用アメロゲニン - キトサンハイドロゲルの開発<em&gt;体外</em高密度インターフェイス付き&gt;エナメル再成長

サマリー

この記事では、我々は表面的なエナメル質の再構築のためのアメロゲニン-キトサンハイドロゲルを製造するためのプロトコルを記述します。ヒドロゲル中のアパタイト結晶のその場での増殖に編成は、修復物の有効性及び耐久性を向上させる緻密なエナメル復元インタフェースを形成した。

要約

生体模倣エナメル質再建は、虫歯や侵食の治療のための新しいアプローチとして、材料科学と歯科における重要なトピックです。アメロゲニンは、アパタイト結晶の組織的な成長を制御するための重要なタンパク質であることが証明されています。この論文では、新規のアメロゲニン-キトサンハイドロゲルを使用した表在性エナメル質再建の詳細なプロトコルを紹介します。局所フッ化物やうがい薬などの他の従来の治療法と比較して、この方法は虫歯の発症を防ぐ可能性があるだけでなく、重要で耐久性のあるエナメル質の修復を促進します。アメロゲニン集合体によって制御される組織化されたエナメル質様微細構造は、エッチングされたエナメル質の機械的特性を大幅に改善することができ、一方、アパタイト結晶のin situ再成長によって形成される緻密なエナメル質-修復界面は、修復物の有効性と耐久性を向上させることができる。さらに、キトサンハイドロゲルは使いやすく、虫歯の発生の主要な危険因子である細菌感染を抑制することができます。したがって、この生体適合性および生分解性のアメロゲニン-キトサンハイドロゲルは、欠陥のあるエナメル質の予防、修復、および治療のための生体材料として有望です。

概要

歯科用エナメル質は、人間の歯の硬い鉱物化した表面です。これは、多数の針状のアパタイト結晶で構成されており、エナメル質が提供する独自の機械的強度と生物学的保護を確保するために、整然とした平行プリズムに束ねられています^1-2。骨や象牙質などの他の石灰化組織とは異なり、成熟したエナメル質は無細胞性であり、虫歯や侵食としてよく発生する大量のミネラル損失^1-2の後には自己再生できません。フッ化物含有ワニス、歯磨き粉、うがい薬などの市販の製品は、エナメル質の再石灰化に効果的ですが、それらのいずれも組織化されたアパタイト結晶の形成を促進する可能性はありません。臨床的には、エナメル質修復のための従来の治療法は、アマルガム、セラミックス、または^{複合樹脂3}などの人工材料による充填手順を含む。しかし、これらの材料は、その構造、成分、特性が天然のエナメル質とは異なるため、通常、病変を囲む天然組織とうまくインターフェースしません。その結果、二次虫歯は、歯と異物との間の界面で時間の経過とともに頻繁に発生します。したがって、緻密な界面を持つエナメル質のin situ再成長は、材料科学および口腔病学の分野にとって魅力的なターゲットです。この目的を達成するための特に有望な方法の1つは、エナメル質表面にエナメル質のような材料を生体模倣合成することです。最近、ナノアパタイトまたは異なる有機添加剤^4-12を含む生体模倣システムを使用して、エナメル質様材料を調製するための多数のin vitroの試みがなされている。しかし、再石灰化結晶を促進して完全な緻密な界面を達成するための最適なバイオミメティック戦略を開発することは、依然として課題です。

エナメル質の鉱化中、アパタイト結晶の配向性成長と伸長は、アメロゲニンに富むマトリックス^1,13-14によって調節されます。エナメル質の開発における有機マトリックスを模倣するために、ここでは、びらん性病変のモデルとして使用される酸エッチングされたエナメル質表面上でin situエナメル質再成長のためのアメロゲニン-キトサン(CS-AMEL)ヒドロゲルを製造するための詳細なプロトコルについて説明します。結晶¹⁵の「最も汎用性の高い成長培地」として、ハイドロゲルマトリックスは、臨床的に取り扱いが容易であるため、溶液システムよりも優れています。さらに、CS-AMELは生体適合性、生分解性、および歯科用途向けの他の生体模倣システムと遜色ない独自の抗菌および接着特性を備えています¹⁶。重要なことに、エナメル質表面のアパタイト結晶のin situ鉱化作用は、修復された層と天然エナメル質との間に緻密な界面を提供し、修復物の耐久性を向上させ、修復物の縁に新たな虫歯が形成されるのを防ぐことができる可能性があることです。

プロトコル

人間の臼歯は、南カリフォルニア大学の歯学部のオストロー学校での抽出のための標準的な手順に従って抽出し、施設内倫理委員会の承認を得て取り扱った。

1。酸エッチング歯の作製スライス

1. 任意の復元された虫歯なしで、人間の第三大臼歯を選択します。
2. 臼歯の根元部分を削除し、縦方向に太い水冷式​​低速ダイヤモンドソーを用いてスライス2ミリメートルに臼歯の冠をカット。超音波で2分間、これらのスライスをきれいにした後、脱イオン水で3回、それらをすすぐ。
3. びらん性病変をシミュレートするために、直ちに脱イオン水ですすぎ、その後、それらを30秒間、30％リン酸で歯スライスをエッチングする。
4. 超音波で2分間エッチングしたスライスをきれいにした後、脱イオン水で3回、それらをすすぐ。

アメロゲニン - キトサンハイドロゲルの2。準備

1. Preparatioキトサン原液のN
   1. 1％を溶解し、80℃CO / Nで攪拌し、続いて1％（v / v）酢酸溶液（w / v）のキトサン（中間分子量、75〜85％脱アセチル化）
   2. RTに冷却後、溶液を、0.45μmのフィルターを用いてキトサン溶液を濾過する。 1 M NaOH溶液を添加することにより5.0にpH値を調整する。
2. カルシウム及びリン酸のストック溶液（0.1 M）の調製
   1. 塩化カルシウム（CaCl ₂で） _を秤量し、0.1 M溶液を調製し、次いで、溶液が透明になるまでボルテックスを用いて混合する。 1 M NaOH溶液を加えることにより11にpH値を調整する。
   2. 第二リン酸ナトリウムせ（Na ₂ HPO _4）を秤量し、0.1 M溶液を調製し、次いで、溶液が透明になるまでボルテックスを用いて混合する。
3. 組換えアメロゲニン^17〜18の発現および精製
   ここで使用される組換え完全長ブタアメロジェニン（rP172）は、172アミノ酸を有し、完全にアナログである長天然ブタP173が、N末端 ​​メチオニンなどSer16 ¹⁸上のリン酸基を欠いている。
   1. 500mlの溶原性ブロス（LB）寒天の粉末20gを追加し、脱イオン水、20分間121°C（液体設定）で溶液をオートクレーブ。 〜55°Cは、寒天液にアンピシリン（100μg/ mlの）を追加する寒天クールをしてみましょう。
   2. 寒天の結露を避けるためにフリップして、それが固体になるまで、各プレートが冷めて、ペトリ皿に寒天ソリューションを転送します。 4℃で、ビニール袋に入れて保管してプレート
   3. グリセロールストックからの組換え細胞（ 大腸菌 -BC21）でストリークLB寒天プレート（-80℃）。 37℃でプレートO / Nインキュベート
   4. NZCYM培地を50mlを調製し、30分間121℃でオートクレーブ媒体。メディアがクールダウンするには、50ミリリットルのメディアに100μg/ mlのアンピシリンの50μlを加える。
   5. ampicillを補充し、50mlのNZCYM培地にLB寒天プレートからの単一コロニーを接種インチ、37℃で振とう培養器内の細胞のO / Nインキュベート
   6. NZCYMメディアを1リットル調製し、30分間121℃でメディアをオートクレーブ。千ミリリットルメディアに100 mg / mlのアンピシリンの1ミリリットルを追加します。 UV-可視分光光度計を用いてブランクとして光学密度（OD）読み取り値を取る。注：最初にリードした後は捨てないでください。
   7. ステップ2.3.6から千ミリリットルメディアにステップ2.3.5からの細胞培養の10ミリリットルを接種する。すぐに接種後595nmでの光学密度を読んでください。成長を追跡するために、定期的に光学濃度の読みを取る。注：外径が取られるたびに空白をお読みください。
   8. 細菌の増殖は、595nmで約0.75〜0.8 ODまで到達したときにイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG、1 M）の700μlで誘導する。
   9. ODが1.1に達したときに細胞を採取する。 6プラスチックボトルにフラスコの内容物を注ぐ。バランスをとり、遠心分離器を使用する前に、ボトルの重量を量る。 4℃で8554×gで20分間遠心-20°CO / Nで細胞ペレットを保つ
   10. 細胞ペレットを取り出し、50mlチューブでそれらを結合します。発酵の1Lあたり4MグアニジンHClの3.5ミリリットルを追加します。 1分間隔で超音波処理し、氷上に2〜3回、30秒ごとに、。
   11. 0.5％ギ酸で細胞容積の6倍希釈液を作り、それが2時間低温室で炒めてみましょう。 4℃で30分、8554×gで遠心上清を保管してください。飽和の原液を用いて20％飽和硫酸アンモニウムを加え、低温室、O / Nでかき混ぜる
   12. 4℃で30分間、8554×gで遠心し、ペレットを保持します。 C4カラム（10×250ミリメートル、5ミクロン）上に0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）、負荷のペレットを再構成し、そしてにおいて、TFAでA = 0.1％TFAおよびB = 60％アセトニトリルの直線勾配を用いて分画し1.5ミリリットル·分^-1の流速。
   13. ドライアイス上で蛋白質溶液を凍結し、凍結したサンプルのO / Nを凍結乾燥
4. アメロゲニン - キトサンの調製（CS-AMEL）hydrogEL（ 図1A）
   1. 200 rp172μgの1％キトサン溶液を960μLを含むチューブに追加し、溶液が透明になるまでボルテックスを用いて混合します。
   2. アメロゲニン含有キトサン溶液に、0.1MのNa ₂ HPO ₄溶液を15μlに続く、0.1MのCaCl ₂溶液25μlを追加し、5分間ボルテックスを用いて混合します。
   3. 慎重に1 M NaOH溶液を添加することによって6.5にCS-AMEL溶液のpHを調整する。 pH値が6.5に達したときにCS-AMELヒドロゲルが形成される。

アメロゲニン·キトサンヒドロゲル中の3。エナメル再成長

1. 人工唾液溶液の調製
   1. 特定の塩化マグネシウム（MgCl _2を 、0.2 mM）の量は、塩化カルシウム（CaCl _2、1mM）を、リン酸二水素カリウム（KH ₂ PO _4、4ミリモル）、塩化カリウム（KCl、16 mM）および塩化アンモニウム（溶解20のHEPES中のNH ₄ Clで、4.5 mM）を（4 - （2 -ヒドロキシエチル）ピペラジン-1 -エタンスルホン酸）緩衝液^12。
   2. 1MのNaOHでpHを7.0に調整し、4℃で、人工唾液ソリューションを保存する
   3. ソリューションを使用する前に、フッ化ナトリウム（NaFを、300 ppm）を追加します。
2. CS-AMELハイドロゲルの応用
   1. 注射器（ 図1B）を用いてエッチング歯のスライスに約20μlのCS-AMELハイドロゲルを適用します。
   2. 室温で2時間デシケーター中でハイドロゲルで覆わ​​れた歯のスライスを乾燥させます。
   3. 人工唾液溶液30mlを入れたビーカーに歯のスライスを転送します。アルミニウム箔でビーカーを覆い、その後、7日間37℃のオーブン中にビーカーを保つ。
   4. 歯のスライスを削除して、室温でデシケーター中で乾燥させます。

新成長層とエナメルとの間のインタフェースの4。キャラ

新しく成長した層とエナメルの界面の微細構造はobserた電子顕微鏡（SEM）及び高回転透過型電子顕微鏡（HR-TEM）を走査することによってVED。 TEM試料は、集束イオンビーム（FIB）技術、次の通りであるれる手順を用いて調製した。

1. FIB-SEM装置にサンプルをロードし、取扱説明書に従ってすべての整列を終える。 NOTE：微調整Zは、少なくとも2回実施されるべきである。
2. 基本的な構造（ 図2A）を保護するために試料上にカーボン層（15×3程度）を蒸 ​​着した。
3. ミルは、炭素層の上部、下部、右両側に注意深く試料は、試料の薄片を作製し、この薄片の底部側をカットする。注：各粉砕工程（ 図2B）の前にイオンビームの位置合わせを確認してください。
4. 溶接白金薄片上のチップと試験片（ 図3C）を分離するために左側を切った。注：溶接工程の前にイオンビームの位置合わせを確認してください。
5. Tを持ち上げ彼は徐々にサンプルとヒントリフトアウトTEMグリッド上にラメラサンプルをマウントPT。
6. その厚さが100nm（ 図3D）未満になるまで、サンプルから先端を切り離し、薄いサンプル。 TEM観察を行うために、機器からサンプルを取り出します。注：各間引き処理の前にイオンビームの位置合わせを確認してください。

5。新成長層の結合および機械的特性の評価を

1. 結合強度は、超音波処理することにより評価される。 10分間の超音波洗浄機（42 kHzの、100 W）で修復歯のスライスを維持した後、後方散乱電子SEM分析と修復さ層と天然エナメル質との間のインタフェースを観察します。
2. ベルコビッチチップを有するナノインデンターにより各補修エナメル質表面上に20のテストポイントでの硬度及び弾性率を測定した（n = 3）。

6。免疫蛍光染色

1. トリスbuffeと歯のスライスを洗う15分間のr個の生理食塩水（TBS）。
2. 15分間、TBS中の1％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックする。
3. 液体を除去し、TBS（0.1％のBSA、0.3％トリトンX-100）で希釈した1°抗体（1:500ニワトリ抗アメロゲニン）とサンプルのO / Nインキュベートする。
4. 30分間TBSでサンプルを洗浄し、TBSで希釈した2°抗体（1:100抗ニワトリFITC）でO / Nインキュベートする。
5. 30分間TBSでサンプルを洗浄し、さらに30分間乾燥さのままにしておきます。
6. 蛍光顕微鏡で観察します。

結果

ここに記載されたプロトコルの有効性は、電子顕微鏡（SEM）、選択領域の電子回折（SAED）及びX線回折（XRD）分析を走査することによって実証される。 7日間アメロゲニン - キトサン（CS-AMEL）ハイドロゲルによる修理の後、厚さ15μmのエナメル調層がエッチングされたエナメル質表面に形成された。新たに成長した層は、表面に垂直なc軸（ 図3Aの矢印）に沿って優先的に成長し、〜50nmの直径を有する結晶の高度に秩序化されたアレイを用いた。また、これらの針状結晶は、天然エナメル（ 図3B）の基本単位と類似しているバンドルに編成されたことは注目に値する。修復層のSAED結果は[002]方向（ 図3C）に沿って、新たに成長した結晶の階層的配置を明らかに円弧状のパターンを示した。 XRD分析は、新たに成長した層がアパタイトで構成されていることが確認されSEM観察及びSEAD（ 図3D）に応じて、結晶c軸に沿って整列した結晶。

図4に、<...

ディスカッション

エナメル質のミネラル含有量が高く、それを人間の体内で最も困難なミネラル化した組織を作っている間に、このバイオセラミックは、多くの場合、虫歯やエロージョンとして生じる脱塩プロセスの影響を受けやすい。遺伝子突然変異はまた、 エナメル質形成不全症²⁰と呼ばれるエナメル奇形の遺伝性疾患の一連につながる細いまたはソフトエナメルを引き起こす可能性があります。フッ化物又はCPP-ACPを含有する口腔ヘルスケア製品は、初期エナメル質の病変の再石灰化を促進するために（ すなわち 、ワニス、練り歯磨き及び洗口液）数年前から市販されている。しかしながら、これらの市販品は、いずれも組織化アパタイト結晶の形成を促進する可能性を有していない。深いエナメル空洞のための従来の治療は、アマルガム、セラミックまたは複合樹脂などの人工材料との機械掘削とその後の充填を伴う。このようなアプローチは、初期病変と例のための理想的でない場合に、大きなAR浸食のEASは、エナメル質で発生します。健全なエナメル質の不均衡な量が歯にダメージをもたらす取り除かなければならないためです。一時的な「修理」のアマルガムおよびコンポジットレジ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ヒト第三大臼歯	南カリフォルニア大学オストロウ歯学部	N/A	ヒトの臼歯は、南カリフォルニア大学のオストロウ歯学部で標準的な抜歯手順に従って抜歯され、治験審査委員会の承認を得て取り扱われました。
組換えポシンアメロゲニン	の発現と精製  ラボN	/A	rP172、全長
ちとさん	Sigma-Aldrich	448877	中分子量、75-85% 脱アセチル
化リン酸	VWR	AA033266
酢酸氷河	VWR	A036289
水酸化ナトリウム	VWR	BDH9292
塩化カルシウム	Sigma-Aldrich	223506
二塩基性リン酸ナトリウム無水	VWR	BDH0316
BL21-CodonPlus (DE3)-RP	アジレント・テクノロジーズ(株)
硫酸アンモニウム	VWR	BDH8001
トリフルオロ酢酸	VWR	AAAL06374
アセトニトリル	VWR	BDH1103
塩化マグネシウム	VWR	BDH0244
リン酸二水素カリウム	VWR	BDH9268
塩化カリウム	VWR	BDH0258
塩化アンモニウム	VWR	AAAA15000
HEPES (4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタン-スルホン酸)	VWR	AAA14777
フッ化ナトリウム	VWR	AA11561
Tris-buffered saline	Bio-Rad	170-6435	10回;TBS
ウシ血清アルブミン	EMDミリポア	12659	CalBioChem、アルブミン、ウシ血清、フラクションV、低重金属
トリトンX-100	EMDミリポア	TX1568-1
チキン アンチアメロゲニン	N/A		南カリフォルニア大学マルコム・スニード教授からの贈り物
ウシ アンチチキン IgY-FITC	サンタクルーズ	SC-2700
高速液体クロマトグラフィーシステム	アジレント・テクノロジーズ社	Varian Prostar 210
C4 カラム	フェノメンクス	ジュピター5μ 300A
走査型電子顕微鏡	日本電子	JSM-7001
FIB-SEM	日本電子	JIB-4500
透過型電子顕微鏡	JEOL	JEM-2100F
デジタル低速ダイヤモンドソー	MTI 株式会社	SYJ-150
蛍光顕微鏡	ライカ	DMI3000 B
超音波洗浄機	ブランソン	2510	42 kHz、100 W
ナノ圧子	アジレント・テクノロジーズ(株)	MTS XP