ゼブラフィッシュの幼虫の複数の困難な標的組織をトランスフェクションするために心室インジェクションを用いた遺伝子モルホリノアプローチを逆転

サマリー

そのような遺伝子特異モルホリノの脳室内注射を用いた組織再生などの開発および生理学的恒常性の後期段階の間に遺伝子機能を評価するためのゼブラフィッシュに適応逆遺伝学的方法。

要約

ゼブラフィッシュは、細胞や臓器や付属物再生の分子生物学を理解するための重要なモデルである。しかしながら、逆遺伝学を採用する分子戦略はまだ十分にゼブラフィッシュ胚形成後の幼虫の段階の間に再生または組織の恒常性における遺伝子機能を評価するために開発されておらず、ゼブラフィッシュの幼生内のいくつかの組織が標的とすることは困難である。遺伝子特異的モルフォリノの脳室内注射は、ゲノムこれらの段階で、時間的に制御された方法でゼブラフィッシュの遺伝子を標的とする現在の無力のための別の方法を提供します。この方法は、以前はこのような幼虫尾鰭、多くの場合、非侵襲的に組織再生を研究するために使用される構造のものと到達することは不可能だった構造を含む全身の様々な組織、に完全に分散し、モルホリノのその後の取り込みが可能になります。幼虫finfold再生中に活性化されるいくつかの遺伝子も、プレゼンしている大人の脊椎動物の組織を再生中のTは、その幼虫は成人で再生を理解するための有用なモデルである。このモルホリノ分散法は、幼虫組織の再生だけでなく、胚発生後の組織恒常性を調節する他の生理現象に必要な遺伝子の迅速かつ容易な同定を可能にする。したがって、この配送方法は胚発生の後、遺伝子機能の評価に時間的制御のために現在必要な戦略を提供しています。

概要

臓器や付属の再生は、生存と健康のために根本的に重要である。しかし、ヒトを含むいくつかの脊椎動物は、再生能力が限られている。いくつかの動物モデルは大規模な再生能力を持っている存在するが、臓器及び付属器再生中に遺伝子機能を評価するために、遺伝子技術を逆に非常に限られたまたは存在しないままである。したがって、新たなアプローチがこれらのモデル生物において再生の分子生物学を分析する必要がある。

ゼブラフィッシュは、いくつかのトランスジェニックフィッシュ系統が細胞を追跡するために存在しているため、セルと、その重要な複数の臓器、組織、および付属の再生する能力だけでなく、だけでなく、臓器及び付属器の再生^1、の分子生物学を理解するための十分に確立されたモデルであり、遺伝子構築物^2、3を過剰発現する。しかし、幼虫ゼブラフィッシュにおける遺伝子阻害は主にoverexpreに制限されていますその導入遺伝子産物の遺伝子の内因性活性を反映していない機能獲得効果を得ることができ、すべての関心のある遺伝子または使用できませんドミナントネガティブ構築物のssion。したがって、具体的ノックアウトまたはノックダウンすることにより遺伝子発現を除去するための代替方法は、これらの問題を克服するために必要とされる。

遺伝子特異的TALENSを用いて標的遺伝子機能をノックアウトするための逆遺伝学的手段として存在する;遺伝子の最初の要件は、胚発生のさらなる進行を防ぐため、しかしながら、このノックアウト戦略は、非常に頻繁に初期の胚発生の間の機能的評価に限定されるものである。したがって、そのようなTALENSを使用して、現像後の再生または臓器の恒常性として、後の現象を研究することは^5,4を妨げている。したがって、代替の遺伝子除去戦略は、完全に形成され器官および構造遺伝子の要件を評価するために開発初期に遺伝子機能を標的とすることが必要である。

モルホリノ注射は、いくつかの成体器官において遺伝子を標的と大人のフィン^6-8の再生に有効であることが示されているが、これらの方法は、エレクトロポレーションを必要とし、多くの内臓が、それらの場所またはによる電気に対する感受性のいずれかに電気穿孔することが困難である混乱。直接注入​​は、それらの構造的完全性を破壊する可能性があるため、又はそれらの大きさが制限されているのでさらに、幼虫の一部の組織は、直接注入することが困難である。 finfoldへの直接注入ができないため、幼虫の尾鰭は、そのような構造です。従って、エレクトロポレーションおよび直接注入する代わりどちらかを注入するには小さすぎる、またはエレクトロポレーションすることができない組織における遺伝子を標的化するために必要であった。

幼虫の尾びれの再生中に特定の遺伝子の機能を標的とし、阻害するために、我々は既存の許可モルホリノ技術を修正したA後期段階の幼虫での尾びれ再生中の遺伝子機能のssessment。この方法は、一緒に遠藤·ポータートランスフェクション試薬¹⁰とフルオレセインタグ付きモルフォリノの脳室内配達^9を採用^しています。一度心室内、モルホリノ - エンド - ポーター混合物を速やかに血管系を経由して幼虫全体に広がり、ターゲットに、以前には不可能だった組織に入る。この注入方法は、特定の組織中の遺伝子を標的とするように修飾することができ、恐らく、現在、遺伝子機能を阻害するために逆遺伝学的方法を欠いている他の動物モデルに適用することができる。このように、すぐに幼虫の段階で一般的な臓器の恒常性と再生の間に遺伝子機能を研究するため、広範な用途の可能性を迅速かつ簡単な方法を提供しています。

プロトコル

1。ガラス針の作製（図1）

1. 注射針（ 図1A）を調製するために直径0.75mmのガラスキャピラリーを使用する。
2. ニードルプラーにガラスキャピラリーを置き、次のパラメータを指定して針を引く：加熱サイクル値：463;サイクル値を引っ張っ：230;速度：150ミリ秒;時間：150ミリ秒（ 図1B）。
3. マイクロメータ接眼レンズでステレオスコープの下に直径20μmの針を生産する時計メーカーピンセットで引っ張らガラスキャピラリーを破る。
4. 針をシャープにし、20μmのベベル（ 図1Cおよび1D）を生成するために湿ったゴム製の糸車で旋盤を使用してください。注：シャープ、面取りされた針は、心室への挿入の容易さを改善し、したがって、組織への損傷を最小限にし、有孔筋肉針（ 図1E-G）を除去した後に再シールすることを可能にする。

2。た準備モルホリノソリューションのATION

1. 7.5mmの最終濃度に1Xリン酸緩衝食塩水（PBS）中で凍結乾燥されたモルホリノを溶解することによってモルホリノの在庫を準備します。 [詳細については、メーカーの説明書（材料表）を参照してください]。
2. の3.5mmモルホリノおよび0.5 mMの遠藤ポーターの最終濃度は2.8μL遠藤ポーター原液（1 mM）を（材料表を参照）2.5μlのホリノストック溶液（7.5 mm）を混合することにより、モルホリノ注射液を準備します。

3。モルホリノ注射の調製（図2）

1. 10μLmicroloaderピペットチップをマイクロピペットを用いて、この溶液5μlと面取りガラス針をロードします。
2. 空気圧ピコポンプ（ 図2A-C）に接続されているマイクロマニピュレータの針ホルダーにガラス針を挿入します。
3. 針のみが必要となるよう顕微鏡の隣に針ホルダを配置幼虫（ 図2A）の心室に挿入する1つの平面方向に移動させることができる。
4. 約45℃で注射の角度を調整します。
5. 保持圧力：次のようにマイクロインジェクター値を設定平方インチあたり20ポンド（PSI）を;吐出圧：15 PSI;ゲーティング、1.9の周期値（10.9ミリ秒に相当）の100ミリ秒の範囲。
6. 1.5％（w / v）のゲルを20mlを生成するために、標準的なマイクロ波を用いて1×PBS中でアガロース融解する。 10センチメートルペトリ皿に融解したゲルを注ぐ。一度硬化、アガロースが鎮静幼虫が^11（ 図2D及び2E）に配置されている畝を有するように、暖かいアガロースに溝付きの注射フォームを配置します。

4。注射（図3）

1. 彼らは触れないように応答を停止するまで、20 mg / Lのトリカイン（1 - エチルM-アミノ安息香酸エチルメタンスルホネート）で水槽の水100mlに幼虫を麻酔。
2. プラスチックパスツールpipettを使用腹側の溝（ 図3A）の垂直アガロース壁に直面しているように、慎重に、ウェットアガロース金型の溝に鎮静幼虫を転送するE。
3. 心室が離れて注射針（ 図3A）から向くように実体顕微鏡下でアガロースプレートを置きます。
4. 心臓の心室に挿入し、針を下げます。わずか1〜2ミクロン深く針（ 図3Bおよび3C）を挿入しないように注意しながら心室に針を挿入します。
5. 針が挿入されると、心臓（ 図3Dと3E）のクリアを可能にするために間隔を待っていると、4〜6パルス、溶液の各提供3 NLと心室にホリノソリューションを注入する。
6. 注射後、針（挿入の平面に平行）を削除してから、慎重に、E3媒体BACで満たされたプラスチック製パスツールピペットを用いて幼虫を転送新鮮E3培地を含むペトリ皿にkである。
7. 注入された幼虫を転送する際に、針の乾燥を防ぐために、1X PBSを含むペトリ皿に針を入れます。
8. 繰り返して実験期間中4.1から4.6毎に12から24時間を繰り返します。注：注射を繰り返すこと、細胞内のモルホリノの取り込みと維持を確実にします。

5。注射の分析（図4）

1. 彼らは触れないように応答を停止するまで、20 mg / Lのトリカインで水槽の水100mlに魚を麻酔。
2. 平坦なウェット1.5％横方向に幼虫を置きE3培地で覆われ（w / v）アガロースプレート。
3. 明視野および蛍光イメージングと実体顕微鏡を用いた画像の幼虫。注意：幼虫が透明であるため、フルオレセインタグ付きモルホリノ直接注射した後、動物を通して血管内に蛍光グリーンなどの表示されるはずです。この蛍光は、さらにによって血管組織に分散する15分（ 図4A〜4C）。

回生伸長の6。​​評価

1. フィジー画像Jフリーソフトウェア（http://fiji.sc/Fiji）を使用して撮影した画像を評価する。再生を調査するための、制御、およびモルホリノを注射幼虫で発生した回生成長の量を決定するために、ライントレースツールを使用します。
2. メインフィジーウィンドウにファイルをドラッグ＆ドロップで画像、フィジーで元の画像ファイルのオープン1をキャリブレーションする。
3. 以下のすべての画像の縮尺を設定するには、メインメニューの「分析」に進みます。
4. 「設定スケール」メニューをクリックしてドロップダウン。
5. このウィンドウでは、チェックボックスをクリックして「グローバル」オプションをオンにします。
6. 今（ステップ6.1を参照）ドラッグ＆ドロップで再び再生成長量を測定するために画像を開く。
7. ツールバーの「フリーハンドの選択」ツールを選択します。
8. 測定部位（FIを取り囲むgures 4J-4L）。
9. Ctrlキーを押しながら+ Mこれは、正方形ピクセルで囲まれた領域の値を示す新たな「結果」ウィンドウが開きます。

結果

背側（ 図3A）に近づいたときに鋭く、ベベル注射針を簡単にゼブラフィッシュ幼生の心臓の心室に配置されます。心臓がポンピング続け、血流が針（ 図3Bおよび3C）の存在にもかかわらず維持される。慎重な注射は心臓（ 図3E）へのモルホリノの注入にもかかわらず、心室や心臓の収縮（ 図3D）の形態を妨げることはありません。

数分以内に、モルホリノ-エンド-ポーター溶液は、脈管構造（ 図4Aおよび図4B）を介して体全体に分配する。蛍光（ 図4C）から見たモルホリノは、その後、少なくとも12時間以上finfoldや脳などの様々な組織への血管系から配布されています。

この手法では、目の遠位先端部を除去するEのfinfold、脊髄、遠位体幹筋、遠位脊索と色素細胞（

ディスカッション

脳室内注射は、胚発生の間の遺伝子機能に影響を与えることなく、現像または身体の恒常性の後期段階での遺伝子機能を試験するための迅速かつ信頼性のある評価方法を提供する。この技術の成功を確実にするためには、4つの重要な点に注意する必要があります。針のうち1）針のサイズ、2）乾燥、3）音量を最小にし、鎮静溶液中の4）最小限の露光時間。大きすぎる針が心室に損傷を与え、過度の出血の原因になりますしながら、小さすぎる針は、頻繁に詰まります。 20程度が推奨されている間、針は心室以上の五分の一のサイズであってはなりません。第2の臨界点は、乾燥して目詰まり針を維持することです。針のサイズが小さく、必然的な、頻繁に一時停止落ち着いた、転送や位置に幼虫が針先端のモルホリノが乾燥し、針を詰まらせることを可能にする十分な時間を提供することができます。防ぐためにこれは、一方は1×PBSのペトリ皿に針を浸すことができる。第三の重要な点は、ボリュームが高すぎることで心室の肥大化を最小限に抑えることである。投与量は、針のサイズによって制限される場合、注射の回数を増加させることは常に体積を増加することが好ましい：より大きな体積は、心臓へのストレッチ損傷を引き起こす可能性があ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
モルフォリノと3´フルオレセインタグ	Gene Tools Inc.	カスタマイズ	詳細情報 www.gene-tools.com
Endo-Porter	Gene Tools Inc.		www.gene-tools.com
Agarose	Serva	120623	注射中に魚を置くためのプレートを注ぐため
トリカイン (L-エチル-m-アミノベンゼート-メタンスルホン酸)	Applichem		麻酔
用 E3 中 (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4)			幼虫の飼育用
シャーレ	Sarstedt	821.472	注射中に魚を配置し、
薄肉ガラス毛細血管	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-3	注射針の準備用
マイクロローダーピペットチップ	エッペンドルフ	5,242,956,003	針の装填用
パスツールピペット (3 ml/1 ml)	ブランド	747760/ 74775	幼虫の移送用
フレーミング/ブラウン ニードルプーラー	サッター		詳細については、
www.sutter.com Watchmaker (Dumont) ピンセット (サイズ 5)	ワールドプレシジョンインスツルメンツ株式会社	501985	研ぐ前に針をブレーキをかけるには
解剖顕微鏡	オリンパス、ライカ、ツァイス	メーカーによって異なります	全体の注入セットアップの一部
蛍光カメラ	オリンパス、ライカ、ツァイス	メーカーによって異なります	後の蛍光を画像化するには
PicoNozzleキット(マイクロインジェクターホルダー)	ワールドプレシジョンスインスツルメンツ	5430-12	用マイクロインジェクション
ニューマチックPicoPump(マイクロインジェクター)	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ	SYS-PV820	マイクロインジェクション用