ソリッド検体からの原発性卵巣癌細胞を得る方法

サマリー

本研究では、固体の臨床検体からの原発性卵巣癌細胞の単離および特徴付けのための詳細な方法を記載している。卵巣癌臨床検体は、下流の用途に非常に適した生存可能な、線維芽細胞を含まない上皮性卵巣癌（EOC）細胞を得るために酵素消化に供される。

要約

卵巣癌の発生および進行を調査するための信頼性の高いツールが緊急に必要とされている。卵巣癌細胞株の使用は、卵巣癌を理解するための貴重なツールのままで、それらの使用は多くの制限がある。これらは、異質性の欠如および拡張のin vitro継代に関連した遺伝子変異の過多があります。ここでは、手術時に回収した固体臨床検体を形成原発性卵巣癌細胞の迅速な確立を可能にする方法を記載している。この方法は、30分間酵素消化に臨床検体を施すからなる。単離された細胞懸濁液を増殖させ、薬物スクリーニングを含め下流側のアプリケーションのために使用することができる。確立された卵巣癌細胞株上の原発性卵巣癌細胞株の利点は、それらが由来し、異なる部位か否かに由来することができる元の特定の臨床検体の代表的なものであるということで一応RYまたは転移性卵巣癌。

概要

その比較的低い発生率にもかかわらず、卵巣癌は婦人科疾患と女性の^1,2のがんによる死亡の第五の主要な原因の最も致命的である。これは主に忠実疾患³の開始および進行を再現信頼性の高いツールとモデルの不足が原因です。卵巣癌についての我々の知識今日のほとんどは、腹水から回収^4-7不死化卵巣表面上皮細胞（IOSが）、卵巣癌細胞株および原発性卵巣癌細胞の使用により可能であった。残念ながら、それらの使用は、不死化プロセスまたは体外路及び腹水製剤から得られた集団の異質性に関連する遺伝的および表現型変化の数など、いくつかの制限があります。

そのため、卵巣癌の特定可能な、特定の固体標本由来の初代卵巣癌細胞はuniquを表す卵巣癌の進行を研究するための電子ツール。

これらの悪性細胞の取得に必要な主な困難は、生存率およびこれらのEOC細胞の培養における増殖能力の早期不足の損失に伴う間質細胞や線維芽細胞の異常増殖によるものである。固形腫瘍からの単細胞懸濁液を作成するには、いくつかの方法が、現在、しかし、特定の技術が有利な結果⁸より多くの量が得られ、機械的手段または酵素的解離によって、存在しています。ここでは、実行可能な、線維芽細胞のないEOC細胞の効果的な回復のディスパーゼIIの結果とその酵素消化を示しています。このようにして得られたEOC培養物は、遺伝子操作を非常に受けやすいと薬物スクリーニング試験においても有用であり、これらのEOC培養物は、多くの下流の用途に適していることを示している。

プロトコル

倫理に関する声明
ヒト被験者の委員会（IRB）の承認：卵巣癌の固体試料は、治験審査委員会委員の後にミネソタ大学の組織調達機能（TPF）から得た。

1。試薬のセットアップ

1. 10％のFBS、100単位ペニシリン - ストレプトマイシンを含むDMEMを補充することにより完全DMEM培地を準備します。 4℃でメディアを格納し、温める37℃、使用前に。
2. 複数の凍結を回避するため5〜10 mlを別々のボリュームに分量のディスパーゼIIはnonfrostフリー冷凍庫に-20℃で解凍して保存。

2。組織採取

1. 肉眼的病理学者によって癌と識別領域から手術時に卵巣癌（サイズは〜5グラム）の固体の試料を収集します。臨床検体は、制度的なプロトコルに従って脱識別され、登録されている。
2. 無菌、サウスカロライナ州での試験片を置きREW蓋、ポリプロピレン、氷冷PBS 30mlで充填された容器を片。氷上での処理のための研究室に外科病理検査室からの検体を輸送し、検体採取（ 図1）から30分以内。

3。組織処理

1. （（2mm以下）、さらに可能な限り最小の断片に切断、無菌条件下で作業し、ペトリ皿（X 60ミリメートル60ミリメートル）、新鮮な、氷冷PBSの10ミリリットルを含有し、滅菌したカミソリの刃を使用して上にサンプルを転送図2Aおよび2B）。
2. DMEM中のディスパーゼII（2.4 U / ml）を（30分間37℃）温めておいた10mlのを含む15ミリリットルの円錐管に刻んだ組織を移し、30分間、5％CO _2、37℃でインキュベートする。標本の最適な消化を確実にするために、手動で細胞スラリーごとに5分を攪拌する。
3. 30分間のインキュベーション、移動（使用した後10ミリリットルの血清学的ピペット）セルストレーナー（70ミクロンメッシュ）上に細胞スラリーは、50ミリリットルコニカルチューブの上に配置し、シリンジプランジャを使用してメッシュに対する穏やかな圧力を適用します。 （メッシュの上に残っている）すべての未解離組織を捨て、50ミリリットルの滅菌コニカルチューブ内の得られた細胞懸濁液を収集します。 4℃（ 図3）で7分間320×gで遠心します。
4. 上清を捨て、10％のFBSを含むDMEMの10ml中に細胞ペレットを再懸濁する。
5. 5％のCO _2、37℃（ 図4）でのシャーレ中の細胞懸濁液をインキュベートする。
6. 最初のプレーティングから24時間後に培地を変更します。これは細胞片の除去及び培養物中に存在する赤血球の大半を可能にします。
7. メディアをプライマリEOCの文化が下流のアプリケーションのための準備ができているし、その後、次の2週間、3日ごとに変更します。

結果

卵巣癌の臨床検体を、新鮮な細胞スラリーを構成する（ 図1）手術後に収集し、小片（ 図2Aおよび2B）に切断される。これは酵素処理への検体の最適な露出が可能になります。細胞スラリーを酵素消化に曝し、30分間37℃でインキュベートする。インキュベーション時間の間、スラリーは、（特に、各攪拌後）ますます濁り、これは、組織脱凝集のサインです。インキュベーション時間の最後に、スラリーは、任意の組織解離していない（ 図3）からEOC細胞を分離する細胞ろ過器上に転写される。回収した細胞懸濁液を、5％CO _{2、37°C（F}のigure 4）に配置される。この段階で、細胞培養物の形態は、単一細胞懸濁液として、小塊の両方のEOC細胞の存在を明らかにする。この時点での培養もPRESENを明らかに赤血球と、図5に示すように、小さな破片のCE。 EOCがゆっくり（1〜3日の期間にわたって）プラスチックに付着する重要なのが、赤血球や細胞破片が...

ディスカッション

卵巣がんの病因と開発のより良い理解は、この壊滅的な疾患に罹患した女性の結果を改善することが重要です。この文脈での使用が確立され、「市販の「卵巣癌細胞株は、間違いなく飛躍的に有用であった。しかし、今日、我々は癌細胞株は、彼らが異質^9,10の欠如など、多くの面で由来するヒト腫瘍を代表するものではないことを知っている。

ここでは、直接手術標本の分離の30分以内に卵巣癌の臨床検体からの分離と原発性卵巣癌細胞を培養するための迅速かつ信頼性の高い方法を報告している。

初代細胞は、腹水対固体試料から単離されるので、これは前の腹水形成が起こる時間に疾患の初期段階からの細胞を単離するという利点を有する。この技術はまた、副を有する特定のサイトからの原発性卵巣癌細胞を単離するアンテージ。このプロトコルを使用して実行可能な原発性卵巣癌細胞を得ることに成功した試料は、手術後に処理することができるいかに迅速に大きく依存する。最良の結果を得るには、標本は手術から30分以内に受信する必要があります。これが不可能な場合、試料は、一晩（PB...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1x PBS、滅菌	Invitrogen	14190-144
スクリュー蓋、ポリプロピレン試料容器、滅菌済み	Thermo Scientific	02 1090
DMEM medium、滅菌済み	Invitrogen	11995-065
ウシ胎児血清、滅菌済み	Thermo Scientific Hyclone	SH30396.03
100x ペニシリン-ストレプトマイシン、液体	Invitrogen	15140-122
Dispase II、滅菌済み	Roche	04942 078 001
小型細先端鉗子およびメス刃、滅菌済み	Fisher Scientific	鉗子: 08-953E, 刃: 08-927-5D
小型解剖ハサミ、滅菌済み	Fisher Scientific	08-945
15 ml コニカルキャップ付きチューブ、滅菌済み	BD ファルコン	352097
50 ml コニカルキャップ付きチューブ、滅菌済み	BD ファルコン	352027
10 ml セロジカルピペット、滅菌済み	Corning	13-678-11E
6 mlシリンジプランジャー、滅菌	タイコヘルスケア	8881516911
ナイロンフィルター(70 μm ) セルストレーナー、滅菌済み	BD Falcon	352350
5 cm シャーレ、滅菌済み	コーニング430166
10cmシャーレ、滅菌	コーニング430167