で示される）単一細胞懸濁液として塊にEOCを示した直後に、赤血球および細胞破片は、まだこの段階ではたくさんある。オリジナルの倍率、20倍。

3日目EOC細胞培養物の図6形態メッキ半付着EOC cを示した後3日目。EOC細胞培養物をプレーティングした後（矢印で示される）のエル·クラスターの少ない赤血球汚染。オリジナルの倍率、20倍。

図7。初期めっき後一週間。EOC細胞培養をメッキから一週間後に確立EOC培養は組織培養プラスチック上で広がった細胞の渦巻き状のクラスターを示しています。オリジナルの倍率、20倍。

図8。コンフルエントEOC培養。培養14日後に、典型的な上皮丸石の形態を示すEOC細胞のコンフルエントな単層。

著者らは、開示することは何もありません。