感光性タンパク質中のプロトン移動とプロテイン立体配座ダイナミクスの時間分解ステップスキャンフーリエ変換赤外分光法により

サマリー

タンパク質機能の主要なステップ、特に骨格の構造変化とプロトン移動反応は、しばしばマイクロ秒からミリ秒の時間スケールで起こります。これらの動的プロセスは、特に光によって機能が引き起こされるタンパク質について、時間分解ステップスキャンフーリエ変換赤外分光法によって研究することができます。

要約

タンパク質の機能の間にプロトン化し、タンパク質骨格コンフォメーション変化のダイナミクスを監視することは、そのメカニズムを理解するための重要なステップである。プロトン化およびコンフォメーション変化は、赤外線（IR）分光法の差によってプローブすることができ、どちらも、それぞれアミノ酸側鎖のペプチド結合の振動パターンを、影響を与える。その機能は繰り返し再現性と光によって誘発することができるタンパク質については、赤外線技術を変換するステップ·スキャン変換を用いて広いスペクトル範囲にわたって（サブ）マイクロ秒の分解能で赤外差スペクトルを得ることができる。の速度論に従うのに十分な^{、4 -}光反応の〜10 ^{2〜10 3}反復で、最小数の合理的なスペクトル分解能及び帯域幅でスキャンを完了するために、吸収差スペクトルにおけるノイズレベルは約10限り低くすることができ単一のアミノ酸からプロトン化に変更されます。下段ノイズレベルは、より多くのデータの平均化および/または数学的に処理することによって達成することができる。最適な結果を得るために必要なタンパク質の量は、使用されるサンプリング技術に応じて、5〜100μgの間である。追加要件に関しては、タンパク質は、最初に低イオン強度緩衝液中で濃縮し、次いで膜を形成するために乾燥する必要がある。タンパク質膜は水のほとんどの小滴または制御大気湿度の下でいずれか、実験前に水和される。得水和レベル（タンパク質の水/ gをg）をIR吸収スペクトルから測られる。テクニックを披露するために、我々は、ネイティブ紫膜環境での光駆動プロトンポンプバクテリオロドプシンの光サイクルを学び、光感受性イオンチャネルチャネルロドプシン2の洗浄剤で可溶化した。

概要

完全タンパク質がその機能を実行する方法を解明するために、それらは、すなわち 、多くの場合、中間体の系列を含み、時間の数桁を拡張反応経路に沿って、動作するように、それらを測定する必要がある。タンパク質機能の重要なステップは、多くの場合、膜タンパク質の特定の骨格コンホメーション変化およびプロトン転送する反応において、時間範囲^を1ミリ秒マイクロ秒で起こる。 X線結晶学、構造生物学の間違いなく柱は、膜タンパク質²と一緒に成長することが難しいことで知られ、よく回折するタンパク質結晶から静的な（時間平均）電子密度を提供します。まれに、水素原子の位置を含まないが、3D原子モデルは、電子密度に基づいて構築することができる。ラウエ回折³やフェムト秒X線パルス⁴のいずれかに依存し、時間分解X線結晶構造解析、の著しい進歩は、高い構造情報の中に、時間次元を追加X線結晶⁵にコヒーレント。しかし、技術的、分析的な課題はともかく、結晶格子は、バックボーン立体構造変化を損ない、タンパク質力学、タンパク質結晶⁵に基づく方法の避けられない欠点を変更することができます。限定された構造的な洞察力の全般的な欠点を持つが、フラッシュ光分解^6,7によって開拓として、その結果、タンパク質の動的な側面は依然として最高の光学的方法で覆われている。

フーリエ変換赤外分光法（FT-IR）は、タンパク質の構造、膜タンパク質^8-11無数の静的な構造的および機能的な調査において活用最後の機能に貴重な感度の光学分光法の時間分解能を兼ね備えています。具体的には、FT-IR差分光法は、別の^12月19日に1準安定状態からのタンパク質遷移などの小さなスペクトルの変化を研究するための理想的なツールであることが証明されています。

Studie単一分子レベル^20,21以外でのタンパク質のダイナミクス、上のSは、同期のためのトリガのプロセスを必要とする。巡回光反応によるタンパク質の研究で行ったようにこの反応は、簡便、迅速かつ侵襲的にトリガとして光を使用していないが開始されます。良好なスペクトル分解能および適切な信号対雑音比を維持しながら、時間分解の研究に関連する主要な課題は、十分な時間分解能の達成である。また、十分に広いスペクトルおよび時間的な範囲をカバーすることが不可欠である。時間分解ステップスキャンFT-IR分光法は、公開された例が3,900-850 CMと同じ幅のスペクトル範囲をカバーする^-1とダイナミクスは最大3.5センチメートル^-1のスペクトルと時間の〜9桁を拡張して、これらの側面²²の全てに優れそして30ナノ秒の時間分解能^23-28。

フーリエ変換赤外分光計は、分散型のもの²⁹以上のノイズを低減し、改善された測光精度を示している。 HowevER、通常の急速なスキャン記録モードでFT-IR分光計、干渉計の可動ミラーがスキャンを完了するために必要な最小時間の結果として≥5月10日ミリに限ら時間分解能に苦しんでいます。ステップアンドスキャン技術では、対照的に、動的イベントの時間依存性は、干渉計の走査期間から切り離される。簡単に説明すると、個別のステップでモバイルミラーが移動するのではなく、連続してスキャンを完了するためにスキャンする。これらのステップのそれぞれで（移動）ミラーが固定保持され、過渡が記録さ​​れる。従って、時間分解能は10〜100ナノ秒の範囲である水銀カドミウムテルル（MCT）検出器の立ち上がり時間によって制限される。実際には、（翼におけるセンターバーストと小信号中の強いシグナルを含む）インターフェログラムの大きなダイナミックレンジは、サンプリングをもたらす、できるだけ多くのビット16-24などとの適切なデジタルアナログ/デジタル変換器（ADC）のために必要と〜200 kHzのより高くはないレート（5秒^）30。ナノ秒の時間分解能は、8〜12ビットのADCで十分である^23,31-33れるインターフェログラムの変化のみを測定することによって達成することができる。時間分解ステップ·スキャンの技術的な側面^30,34,35とアプリケーション^{36〜38は、}他の場所で詳細に議論されてきた。

電流寄与の目的は、感光性膜タンパク質上の時間分解ステップアンドスキャンFT-IR分光法の実用性を説明するプロトコルを提供することである。透過と全反射減衰（ATR）：ここでは、この技術の性能は、2つのサンプリング方法のために示されている。 ATRの使用は、タンパク質の完全な水和状態を保証するだけでなく、試料のpHおよびイオン強度^49,50の急性の制御を可能にするだけでなく、過剰な水の存在下での作業を可能にする。バクテリオロドプシンおよびチャネルロドプシン2：ステップスキャンの実験は、選択された2つのシステム上に示されている。

光駆動プロトンポンプバクテリオロドプシン（BR）は、これまで最高の理解膜タンパク質作り、40年以上の^39,40のための多数の生物物理学的研究の対象となっている。ブロードの機能をFT-IR分光法の研究に適用される多数の技術の中では間違いなく最大の影響の1を与えてきた。すなわち、FT-IR分光法は、他の場所^13,41,51占めたように、膜を横切るプロトン移動に関与してグループを解決するための鍵となっています。

チャネルロドプシン（CHR）は、自然界^42,43で最初に見つかった光感受性イオンチャネルである。 CHRの光励起は、イオンチャネルの一過性の開口部をもたらす。その発見は、分子プロセスは、光^44,45によって制御されている光遺伝学の発展の道を解決した。 CHRがはるかに少ないその機能的機構⁵²について知られている、Brなど、微生物ロドプシンファミリーに限定bRは対照的に、属する。 ChR2をは、IOとしての機能を兼ね備えてプロトンポンプの活性^46,47とnチャネル。最近、我々はイントラタンパク質プロトン移動反応およびChR2を⁴⁸タンパク質骨格コンフォメーション変化のダイナミクスを解決するために、時間分解ステップアンドスキャンFT-IR分光法を適用した。

プロトコル

1。一般的なサンプルの態様及び機器の準備

1. 時間分解ステップ走査測定のために装備商用FT-IR分光計を使用する。最良の結果を得るには、振動減結合テーブルの上にFT-IR分光計を配置。
2. 数ミリバールに光学区画を避難。乾燥した空気または窒素で試料室をパージします。
3. FT-IR分光計のMCT検出器の前に可視光に対して不透明IR透明材料を配置します。この予防措置は、ステップ·スキャン実験中励起レーザパルスからのアーチファクトを防ぐために不可欠です。注：私たちは、直径25mmのゲルマニウム（Ge）ウィンドウを使用します。その高い屈折率は、望ましくない強度が大きく、反射防止コーティングでGeのフィルタを用いて回避し、失う原因となる。
4. 液体窒素でMCT検出器デュワーをクールダウン。注：光起電MCT検出器を使用は、それらの線形応答のphotoconductivesよりも好ましい、したがって、優れたphotometrさICの精度と信頼性をベースライン^31,53。
5. 均質なタンパク質膜を形成するタンパク質懸濁液を乾燥しながら塩結晶の形成を防止するために低い（<20 mM）のイオン強度の緩衝液中に少なくとも2 mgのタンパク質/ mlの実験に用いたサンプルを予め濃縮する。沈降サンプルについては、（リポソームまたは細胞膜パッチにおいて、例えば 、膜タンパク質）超遠心分離を適用することにより、それらを濃縮する/洗浄する。堆積物（ 例えば 、洗剤可溶化した膜タンパク質）をしないタンパク質のための適切なカットオフのセントリコンを使用してください。
6. 最適な結果を得るために使用します。可能な限り純粋でアクティブA）タンパク質製剤を、細胞膜パッチ内またはリポソーム中に再構成するタンパク質のための体重の3≤B）脂質/タンパク質比; C）洗剤可溶化したタンパク質のための体重の1≤洗剤/タンパク質比は。振動バンドタンパク質（ 例えば 、CHAPS）と重複洗剤や脂質の使用は避けてください。

2。 バクテリオロドプシン上の全反射減衰実験の準備を

1. FT-IR分光計の試料室にATRアクセサリーをマウントします。注：私たちは5アクティブ反射でのZnSe /ダイヤモンドATRを使用しています。その光学特性は、可視光を励起レーザによって影響されるように、このようなATRアクセサリの内部反射素子（IRE）のようなゲルマニウムまたはシリコン等の半導体材料を避ける。
2. 4センチメートル^-1従来のラピッドスキャンFT-IR分光法によるクリーンIRE表面の解像度で広い範囲（約4,000-800 cm ^-1）でエネルギースペクトルを測定します。後の段階で吸収スペクトルを計算するために基準スペクトルとして、このスペクトルを使用する。
3. 試料（ 例えば 、pH7.4で4 NaClおよび100 mMののNaPi）を再水和するために後で使用緩衝液20μlとATRのIREの表面を覆う。バッファのIR吸収を測定します。
4. バッファを削除し、IRE表面WIをすすぐ目の水。表面に触れないようにしてください。強烈な空気の流れによってIRE表面から残留液を除去します。
5. IREの表面の上に紫色の膜中のバクテリオロドプシンの〜3μL（BR）（〜6 mgのタンパク質/ mLの脱イオン水中）スプレッド（〜0.2センチメートル²エリア）。フィルムが得られるまで乾燥した空気の穏やかな流れの下でタンパク質懸濁液を乾燥させます。
6. （ 図1参照）の乾燥フィルムの吸収スペクトルを測定する。
7. 静かにドライフィルム（ 例えば 、pH7.4で4 NaClおよび100 mMののNaPi）を再水和するために、高いイオン強度の緩衝液を20〜40μlを加える。注：高イオン強度が探査された表面にできるだけ近い（ 図2）と同じくらいのタンパク質を保持することを可能にする、膜フィルムの過剰な膨潤を防止する。
8. 水の蒸発を防ぐために蓋付きATRホルダを覆う。必要に応じて、温度制御のために25℃に設定し、循環バスに接続されたカバー·ジャケットを置く。長いphotocycles（＆＃を有するタンパク質62;秒）、温度制御は、ベースライン安定性を高める可能性があります。
9. 吸収スペクトルを測定します。緩衝液（ 図3）の吸収スペクトルを差し引くことにより、フィルムの再水和後に表面近傍に残留する試料の割合を推定する。
10. 再水和後の5〜20分間隔（ 図4）で吸収スペクトルを記録することによって、フィルムの膨潤の安定化を確認する。この手順は省略可能ですが、推奨される。

3。界面活性剤で可溶化したチャネルロドプシン2の伝送実験を実施

1. 直径20mmのBaF _2をウィンドウの中央に5のNaCl、5mMのHEPES（pH7.4）でデシルマルトシド（DM）に溶解にChR2（〜10 mgのタンパク質/ ml）を10μlを追加します。 6〜8ミリメートル径（〜200μgの/ cm ²のタンパク質表面密度）をマイクロピペットチップの助けを借りて、それを広げた。
2. フィルムUSIを形成乾燥した空気の穏やかな流れをngの。最良の結果を得るには膜が均一であり、およそ最大の開口部にIRビームのサイズと一致する直径を有していることを確認してください。
3. 3-5で配布グリセロール/水の混合物の3〜5μLを添加することにより、フィルムの水和物は、ドライフィルムを中心に低下して、しっかりと≥1ミリメートルの厚さの平らなシリコーンOリングを使用して第二のウィンドウを閉じます。注：グリセロール/水混合物の比は、窓⁵⁴との間の相対湿度を制御する。吸湿サンプルについては3月7日または2月8日グリセリン/（w / w）の水の比率を使用しています。グリセロール/水滴が膜タンパク質と直接接触してはいけません。
4. ホルダー内のBaF ₂に挟まれた窓を挿入します。水和したフィルムのサイズに一致する穴と、紙等のIR不透明材料、とのサンプル窓を覆うことにより、検出器に到達するのまっすぐ光を防ぐ。サンプルコンパートメント内のホルダーを配置します。
5. 25℃にホルダの温度を制御する温度制御された循環バスに接続された恒温ジャケットによるC。
6. 吸収スペクトルを測定します。アミドI領域（〜1,700-1,620 cm ^-1）での最大吸収が0.6〜1.0の範囲内であることを確認してください。
7. 水、DM、代表膜タンパク質（ 図6）のための基準消衰係数スペクトルを用いて、水和フィルムの吸収スペクトルからの質量およびタンパク質/界面活性剤/水のモル比（ 図5）を推定する。
8. 水和レベルはステップ·スキャン実験（≥1時間）を実施する前に、安定するまで待ってください。

4。調整と励起レーザの同期

光サイクルをトリガするために、YAGレーザ（λ= 532nm）を：BR上の実験のために、パルスのNdの第二高調波放射を使用しています。 OPによって提供されるのChR2を含む実験では、λ= 450nmの励起を使用：YAGレーザーの第三高調波のNd（λ= 355 nm）とによって駆動されるticalパラメトリック発振器（OPO）。レーザパルスが二光励起を最小限にするために（〜10ナノ秒）十分に短いことを確認してください。注：レーザパルスのエネルギーはできるだけ一定であるべきである。過渡現象記録装置に接続されたフォトダイオードでレーザの反射を測定し、応答（ 図8）を積分することによって確認されるように我々のセットアップでは、レーザ強度は、平均値の周りの10％≤変動する。

1. カップルサンプルへのレーザー。パワー·メータを使用して、パルス当たり2〜3ミリジュール/ cm ^2のサンプルでのレーザーのエネルギー密度を調整します。
   1. ATRのセットアップでは、ATRの蓋の上に置か光ファイバを使用してください。
   2. 透過実験のために、試料にレーザーをもたらすためにミラーを使用して、必要に応じて、コリメートレンズのいずれか、またはわずかに試料フィルムサイズ上記直径にレーザ光を発散する。
2. LASEを同期させるR分光計によってデータ記録パルス。分光器をトリガする：YAGレーザーのNdエレクトロニクスのQスイッチシンク·アウトTTLパルスを使用してください。それぞれのbRは10 HzおよびChR2を0.25 Hzに：YAGレーザーのNdの励起レートを設定します。
3. レーザー励起速度を制御するパルス遅延発生器（PDG）を使用する場合のNd繰り返し率：YAGレーザは容易に調整できません。
   1. PDG外部トリガ入力に：YAGレーザーのNdランプシンク·アウトに接続します。レーザ発振をトリガするためにYAGレーザ：PDGは、Q-スイッチ同期中のNdの入力にTTLパルス出力を遅延〜190マイクロ秒を提供する。ゲートPDGだけ最後に受け入れトリガ（BrまたはChR2を4秒100ミリ秒）から一定時間後に外部トリガを受け入れます。

5。時間分解ステップスキャンの準備と設定

1. 光路にローパス光学フィルタを配置します。 1,800-85で時間分解ステップスキャン測定を行うに0センチメートル^-1スペクトル範囲は、1950センチメートル^-1を超えると1800センチメートル^-1（ 図7）の良好な伝送（>百分の50から80）で、フィルターの不透明を使用しています。
2. ACからDC結合モードに検出器を変更します。注：この調整した後、インターフェログラム信号は、もはや周りのゼロが、DCレベルとして知られている値を中心に振動しません。
3. より高い光子束及び、従って、より良好な信号対ノイズが、検出器の直線性限界内ための分光計の最大の可能なビームアパーチャを使用する。
4. ゼロにインターフェログラムのDCレベルを持参し、アナログデジタル変換された（ADC）のダイナミックレンジをより有効に活用するために、電子ゲインを再調整。前置増幅器によって供給される信号に電圧バイアスを印加することでDCオフセットレベルを達成する。注記：このオプションは、近代的なFT-IR分光計に含まれています。そうでなければ、自家製の外部装置は、前置増幅器とADC ³⁸の間に配置され、代わりに使用することができる。ケアはしてあるこのようなデバイスの電子機器は、高速かつリニアであることを確認する必要がありました。
5. FT-IR分光計のステップ·スキャンメニューを起動します。 1,975.3-0 cmのステップスキャン測定対象のスペクトル帯域幅を設定し^-1。少し光フィルタのカットオフを超え、He-Neレーザーの波数（ここでは1月8日^目 ）の画分にスペクトル帯域幅を調整します。
6. 後の時間で反応速度の歪みを防止するために、任意の高域通過フィルタの電子を無効にします。そのカットオフ周波数が順またはADC（ノイズエイリアシングを低減する）のサンプリングレートを上回る場合、ローパス電子フィルタは有益であり得る。
7. 8センチメートル^-1と64 cmのスペクトルと位相解像度を設定し^-1であった。前進片面にフェログラム取得モードを設定します。これらのオプションを1フェログラムは約500ポイントが必要です。
8. 160 kHを、 例えば （分析計で利用可能な最高にADCのサンプリング·レートを設定Z、または6.25秒）。 「外部」、 すなわち 、「実験のトリガー」を設定し、レーザーがマスターです。 BR（最大42ミリ）7,000 20,000 ChR2を（最大125ミリ）のために：記録される直線等間隔のデータポイント数を設定します。注：より長い時間スケールは、データ取得^38をトリガする波発生器から擬似対数的時間間隔を外部TTLパルスを用いてADCメモリをオーバーフローすることなく覆うことができる、又は内部ADC ³¹の代用品として二つの平行な過渡レコーダを使用することにより^{、 32。}
9. サンプルの暗状態のための基準として、約100プレトリガーポイントを保存します。注：ミリ秒の時間スケールでは、データの品質は、多くの場合、モバイル·ミラーの変動によって制限されます。 100の上方にプレトリガーポイントを増加させることは、従って、有意なデータ品質を改善することは期待されない。
10. 共同加算の回数を設定し、 すなわち 、ミラーPOSITあたりの光反応の平均数イオン。 bRのために、20の同時添加（10 Hzの励起速度での時間を計測する20分）を使用する。 ChR2を2共添加（0.25 Hzの励起速度での時間を計測する70分）を使用するため
11. bRのための実験の10倍を繰り返し、ChR2を3つの異なるサンプルフィルム上の35X、ミラー位置ごとに最終的に〜200の共同の追加を持っている。

6。データ処理

1. 最初と最後の測定から得られた光誘起赤外差スペクトルを比較することにより、サンプルの状態を確認してください。差スペクトルの強度は最初の測定の60％を下回る任意の測定値を廃棄することを検討してください。
2. 記録された干渉画像を平均。
   1. FTIR分光計からOPUSソフトウェアを使用して、平均して「スペクトル電卓」に追加し、時間分解干渉画像を選択します。
   2. インターフェログラムの平均を得るために、「=」をクリックしてください。
      注：場合にはインターフェログラムの位相それは平均的な干渉画像またはシングルチャネルスペクトルに無関心で測定中は一定である。一定の位相を計算し、第一の位相スペクトル及び最後に記録されたインターフェログラムを比較することによって確認することができる。
3. フーリエ平均化時間分解単一チャネルスペクトルを得るために平均時間分解インターフェログラムの変換を行う。
   1. ステップ6.2.1と同じソフトウェアを使用して、平均した時間分解干渉図形を選択し、「スペクトルと干渉図形」のアイコンをクリックしてください。メルツ位相補正方法、2のゼロ充填率（インストゥルメンタル解像度ごとに2つのデジタル点）、およびアポダイゼーション機能（ 例えば 、三角形、ブラックマン·ハリス3 -利用など）を使用してください。
   2. 時間分解スペクトルに時間分解干渉画像を変換するために下の「変換」をクリックしてください。
4. 「データポイントテーブル」又はA」として時間分解単一チャネルデータをエクスポート; MATLAB」を使ってファイル "OPUSソフトのアイコン"として保存します。外部プログラムでのデータ処理を続行します。
   1. レーザーの前に単一のチャネルスペクトルを平均化し、時間分解吸収差スペクトルを時間分解シングルチャネルのデータを変換します。
   2. レーザーの前の100シングル·チャネル·スペクトルの、ε、ノイズ標準偏差を用いて、波数の関数（ 図12）などの差スペクトルにおいて期待されるノイズ標準偏差のベクトルを計算し、平均値、S _0（ν）： ε/ S _0（ν）。 εの値は、連続した単一チャネルスペクトルを減算し、√2で補正標準偏差を計算すると推定される。
   3. の利用にはあまりにも騒々しいスペクトル領域を削除する（ たとえば 、1825センチメートル上記^-1および850センチメートル下記^-1）。
   4. 準対数的に平均化（ 例えば 、20スペクトル/時間十年）を行います。 appearanデータのCEは改善し、スペクトルの数は、有意な情報がなくて〜10 ²に〜10 ⁴から減少します（ 図9）を失った。
   5. フーリエ補間を使用して（1ポイント/センチ^-1）の点の4倍のスペクトル密度を増加させる（ゼロフィリングを掲示）。
      注：私たちは、MATLABで実行されている自家製のプログラムの中で6.4.4に手順6.4.1を実行します。
5. 特異値分解、SVD（ 図13）で得られた時間分解スペクトル（ 図10A）を処理する。有意なSVDコンポーネント（ 図10B）の限られた数のデータを再構成することによって、データノイズ除去を達成する。注：私たちは、ビルトインの「SVD」機能を使用して、MATLABでSVDを実行します。

結果

図1は、ATR分光法に使用されるダイヤモンド内部反射素子の表面に付着のbRの乾燥フィルムの吸収スペクトルを示す。ペプチド結合の振動から特徴的なバンドは、（アミドA、アミドI及びアミドII）、明らかに識別可能である。乾燥フィルムの厚さはおおよそ（±0.2 cm ^2）を添加したタンパク質（18μgの）の量及びATRの面を考慮して、〜1.4グラム/ cmのように、タンパク質の濃度を考慮して、約1ミクロンと推定することができる^3、58、紫膜⁶⁰ 1.0グラム/ cm ³で^、59 1/3の脂質/タンパク質比（w / w）のような脂質である。

ドライフィルムをpH 7.4（ 図3）で4 MのNaCl、100mMの過剰のNaPiで再水和した。エバネッセント波によってプローブ体積の水和レベルで効果的なタンパク質濃度は、デジタル的に吸収バンドを除去するために必要なスケーリング係数から推定することができる水から。最適なスケーリング係数は、この場合、緩衝液は87％、表面近傍の試料体積の13％を占めることを意味し、0.87であった。アカウントタンパク質および脂質濃度と紫膜における脂質/タンパク質比（上記参照）を考慮して、我々は、エバネッセント波によってプローブ体積で125 mg / mlのタンパク質の有効濃度を推定することができる。我々は、この特定の場合において、サンプルフィルムの厚さは〜1から〜6μmと、再水和時〜6倍に拡大水和レベルから推定することができる。私たちのために、最もATR配置のための典型的な45°の入射角については、水和タンパク質フィルムのエバネッセント場さ（d _p）の侵入深さは1,800-850 cm ^-1で⁶¹ミクロンの間隔で0.3〜0.6で変化する。エバネッセント場が2回dは_pの⁶¹の上方に位置する試料にほとんど依存しないので、我々は、ATR実験に用いられるタンパク質の量が5倍重量を低減することが原理的に可能性が推測信号の重大な損失をithout。

低いイオン強度の緩衝液を使用する場合、フィルムは、より展開し、エバネッセント場によってプローブされた体積中のタンパク質の量（ 図2）に低減される。膜の膨潤および緩衝液のイオン強度との間の正確な依存性は、脂質の性質上、他の因子の中でも、依存するであろう。例えば、同様の膜MのNaCl極性E.で再構成した膜タンパク質について得られた4を用いて紫膜中のBRのためにここに得られた膨潤わずか0.1 MのNaCl ^62を用いて大腸菌脂質 。試料が探査さ容積の5％未満を占める場合は、より高いイオン強度の緩衝液を使用して水和工程を再度行うことを検討。水和膨潤後の膜を安定化（ 図4）に到達するのに時間を要する。紫膜中のBRのためのプロセスは、12分の時定数で、次指数です：それは、安定した再水和フィルムを持っているこれ以上の30〜60分未満を取る

図5は、送信して得られたChR2を膜の水和のIR吸収スペクトルを示す。ここで、水和をグリセロール/水の混合物により提供される制御された湿度の雰囲気下にドライフィルムを曝露することによって達成された。スペクトルは、水、洗剤及びタンパク質からの寄与に分解することができる。我々は、実験スペクトルに合わせてスケーリングされ、消衰係数スペクトルを用いて、それらの各々の量を推定することができる。水のために我々は文献⁶³から吸光係数スペクトルを取って、DMのために我々は100 mg / mlの溶液（ 図6）から計測したものです。ミトコンドリアADP / ATPキャリア⁶⁴とBR（ 図7）：我々はまた2代表膜タンパク質の吸光係数を使用していました。スケーリング係数は、それぞれ、260μgの/ cm ²であり、膜中に200μg/ cm ²の水およびDM質量面密度を示している。残りの吸収（Figur電子5、赤線）は、二つの異なる膜タンパク質からのアミドII吸光係数を用いて250μgの/ cm ²の面密度であると推定タンパク質（ 図6参照）から主に来る。タンパク質/界面活性剤/水のモル比は、1/60/2000は、それぞれ、35kDaの、480 Daであり、18 Daの分子量を使用して計算された。

bRの上の典型的な時間分解ステップアンドスキャンFT-IR実験から三次元プロットは、ATRによって得られ、データ取得の200分を伴う、 図10Aに示されている。スペクトルは、Lは、ブロードの光サイクルのMとNの中間体は、それらの最も高い集団（ 図11）に達すると予想され、例えば、特定の時刻に抽出することができる。それらのスペクトルの特徴は^、13,41,65広範囲に記載されており、ここでは議論しないことになる。 図12は、いくつかの選択波数の時間トレースを示しています。 1762℃で反応速度、すなわち、台頭M ^-1（T _1/2〜60秒）は、網膜シッフ塩基⁶⁶からAsp85のプロトン化のダイナミクスに報告し、ゼロにその崩壊は、地上サテ回復⁶⁷時にその脱プロトンを示している。 1740センチメートル^-1（〜1ミリ秒のt _1/2）での反応速度の上昇が負Asp96側鎖、シッフ塩基⁶⁸にプロトン供与体の脱プロトン化を報告する。細胞質⁶⁷からの再プロトンゼロのレポートに強度の減衰。タンパク質立体構造変化のダイナミクスは、室温^67,69にて〜3ミリ秒で最大の変化に到達したアミドIおよびアミドII領域における吸収の変化によって調べることができる。

問題を分光するSVDの適用は^、55,56の前に検討されている。 A = U S：簡潔には、SVDのように、行列A内に配置された実験データを、因数分解 V ^T。この分解は、波数のノイズ依存性を考慮するために、ベースライン⁵⁷の変動/ドリフトを不利に改変することができる。 UとVの列はそれぞれ、各SVDのコンポーネントの正規直交スペクトルと時間のトレースベクトルが含まれています。Sは 、いわゆる特異値を含む対角行列である。 UとV IN（アブストラクト）スペクトル時間コンポーネントは、それらに関連する特異値により定量化し、最小二乗の意味で実験データを記述するために関連性を減少させることで表示されます。 図13Aは、部品数の関数として特異値を示しており、 U（抽象スペクトル、 図13B）とV（抽象的、時間トレース、 図13C）の最初の8列/コンポーネントを再生する。信号は、第5の構成要素に集中している（pHについて予想されるようにotocycle 5中間状態を含む）、主にランダムノイズやエラーの他のソースによって支配以上の成分を持つ。実験データにのみ、UとVの最初の5列、およびSの最初の5列と行を使用して再構築した。 SVDによって再構成されたデータは、ランク5の行列に実験データの最高の最小二乗近似を表しています。再構成されたデータは、品質の向上（ 図10B）を示している。すなわち、ノイズが大幅に低減されているだけでなく、ベースラインでいくつかのほとんど目立た変動やドリフトを（時間分解ステップ·スキャン分光法²⁵で一般的）。 SVD処理がミリ秒範囲における実験の時間トレース（ 図12の赤い線）の品質を向上させるために特に有益である。

ChR2を光サイクルのための時間分解ステップ·スキャンデータtransmisために、上記のプロトコルを用いて得られた大まかに累積測定値の120時間を含むシオン実験（ 図14A）、。ステップ·スキャンによって収集された時間分解データは、6.25秒から125ミリ秒に及ぶ。 ChR2をの光サイクルは完全な回復のために約60秒を必要とします。光サイクルの最新の部分は、他の場所で提示されるようにマージ⁴⁸ラピッドスキャンFT-IRを用いて被覆され、ステップスキャンおよび迅速なスキャン両方のデータセットすることができる。 ChR2をのスペクトルの変化は、測定がより困難になっ·BRから入手したものより約10倍小さくなります。特別に、ミリ秒範囲のベースラインでの振動は、これらの低吸収の変化で明確に明らかになる。これらは、ミリ秒の時間スケール²⁵内のモバイル鏡の中の小さな振動によるものである。振動は、一緒になって、ノイズの一部と、主に著しくデータ（ 図14B）の外観を改善する、SVDによって除去することができる。

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図1。上にATRアクセサリーのダイヤモンド表面を乾燥させた紫膜中のBRの吸収スペクトル。ペプチド結合（アミドI、II、およびA）の振動からバンドが示されている。

図2。様々なイオン強度（4のNaClの希釈、100のNa ₂ HPO ₄ /のNaH ₂ PO ₄ pH7.4での）のバッファを使用して再水和後のBr膜の吸収スペクトルが。アミドIIバンドの減少に注目して、 すなわち 、緩衝液のイオン強度が減少するにつれて、膜の膨潤を増加させた。 subtracti後の1541センチメートル^-1（アミドII最大値）での吸光度の強度により定量化し、表面近傍のタンパク質（インサート）相対量、バッファの吸収貢献の上。

バルクバッファー（4.3 Mイオン強度）で洗浄し、緩衝液の寄与を差し引いた後に再水和のbRの膜の図3の吸収スペクトル減算係数0.87は、3,700-3,000センチメートルの間の強い水の吸収を除去するために選択された^-1と2,700-1,800 cm ^-1の間の平坦ベースラインを得る。

図4 4.3 Mイオン強度の緩衝液で再水和後のbRの吸収スペクトル（吸収バッファは、図3のように明確にするために引いた）。インサートは、フィルムの進化はrehydrat後の膨潤示すイオン、1541センチメートル^-1でのタンパク質のアミドIIの吸光度が続く。単一指数関数にフィットさは12分の膨潤膜安定化のための時定数を示す。

図5の伝送（青線）によって測定にChR2の水和膜の吸収スペクトル。吸光係数水のスペクトル（破線オレンジ色の線）およびDM（破線シアン線）はスケーリングされ（赤線）を差し引いた。

図6。液体の水、25℃で再生質量吸光係数スペクトル（http://www.ualberta.ca/〜jbertie / JBDownload.HTM＃スペクトラ）およびADP / ATPキャリア^（AAC）64の水和フィルム。 trong>質量吸光係数スペクトルはDM（100 mg / ml）を溶液中に測定され、bRのための水和膜中た。

図7時間分解走査スキャンFT-IRの測定に用いられる光学フィルタの透過率。

。図8のNd 2高調波（532nm）によって提供されるレーザパルスの性能：1,000レーザパルスの相対的なエネルギーの変化のYAGレーザヒストグラム、および0.05の標準偏差を有するガウス分布にフィットする。

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図9。間隔（緑、黒、青のラインを）前進を均一時点で3つの代表的な波数Brから吸光度変化を光誘起準対数平均の後〜20点/ディケード（赤線）。後の騒音低減に気づき対数平均化、ミリ秒の範囲の時間トレースの振動を明らかにする。

図10。pHは7.4で、ATRによって記録bRのための光誘起吸光度変化（4のNaCl、100 mMののNaPi）の3D表現。 5 SVDコンポーネントによって再構築A）の生データ。B）データ。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図11。のBR光サイクルのFT-IR差吸収スペクトルを選択した3つの回ここで、L（12.5秒）で、M（300秒）、およびN（6ミリ）の中間体が最も豊富である。

図12。のBR光サイクルにおけるプロトン移動とタンパク質骨格のダイナミクスの時間分解ステップスキャンFT-IR差分光法によって解決として。1762センチメートル^-1 Asp85のプロトン化/脱プロトンダイナミクスの報告であり、1741センチメートルの吸光度変化^-1 Asp96の脱プロトン/再プロトンダイナミクスに（300秒前H結合の変更を含む）。 1670および1555センチメートルでの時間をトレース^-1ペプチド骨格の構造に敏感両方のレポートアミドIの変化およびII、振動、。バックトレースは、生データ、およびSVD処理したデータに赤いものに対応しています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図13のbRの光サイクルの実験時間分解ステップアンドスキャンFT-IRデータの特異値分解（SVD）（図10A参照）。SVDを考慮に波数でのノイズ標準偏差の依存性を考慮実験データを秤量後に行った（ 図15）; ⁵⁷前に説明したように、ベースライン変動の統計量を減少させるために^第 1 ^の誘導体と組み合わせた。A）＆＃160と、第50の構成要素（黒丸）の相対的な特異値のプロット。最初の5コンポーネントは、コンポーネント（赤い円）を信号に割り当てている。ノイズ成分に対して期待指数関数などのコンポーネント減衰の残り（破線灰色の線を参照）。b）第 8抽象スペクトル（U _{8、U 1）。c）}第8抽象的、時間トレース（V ₈ Vの_1）。信号に割り当て抽象スペクトルと時間のトレースが赤い線で描かれており、黒い線とそうでない場合は、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図14。ステップ·スキャンにより記録されたChR2をするための光誘起赤外吸光度変化の3D表現透過モードで。ステップ·スキャンデータのみを光サイクルの一部であって、a）生データをカバーしています。B）5 SVDコンポーネントと再構成されたデータ、125ミリ秒まで伸びている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図15。推定されたノイズレベルが、FT-IR、差分吸収スペクトルの時間的な6.25秒と8センチメートル^-1 1 co-addition/mirror位置（500光化学反応）または〜200 co-addition/mirror位置を含む実験のスペクトル分解能で（10 ⁵光反応）。値は、減衰全反射（ATR）と送信設定について示されている。

ディスカッション

タンパク質上の時間分解ステップアンドスキャンFT-IR実験を行う際に考慮が必要な第一の側面の一つは、IR分光法に適した形態での試料の調製である。関心対象のタンパク質以外の物質からIR吸収を低減する必要があり、特に水からの。最も一般的なアプローチは、フィルムを形成するために、試料のバルク水を蒸発させることである。膜は、水溶液の一部滴を加えることにより又は制御された湿度の雰囲気に膜を曝露のいずれかによって再水和することができる。我々は、（ 図3および図5を参照）両方のケースでは、IR吸収分光法を用いて得られた水和レベルを推定することができる方法を示している。得られた水和レベルは、溶液中のものと比較して低い表示される場合がありますが、これらは機能的に関連するタンパク質の水和膜の研究を行う、実際に生きた細胞⁷⁰に見られるものに近い。水の他に、知っていると、試料中の脂質または界面活性剤の量を制御することも重要である。両方とも、IR吸収を低減分光影響を与えるに十分に低く維持するが、目的のタンパク質の完全性および機能性を維持するのに十分に高くすべきである。

時間分解ステップ·スキャン分光法は、光によって再現可能にトリガできる可逆反応を示すタンパク質に対してのみ素直に適用されます（ただし、迅速なバッファー交換で、ステップ·スキャンをカップリングで進行状況を確認^）71。反応工程スキャンにおいては、少なくとも〜500倍には8 cm ^-1の分解能で1,800-850 cm ^-1の領域を覆うインターフェログラムを完了するための最小数の再現可能である必要がある。しかし、実際には、付加的なデータ平均化は、一般的に雑音レベルを押し下げるために必要とされる。 200 co-additions/mirror位置（反応の10 ⁵回の繰り返し）の場合は6.25秒解像度吸光度差スペクトルがノイズSTAを表示することができます伝送実験（ 図15）のために^-5 2×10〜2×10 ^-4 ATRのための5×10 ^{-6〜3×10 -5}の間ndard偏差。その高い光子スループットのおかげで、トランスミッションは、ATR、成功裏などにChR2などの弱い吸収の変化を与えて、サンプルを研究するための重要な側面よりも〜7低い騒音レベルを可能にします。一方、ATRは伝送実験よりも5から25分のサンプルを必要とします。

時間分解ステップスキャンFT-IR分光法の適用は遅いphotocyclesを表示するタンパク質のための問題である。ステップ·スキャンによりインターフェログラムを記録することは、長い実用的になることができます。一部のソリューションは、多くの場合、増加したタンパク質摂取及び実験^27,74複雑さを犠牲にして測定を高速化するために、複数の交換可能なサンプルを使用することに基づいて、このようなケース^72,73に対処するために提示されている。場合によっては、元によってこの問題を回避することができる光サイクルを厳密に完了する前にサンプルを引用。 ChR2をするために、99％の回収のための光励起60秒後に必要とする光サイクルで、4秒での回復は、すでに80％の⁴⁸のである。レーザパルス当たり10％の励起効率で、ChR2を分子の98％が0.25 Hzにレーザ繰り返し率で実験を行うことが可能となる、光励起後に暗状態4秒である。

データ処理は、可能な限り最高の結果を達成するために必要な最後の技術的な側面である。対数平均化は、ノイズを低減し、さらに重要な、歪みなしに特異値分解またはグローバルフィッティングを用いて、事後データ分析のための本質的な特徴をデータのサイズを減少させる。対数平均化は、しかし、測定中の携帯ミラーやその他の1 / fノイズ源（ 図9）の振動に起因する時間の痕跡の変動を平均で非常に成功していない。ベースラインにおけるこれらの変動ミリ秒の範囲内のノイズやデータの破損して品質を超えることができます。特異値分解は、ノイズを減らすためのデータの冗長性を活用し、いくつかの変更⁵⁷で、それは同様に、ベースラインの変動を低減することができる。

最後に、時間分解ステップスキャンFT-IR実験の困難、最も時間のかかる部分は、バンドの割り当てにし、データのスペクトルと運動の解釈に対応しています。バクテリオロドプシンのIR差スペクトルに現れるバンドの多くは、数十年にわたる多くの研究者集団の累積仕事のおかげで割り当てられるか、または解釈されている。例えば、チャネルロドプシン2としてあまり研究された蛋白質、例えば、上記の時間分解IR実験は、部位特異的変異体に平行実験を伴い、機構的な解釈が⁴⁸に^到達するために相補的技術からの情報と組み合わされる必要がある。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
FT-IR分光器	Bruker	Vertex 80v	太陽光発電-MCT検出器、外部グローバル、オイルフリーポンプを装備。ファームウェア 2.3.
BaF2窓	korth Kristalle
Diamond ATR アクセサリー	スミス検出		9反射 DuraDisk
サーモスタットバス	Julabo	F25
振動デカップリングテーブル	OPTA
パルス Nd:YAG レーザー 第2高調波発生器付き	Continuum electro-Optics	Minilite
光パラメトリック発振器(OPO)	OPTA	BBO-355-VIS/IR S/N 1009
デジタルディレイ/パルス発生器	スタンフォードリサーチシステム	ズDG535
Nd:YAGレーザーと第3高調波発生器	Spectra-Physics	Quanta-Ray
さまざまな光学ミラーとレンズ	ThorLabs
OPUS 7.0	Bruker		Vertex 80v分光計を制御するソフトウェア
MATLABランタイム	Mathworks		は、自家製の実行可能プログラムを実行するために使用されますデータの前処理