方法論記事

ヒトiPS細胞のマイクロRNA発現プロファイル、IPから派生網膜色素上皮、および胎児の網膜色素上皮

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DOI：

10.3791/51589

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2014年6月24日

 ,  ,  ,  , 
1Ocular Trauma, U.S. Army Institute of Surgical Research, JBSA Fort Sam Houston

この記事について

サマリー

マイクロRNA（miRNAを）人為-多能性幹（IPS）細胞（IPS-RPE）、および胎児RPE由来のヒト誘起多能性幹（IPS）細胞、網膜色素上皮（RPE）のプロファイルは、比較した。

要約

このレポートの目的は、マイクロRNA（miRNAを）ヒトiPS細胞（IPS-RPE）に由来する人為-多能性幹（IPS）細胞、網膜色素上皮（RPE）、および胎児RPEのプロファイルを比較するためのプロトコルを記述することである。プロトコルは、マイクロアレイによる解析のためのRNAの収集、および差次3種の細胞型間で発現されるmiRNAを同定するためのマイクロアレイデータの分析を含む。 iPS細胞や胎児RPEの培養のための方法を説明します。ヒトiPSからのRPEの分化に使用されるプロトコルにも記載されている。我々が記述するRNA抽出技術は、miRNAのマイクロアレイにおける使用のための非常に小さなRNAの最大の回収を可能にするように選択した。最後に、マイクロアレイデータの細胞経路およびネットワーク分析を説明する。これらの技術は、3つの異なる細胞型のmiRNAプロファイルの比較を容易にする。

概要

幹細胞は無制限に複製する能力、および任意の体細胞型に分化する可能性を有する。パーソナライズされた組織再生の出現が地平線1にあるように多能性幹細胞への体細胞を再プログラムするための技術の開発は、研究コミュニティ内や臨床医の間で大きな興奮を誘発しました。誘起多能性幹（IPS）細胞のESCに関連する倫​​理的ジレンマを回避しながら、胚性幹（ES）細胞のような無限の複製能力と多能性の同じ特徴を示す。加えて、患者由来の幹細胞が大幅に成功した治療への応用2-3の確率を増大させる、免疫応答を刺激しないであろう。特定の培養条件下で、iPS細胞は、心筋細胞、ニューロン、膵臓β細胞、肝細胞、および網膜色素上皮（RPを含む、インビトロでいくつかの異なる細胞型に分化することが示されているE）を4月12日 。

RPEは、生産に特化したような光受容体外側セグメントの迷光、食作用の吸収などの視覚的な健康と機能に不可欠ないくつかの機能を実行、網膜の奥に位置して色素上皮細胞層、およびレチノイドの処理である視覚発色団の。例えば、加齢性黄斑変性症（AMD）、シュタルガルト病、及び網膜色素変性症（RP）などの下地RPE病理の結果である失明疾患によって証明されるようによる損傷または疾患にRPEの機能不全が深く、感光体の健康および視覚機能に影響を与え13。視力を回復することができ、本当に効果的な治療が達成されておらず、健全なRPEと病気のRPEの交換はビジョン14〜15の損失を防止するための最良の選択肢かもしれません。のiPS（IPS-RPE）に由来するRPEが破損し、RPEを置き換えるために、細胞の可能性のあるソースです。 IPS-RPEはcharacterisを表現TICのRPEタンパク質LRAT、CRALBP、PEDF、及びRPE65;古典高度に着色六角形のRPE形態を表示します。 シスレチナール5,16 -など食作用、レチノイド処理、および11の分泌としてRPE機能を実行する。 IPS-RPEを治療的に使用することができる前に、しかし、IPS-RPEを徹底的に特徴づけされなければならない。 RPE分化を支配する要因を理解することは、臨床用途に使用する細胞の収率および純度を向上させる必要がある。

細胞分化は、高度に調節される遺伝子発現の結果である。転写因子のゲノムとの連携のエピジェネティックな改造は、分化および発生17中に発生する細胞運命決定のために必要とされる。マイクロRNA（miRNAを）によるメッセージRNA（mRNA）の翻訳の調節は、細胞運命1に影響を与える規制のさらに別のレベルを示します。 miRNAは、〜22、NT、によって翻訳を抑制するいずれかのヌクレオチドの長さが不足しているmRNAの3 'UTRに結合するか、分解のためにmRNAをターゲットにしています。 miRNAは、事実上すべての組織で検出されており、現在までに2000以上のユニークな人間のマイクロRNAは、miRBaseデータベースに登録されています。 すなわち 、単一のmRNAは、いくつかの異なるmiRNAによって標的とすることができる。miRNAは、標的mRNAと結合することが部分的にしか相補性を必要とするので、一つのmiRNAは、潜在的に数十あるいは数百の目標、およびその逆に結合することができる。この無差別結合特性を飛躍的に規制の複雑さのレベルだけでなく、個々のmiRNAの機能を決定することの難しさのレベルと役割の細胞機能18〜21の各プレーを向上させます。それにもかかわらず、研究は、miRNAがDNAメチル化状態17に影響を与えることによって分化の間の遺伝子発現を洗練することが示されている。 RPEへのより具体的な研究において、miR-204/211はRPE 22の上皮表現型を促進することが示された。別のグループは、miRNAプロファイルを分析したRPEのES細胞からの分化の間およびmiRNAの別個のセットを明らかにしたが、分化プロセス23の間に発現される。実際、miRNAプロファイルは、明確にES細胞、前駆細胞、および分化細胞24,25を含む細胞タイプを区別することができる。 250以上のmiRNAは、網膜で発現される。これらの研究に基づき、我々は、miRNAがIPからのRPEの分化の際に重要な役割を果たしていると仮定した。

このレポートの目的は、IMR90-4 iPS細胞は、マイクロアレイによる解析のためにRNAを収集し、示差的3種の細胞型間で発現されるmiRNAを同定するためのマイクロアレイデータの解析、iPS細胞からのRPEの分化のためのプロトコルを記述することである、IPS-RPEおよび胎児RPE。総RNAを、各細胞型の培養物から抽出され、1205のヒトmiRNA及び144ウイルスのmiRNAに特異的なプローブを含む、miRNAのマイクロアレイにハイブリダイズさせた。マイクロアレイの結果を比較した示差的に異なる細胞型間で発現されたmiRNAを決定するためにdを。 2倍以上の発現のより大きな倍率変化を有するmiRNAは、さらなる分析のために選択した。 miRNAの解析ソフトが差次的に発現miRNAの潜在的な標的を同定するために、選択したmiRNAによって調節セルラー·ネットワークを生成するために使用された。

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プロトコル

文化試薬および培養プレートの1。準備

  1. mTeSR1メディア：製造業者の指示に従ってmTeSR1メディアを準備します。 4℃で一晩mTeSR1 5Xサプリメントの100ミリリットルを解凍mTeSR1基礎培地の400ミリリットルにmTeSR1 5Xサプリメントの100ミリリットルを加え、よく混ぜる。このメディアは2週間まで、4℃で6ヶ月間、-20℃で安定である。
  2. 分化培地：0.1mMのβ-メルカプトエタノールを得たDMEM/F12中で分化培地を準備し、0.1mMの非必​​須アミノ酸、2.0mMのL-グルタミン、10％ノックアウト血清、および10μg/ mlのゲンタマイシン。
  3. IPS-RPEメディア：1X N1サプリメント、0.1mMの非必​​須アミノ酸、250μg/ mlのタウリン、13 ng / mlのトリヨード-L-チロニンナトリウム塩を得るために、MEMでIPS-RPEのメディアを準備し、20 ng / mlのヒドロコルチゾン、5μgの/ mlのゲンタマイシン、および15％FBS 26。
  4. トリヨード-L-チロニンナトリウム塩原液。ストック溶液を調製しトリヨード-L-チロニン1.0mgのを溶解穏やかに旋回1 N水酸化ナトリウム中のナトリウム塩。次のトリヨード-L-チロニンナトリウム塩の20μg/ mlのの50.0ミリリットルを作るために、ベースのメ​​ディアの49.0ミリリットルを追加。分量を用意し、必要になるまで-20℃で凍結する。最終培養培地中で所望の濃度を達成するために適切な容量を使用する。
  5. ヒドロコルチゾンストック溶液：穏やかな撹拌によって無水エタノール1ml中ヒドロコルチゾン1mgを可溶化し、ヒドロコルチゾンストック溶液を調製した。次の50μg/ mlのの20ミリリットルのヒドロコルチゾンストック溶液のための基本培地の19.0ミリリットルを追加。必要になるまで-20℃で一定分量および凍結。最終培養培地中で所望の濃度を達成するために適切な容量を使用する。
  6. 胎児RPE細胞増殖培地。 FBSを除いて、製造業者の指示に従って、基礎培地にRTEGMキットにすべての試薬を混合することにより、増殖培地を準備します。
  7. 胎児RPEメッキメディア。滅菌容器であり、aに増殖培地に少量を転送することによって、めっき媒体を調製2％の最終濃度までDD FBS。
  8. ディスパーゼ：DMEM/F12中1 mg / mlとディスパーゼのワーキング溶液を調製する。
  9. マトリゲルコーティングされたプレート：0.08 mg / mlのにDMEM/F12中でマトリゲルを準備します。
  10. マトリゲル溶液1.0mlで被覆6ウェルプレートの各ウェル。
  11. 1.0時間室温でコーティングしたプレートをインキュベートする。
  12. 1.0時間インキュベートした後、過剰のDMEM/F12を吸引する。
  13. 乾燥を避けるために、mTeSR1培地の0.5ミリリットルを追加します。マトリゲルでコーティングしたプレートを使用する準備が整いました。

2。のiPS文化

  1. iPS細胞の播種の前にはすべてのチューブ、室温に戻しmTESR1メディア、および準備マトリゲル被覆されたプレートを持っています。
  2. すぐに37℃の水浴中でIMR90-4 iPS細胞を解凍する。次いで水浴からクリオバイアルを除去し、70％エタノールを用いて滅菌する。
  3. 細胞凝集体の破壊を最小限にするために2ミリリットルピペットを用いて15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移す。
  4. 一滴ずつWAの5ミリリットルを追加RM優しくmTeSR1細胞へのメディアとは混ぜる。室温で5分間300×gで細胞を遠心分離し、上澄み液を除去します。
  5. 慎重にmTeSR1培地2mlに細胞集合体を再懸濁し、6ウェルプレートの1ウェルに細胞を播種。
  6. 5％のCO 2、湿度95％で37℃のインキュベーターと文化にプレートを置きます。
  7. 毎日のiPS細胞培養培地を変更します。未分化コロニーは5〜7日播種後に表示されます。通過のため準備ができている未分化コロニー（密中心としたコロニー）をチェックします。

iPS細胞の3。継代

  1. 前の通過に対して先頭にiPS細胞は、全てのチューブは、ディスパーゼ溶液、DMEM/F12とmTERS1メディアを室温に温めており、マトリゲルをコーティングしたプレートを準備。
  2. iPS細胞を継代する前に、エリアをこするとメディアを吸引することにより、分化の任意の部分を削除します。分化が高いために井戸の20％以下に維持する必要があり質の高い文化。慎重に2ミリリットルのDMEM/F12とよくiPS細胞を含むをすすぎ、各ウェルに1 mg / mlのディスパーゼの1ミリリットルを加える。
  3. 7分間37℃でインキュベートする。ディスパーゼを吸引し、ゆっくりと二度DMEM/F12 2mlで細胞コロニーをすすぐ。
  4. すすいだ後、各ウェルにmTSER1の2ミリリットルを追加します。
  5. を5mlピペットを用いて静かに凝集体を形成するプレートのコロニーを掻き取る。
  6. 15ミリリットルコニカルチューブに取り外したコロニーを転送します。細胞の次の通過をシードするに十分なmTeSR1メディアを追加します。

IPS-RPEにiPS細胞の4。分化

  1. mTESR1メディアに新しくコートしたプレート上にiPS細胞をプレート。
  2. iPS細胞コロニーが培養液中で4〜5日間拡大することができます。
  3. 4ミリリットル分化培地に置き換えてmTeSR1メディア。 3日ごとにメディアの半分を変更します。
  4. 色素性病巣を手動文化（40から50日間）の摘出するのに十分な大きさに成長することができます。
  5. 使用200μlのピペットチップの周囲にカットし、着色されたコロニーを持ち上げる。
  6. 15ミリリットルコニカルチューブで解剖コロニーを収集し、プールを提供しています。
  7. 2回5分間300×gでプールされたRPE細胞および遠心分離機にDMEM/F12の5ミリリットルを追加。
  8. 0.25％トリプシンEDTAでプールされたIPS-RPEをインキュベートすることによって単一の細胞溶液を調製する。
  9. IPS-RPEメディアでIPS-RPE細胞をすすぎ、IPS-RPE培地4mlによく新鮮でコーティングされたマトリゲル上で採取した細胞をプレート。
  10. 文化の前に通過に3週間のために細胞。 3日おきにメディアを変更します。実験では、プレートIPS-RPE / cm 2で100,000細胞。 17日目に細胞を回収します。0日として播種の日をカウントします。

5。サンプルの採取

  1. iPS細胞コレクション
    1. 文化iPS細胞の未分化コロニーが中心で密であることが観察されるまで。
    2. DMEM/F12中でコロニーを洗浄します。
    3. accutasを使用して単一細胞に解離 E。 5分間300×gで15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に細胞を回収します。上清を吸引し。 DMEM/F12 2ml中に再懸濁します。
  2. 胎児RPEコレクション
    1. DMEM/F12で胎児RPE細胞の培養物をすすぎ、0.25％トリプシンEDTAを使用して単一細胞に解離する。
    2. 15ミリリットルコニカルチューブ内の細胞を回収します。 5分間300×gで遠心分離する。上清を吸引し。 DMEM/F12 2ml中に再懸濁します。
  3. IPS-RPE細胞コレクション
    1. IPS-RPEを継代3および継代5に到達すると、通過後17日目に細胞を回収。 PBSで2回IPS-RPEをすすぎ、1.0ミリリットル0.25％トリプシンとのインキュベーションにより単一細胞懸濁液を準備します。
    2. の氷冷IPS-RPE培地2mlでトリプシンを中和する。
    3. 5分間300×gで15ミリリットルコニカルチューブ遠心分離で細胞を回収します。上清を吸引し。
    4. マイクロビーズキットの染色緩衝液3ml中の細胞懸濁液を再懸濁する。
ve_title "> 6。未分化細胞を除去するために、IPS-RPEの負の選択

  1. 使用するまで4℃で、すべての試薬を保持しますが、氷の上では動作しません。 5分間300×gでステップ5.3.4からの遠心細胞懸濁​​液。上清を吸引し。
  2. 2×10 6個の細胞あたりマイクロビーズキットの染色緩衝液100μlに再懸濁細胞。
  3. 2×10 6個の細胞あたりの抗TRA-1-60-PE抗体の10μlを加える。
  4. よく混ぜ、10分間、4℃でインキュベートする。
  5. 2×10 6個の細胞あたり1-2 mLのバッファーで細胞を洗浄。 300×gで10分間遠心します。上清を吸引し。
  6. 2×10 6個の細胞あたり染色バッファー80μlの再懸濁細胞。 2×10 6細胞あたり抗PEラベルマイクロビーズを20μl（キットから）を追加します。よく混ぜる。 4℃で15分間インキュベートする。
  7. 2×10 6個の細胞あたり染色緩衝液1〜2 mLを加え。 300×gで10分間遠心します。上清を吸引し。
  8. 500＆＃で細胞を再懸濁956;染色緩衝液のL。
  9. 磁気細胞分離：
    1. 磁気セルソーターで列を配置します。染色緩衝液3mlで列を洗浄します。
    2. カラムに6.8から細胞懸濁液を適用します。
    3. TRA-1-60陰性細胞を収集するために、負のポートにチューブを配置します。

7。全RNA抽出

  1. 溶解核酸ミニプレップ用に設計された市販のマイクロ遠心ホモジナイザーミニスピンカラムを通してサンプルを実行することにより、細胞。
  2. iPS細胞、IPS-RPE、小さなRNA分子27を維持するように設計された市販のRNA抽出キットを用いて、胎児RPEから全RNAを抽出します。
  3. ナノドロップ分光光度計を用いて、全RNA濃度を決定します。

8。バイオアナライザおよびマイクロアレイアッセイ

  1. 市販のRNA品質のキットと一緒にバイオアナライザでRNAの完全性を確認してください。
  2. 100ngのインキュベート30分間37℃でのウシ腸ホスファターゼトータルRNA
  3. 5分間、100℃で100％DMSOを用いてRNAを変性させる。
  4. PCP-Cy3では、1時間16℃でインキュベートすることにより、T4リガーゼを使用してサンプルにラベルを付けます。
  5. 8_x_15Kフォーマット人間miRNAアレイにハイブリダイズする。
  6. 製造業者の説明書に従ってアレイを洗浄し、スキャナを用いて5μmの解像度でスキャンする。
  7. miRNAのマイクロアレイと互換性のあるマイクロアレイの特徴抽出ソフトウエアを用いてデータを取得する。
  8. 各試料における発現の相対レベルを決定するために、miRNAの信号を処理する。
  9. サンプル群間の各miRNAの発現レベルを比較する。さらなる分析のために少なくとも2倍の差次的発現を有するmiRNAを選択する。
  10. データ解析のための市販のソフトウェアを使用して、示差的に発現されたmiRNA 28の可視化のヒートマップを生成するために、指示に従ってください。

9。経路解析

  1. Excel形式で8.9で選択されたmiRNAからのデータを保存します。
  2. オンラインRNA経路解析プログラムにログインします。 Excelファイルをアップロードします。ファイル形式のための「柔軟なフォーマット」を選択し、識別子の型のためのドロップダウンリストから「アジレント」を選択します。
  3. 生データの見出しの下に、ID列を調べるために、「ID」を割り当て、「観察1」を割り当て、ログ配給の列に "比を記録」。他のすべての列は、「無視」を選択してください。
  4. 以下のように分析するためのパラメータを選択します。信頼：実験的にのみ認められ;直接的および間接的な関係があります。および内因性化学物質を含む;リファレンスセットとして工夫ナレッジベースを選択します。すべての種からのデータを、すべての細胞株や組織、およびすべての変異を含む参照分子のデータベースを選択します。
  5. ファイル名を指定して実行]ネットワークおよび経路は分析しています。

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結果

iPS細胞（ 図1A）は 、RPEのiPS細胞への分化を誘導する分化条 ​​件下で増殖させた。 IPS-RPEは、胎児RPE（ 図1C）と同様の六角形色素性細胞の形態（ 図1B）の古典的なRPE表現型を示した。

良好なmiRNAがのiPSからのiPS-RPEへの分化過程において役割を果たし得ることを理解することは、miRNA発現のマイクロアレイ解析を行った。総RNAを、iPS細胞、胎児RPE、および低分子RNAの最大保持を確実にするためのmirVana miRNA単離キットを用いたiPS-RPEから回収した。 RNAは、マイクロアレイへのハイブリダイゼーション前に、ラボチップ定量し、純度について試験した。 1205ヒトおよびウイルスの144のmiRNAを表すプローブは、各サンプルセットからのmiRNA発現を分析した。信号は、各サンプルからの各miRNAの発現の相対レベルを決定するために分析した。データは、miRNAのeを比較した IPSと胎児RPEへのIPS-RPEの...

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ディスカッション

結論として、この報告書は、文化iPS細胞、IPS-RPE、胎児RPEするために使用される方法を説明します。 IPからの派生のRPEは、形態学的および機能的に胎児RPEに似ています。 IPS-RPEはまた、RPE65、CRALBP、PEDF、及びLRAT 16を含む特徴的なRPE遺伝子を発現する。さらに、これらの細胞を特徴付けるために、RNAを抽出し、示差的に発現するmiRNAを同定するためにマイクロアレイ解析を実行するために使用した。信号強度の解析は、示差的に発現miRNAの最大数は、IPS-RPEをより成熟したかもしれ示唆IPS-RPEの比較対胎児RPEで検出されたことを明らかにした。今後の研究では、RT-PCRで、これらの結果を検証するために計画されています。

慎重に正確なデータの分析や買収の成功を確実にするために実行する必要があり、この実験中のいくつかの重要なポイントがあります。最初の重要なステップは、iPS細胞の培養中に起こる。 iPS細胞は、PLUに残す必要自分の幹細胞性を維持するために、状態をripotent。細胞を慎重に分化の兆候を毎日検査しなけ...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

ここに記載されている意見やアサーションは、著者の個人ビューであり、公式または陸軍省や国防総省の見解を反映するものとして解釈されるべきではない。

著者ホイットニーA.グリーン、アルベルト·ムニーズ、とラメシュR. KainiがUSAISRで米国学術研究会議ポスドク研究Associateshipを開催しながら、本研究を実施した。

マイクロアレイアッセイは、UTの健康科学センターサンアントニオでGreehey小児がん研究所マイクロアレイ基盤施設およびバイオインフォマティクス部門によって行われた。

この作品は、米軍の臨床リハビリテーション医学研究プログラム（CRMRP）と軍事運用医学研究プログラム（MOMRP）によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
mTeSR1 培地 + 5X サプリメント幹細胞技術5850
DMEM/F12ライフテクノロジーズ 11330-032
2-&β;-メルカプトエタノールシグマM-7154
非必須アミノ酸ハイクロン(フィッシャー)SH30853.01
ノックアウト血清補充ライフテクノロジーズ 10828-028
ゲンタマイシン ライフテクノロジーズ 15750-060
MEMメディアライフテクノロジーズ 10370-021
N1サプリメントシグマN-6530-5ML
タウリンシグマT-8691-25G
ヒドロコルチゾンシグマH0888-1G
ウシ胎児血清ハイクロン(フィッシャー)SH3008803HI
Triiodo-l-thyronine ナトリウム塩ΣT6397
水酸化ナトリウムΣS5881
胎児RPE培地 RTEGMキットLife Technologies195406
DispaseLife Technologies17105-041
MatrigelBD Biosciences354277
Phosphate buffered salineHyclone(Fisher)10010-023
トリプシンHyclone(フィッシャー)25200-072
Miltenyi Biotec 洗浄バッファーStemGent130-092-987
Miltenyi Biotec リンスバッファーStemGent130-092-222
アンチ TRA-1-60 マイクロビーズキットStemGent130-095-816
Miltenyi Biotec セルソーターカラムStemGent130-021-101
RNeasyマイクロキットQiagen74004
QIAシュレッダーQiagen79654
RNA 6000 Pico LabChipキットAgilentG2938-90046
Human miRNA microarray v16AgilentG4471A

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