調整可能な抵抗パルスセンシングを使用して定量化し、細胞外小胞の大きさ、プロファイリング

Summary

細胞外小胞は、凝固、免疫応答、および癌または薬物送達又は再生医療のような潜在的な治療剤を含む生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。このプロトコルは、調整可能な抵抗パルスセンシングを用いた各種流体中の絶縁および非単離された細胞外小胞の定量化とサイズ特性評価のための方法を提示します。

Abstract

「微小胞」と「エキソソーム」を含む細胞外小胞（電気自動車）は、体液中の非常に豊富である。近年、電気自動車への関心が驚異的な増加を目撃した。電気自動車は、凝固、免疫応答、および癌を含む、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことが示されている。また、電気自動車は、治療薬として、例えば、薬物送達ビヒクルとして、又は再生医療などの可能性を有する。サイズが小さいため（50〜1,000 nm）でのEVの正確な定量とサイズプロファイリングが技術的に困難である。

このプロトコルがどのように調整可能な抵抗パルス検出（のTRP）技術について説明し、qNanoシステムを使用して、電気自動車の濃度とサイズを決定するために用いることができる。ナノサイズの細孔を通じて転送するとEVの検出に依存する方法では、比較的高速であり、少量の試料を使用することで十分とPURを必要としませんificationやEVの濃度。次の別のアプローチは、サンプルを使用して記述されている通常動作プロトコルに既知のサイズおよび濃度のポリスチレンビーズでスパイクした。このリアルタイムの較正技術は、生物学的液体中の直接電気自動車を測定するときに遭遇する技術的ハードルを克服するために使用することができる。

Introduction

細胞起源からの小胞は、体液¹において非常に豊富である。これらのいわゆる細胞外小胞（電気自動車）（50 - サイズ1,000 nm）を細胞膜と多小胞状体のいずれかの融合によって、または細胞膜の外側に直接出芽により形成されている。近年では、電気自動車での科学的関心が大幅にEVの新たな機能や特性を^1に記載されているEVに焦点を当てた出版物の過多で、その結果、増加している。電気自動車は、現在、シグナル伝達、免疫調節、および血液凝固^1-4のような生理学的および病理学的プロセスの広い配列に関与すると考えられている。癌では、電気自動車はpremetastaticニッチ^5,6、血管新生⁸のプロ癌コンテンツ^7,8の移転や刺激の形成に役割を果たしているようだ。このほか、電気自動車は、治療剤⁹の送達剤として検討されている。

これらのデにもかかわらずvelopments、EVの信頼性の高い定量が困難なままである。伝統的に、間接的な定量法は、全タンパク質含有量または特定のタンパク質の定量化に依存している、使用されている。広く用いられているが、これらの技術は、タンパク質あたりのEVの違いを考慮していないし、電気自動車におけるタンパク質凝集体および混入タンパク質を区別しません。さらに、これらの技術は、多くの場合、生物学的サンプル中のEV濃度の比較を不可能にする電気自動車の単離を必要とする。

したがって、努力がより正確で直接的なEV測定¹⁰を可能にする新規な方法を開発するために行われている。このレポートは、信頼性の高い定量化やEVのサイズのプロファイリングのための調整可能な抵抗パルス検出（TRPS）の使用が記載されている。

現在、qNano装置（ 図1a）は、TRPSのための唯一の商業的に入手可能なプラットフォームです。 TRPSでは、非導電性弾性膜は、Wiを中断ナノサイズの細孔番目の二つの流体細胞を分離している。他の細胞は、粒子を含まない電解質で満たされ、一方、流体セルの一つは、目的の試料が充填されている。電圧を印加して、イオン流/電流が細孔（ 図1b）を介して粒子の移動時に変更される、確立される。この電流の遮断（「抵抗パルス'）の大きさは、粒子^11（ 図1c）の体積に比例する。封鎖持続時間は、電荷または^12形状の粒子の特性に依存して、粒子のゼータ電位を評価するために用いることができる。未知の粒子の大きさプロファイリングは、既知の直径を有する較正粒子による抵抗パルスで未知の粒子による抵抗パルスを比較することによって行うことができる。封鎖事象の大きさに加えて、これらが生じるの速度が測定される。この計数率reli粒子濃度でのES。封鎖の濃度および割合は^、13直線的に比例しているので、既知の濃度および粒子サイズの粒子を有する単一の較正サンプルを用いて、濃度¹⁴および未知試料のサイズ分布¹¹の測定を可能にする。

ナノポアを通る粒子の移動は、電気キネティック（電気泳動および電気浸透）と流体力¹⁵によって決定される。可変圧力モジュール（VPM）流体セル間の圧力差を使用して、追加の力として誘導することができる。正の圧力を適用すると、粒子濃度が低い場合に有益であり得る粒子の流量を増加させる。また、圧力は、動電学的な力の影響を低減するために適用することができる。としてしばしば電気自動車を検出するために使用される相対小さな孔径（NP100、NP150およびNP200おそらく）でナノ細孔を使用する場合に特に重要である。これらのナノ細孔のために、かなりの圧力を加える場合であっても、動電学的力は、粒子の表面電荷に依存して^、16無視できないままであり得る。複数の圧力での粒子速度を測定することにより、電気を動力学的に補正し、より正確な、EV濃度を算出することができる。

ここでは、詳細なプロトコルはEVのサイズ分布および濃度を決定するために提供される。サンプルは既知のサイズ及び濃度¹⁷のポリスチレンビーズでスパイクされた場合、通常動作プロトコルの隣には、別のアプローチが記載されている。このリアルタイムの較正技術は、尿、血漿および細胞培養上清のような生物学的流体、直接電気自動車を測定するときに遭遇する技術的課題のいくつかを克服するために使用することができ、または測定長期間にわたってナノポアの安定性であることができない場合確実にした。

Protocol

1。標準オペレーティング·プロトコル

1.1装置のセットアップとサンプル調製

1. インストールIZONコントロールSuiteソフトウェアを使用してコンピュータに楽器を接続します。
2. 使用するナノ細孔のサイズを選択します。サイズとEVの濃度測定NP150のために（ターゲットサイズの範囲85から300 nm）以下NP200（ターゲットサイズ範囲100から400 nm）で最も頻繁に使用されている。 220nmのフィルターを通して試料を通過させることによって、例えば、より大きな電気自動車の除去を伴うプロトコルを用いて単離されている電気自動車を操作する場合、NP100孔（目標サイズ範囲70から200 nm）を使用することができる。異なるプロトコルを使用して単離された生物学的試料または電気自動車における電気自動車を操作するときにはあまり頻繁に詰まるように、NP200を使用することができる。 （ - 600nmの目標サイズ範囲150）またはNP400 NP300などのような他のナノ細孔（目標サイズ範囲200から800ナノメートル）、あるいはさらに大きなナノ細孔は、EVの大きなタイプに使用することができる。
3. ポリスチレンcalibrを選択してくださいステップ1.1.2で選択されたナノ細孔を補完ation粒子。 NP100、NP150とNP200ナノ細孔の場合はそれぞれ、CPC100、CP100とCPC200粒子を使用する。正確なサイズの推定には、キャリブレーション粒子は未知の粒子のような同じような大きさを持っていることを確認してください。
4. キャ粒子、渦短時間（30秒）の均質性を確保するために。必要に応じて、凝集物を除去するために超音波処理を適用します。
5. 少なくとも40μlの容量で標的濃度にPBS中のキャリブレーションの粒子を希釈する。注：目標濃度は、ステップ1.1.2で選択されたナノ細孔によって異なります。標的濃度は、ナノ細孔が供給される。
6. 適用し、直接下流体セルにPBSを78μlの削除;ナノポア位置にあるときに下側流体セルに電解液を適用するときに下側流体セルのこの濡れは、ナノポアの下に気泡形成のリスクを減少させる。
7. 楽器の4腕上にナノ細孔を置きます。使用デジタルノギスは、2つの反対のアーム間の距離を測定し、「ストレッチ」入力フィールドにmm単位の距離を入力して、ナノ細孔のストレッチを校正するために「ストレッチを校正」をクリックします。
8. 低い流体セルに78μlのPBSを再適用する前に、サイドホイールを回すので、楽器の対向するアームとの間の距離を増加させることにより、47ミリメートルに、ナノポアを伸ばす。
   注：電気的干渉が実質的測定の質に影響を与えることができる。 IZONコントロールSuiteソフトウェアを実行するためにラップトップを使用する場合は、ノートパソコンが接地ソケットとプラグを使用して、電力網に接続されていることを確認してください。携帯電話はまた、電気的干渉の原因になる可能性があり、機器の近くに保った。電気的な干渉は、多くの場合、ルートを持つ平方根（RMS）ノイズ> 10 pAの平均、ベースライン電流の絶えず繰り返さピークとして観測される。
   注：ほとんどすべてのバッファがTRPS characteriための校正粒子やEVを希釈するために使用することができzation。塩の存在は、電流の確立のための前提条件である。 EV測定ではバッファーとしてPBSを使用しています。較正粒子が常に正確な測定を保証するために、電気自動車と同様の緩衝液で希釈されるべきである。

1.2。測定のための最適な設定を決定します

注：記録する前に、最適な測定設定を確立することが重要である。ナノ細孔を通過する粒子によって引き起こされる封鎖大きさが適用され、ストレッチと印加電圧に依存する。信頼性の高い測定のために、RMSノイズは0.1 nAの<10 Paとモードブロッケード大きさでなければなりません>でなければなりません。

1. ナノ細孔に上限流体セル遮蔽ケージを置き、上部流体セル内に希釈された校正用粒子40μlのをご紹介します。 ≥0.8キロパスカル陽圧を適用するためにVPMを使用してください。
2. キャリブレーションによって引き起こされる封鎖イベントを分析しながら、ゆっくりと44ミリメートルに向かって適用されるストレッチを削減粒子。注：細孔径を小さくするとナノポアを通る粒子の移動性が低くなり、したがって、粒子速度が低下する。しかし、細孔の相対的な増加遮断に大きな封鎖イベントが改善された信号対雑音比が得発生する。電圧を増加させると、さらに封鎖大きさを増加させることができるだけでなく、RMSノイズを増加させることができる。
3. 適切な封鎖イベント（ 図1c）は 「信号トレース」パネルで観察されるまで、ストレッチを減らします。 （モード> 0.1 nAの）と対応する粒子の速度は> 100 /分である。注：粒子速度がそれほど厳しくカットオフで、少なくとも500個の粒子の測定が理想的であるように、しかし、<100 /分の粒子速度は、少なくとも5分の持続時間を記録する原因となる。 （現在、サンプル希釈が行われるべき場合）2,000 /分よりも高い粒子速度はより正確な測定をもたらすことができる。

キャリブレーションの1.3測定粒子、のスーパー流体セルの洗浄とサンプル測定

1. 多形神経膠芽腫細胞株U87-MG / EGFRvIIIの細胞培養上清からのこのセクションのEVを特徴とする。これらの電気自動車の単離および調製は、先に説明し^18を可視化されている。
2. 上部流体セル内の校正粒子を配置します。 VPMとレコード> 500粒子を用いた（例えば、0.8キロパスカルのための）圧力を適用します。
3. マルチ圧力測定を行う場合には、（1.0キロパスカルまでなど）に加えられる圧力を増加させ、第2の較正ファイルを記録する。注：0.2キロパスカル差の最小値が必要になります。
4. 上部流体セルからのキャリブレーションサンプルを削除します。残留粒子を除去し、100μlのPBSで上部流体細胞を3回洗浄する。上部流体細胞内への試料の導入の前に、上部流体セルから残留PBSを除去するために、糸くずの出ないティッシュを使用しています。
5. 上部流体セルにサンプルを紹介。ベースライン電流が較正粒子を測定する場合に観察されたベースライン電流の3％以内であることを確認します。そうでない場合には3％以内、ベースライン電流を安定化するために、以下に説明戦略を適用します。キャ粒子に適用されるような正確な圧力を適用し、サンプルファイルを記録します。
   注：パーティクル率プロットは、一定の粒子検出（ 図2a）を表示する必要があります。粒子検出の突然の中断、ベースライン電流の急激な低下、またはRMSノイズの急激な増加の場合には、細孔が目詰まりすることができる。このようにして、録音を一時停止。ベースライン、タップを復元するか、シールドキャップをひねり、プランジャーを適用するか、完全にナノ細孔を除去し、脱イオン水で洗浄し、楽器でそれを交換するために。
   注：または、約5分間VPMから最大圧力との組み合わせで47ミリメートルにナノ細孔のストレッチを増加させる。

1.4データ解析

1. をクリックして「;ソフトウェアの分析セクションに入るために、データ "タブを分析します。 「未処理のファイル」と選択する「プロセスファイル」を右クリックすることでキャリブレーションし、サンプルファイルを処理します。
2. キャリブレーションの録音に結合するために「校正済み」欄にサンプルの横にあるサンプルファイルをチェックボックスをクリックします。対応するサンプルと較正ファイルを選択し、「OK」をクリックします。注：マルチ圧力校正オプションは、複数のキャリブレーション·ファイルに結合する複数のサンプルを左の「マルチ圧力キャリブレーション」タブを選択し使用した場合。
3. 一度成功した結合された、IZONコントロールSuiteソフトウェアは、このようなサイズ分布（ 図2b）、ベースラインの持続時間、半値幅（FWHM）と濃度分析などの異なるサンプルの特性を表示します。オプション：各サンプルについて、個別のデータポイントは、カンマ区切りのファイルとしてエクスポートすることができます。

2 Alternativeプロトコル - キャリブレーションビーズでサンプルをスパイク

注：単離された電気自動車を操作する場合、一般に、標準的な操作手順を使用することができる。生物学的サンプル、または大規模なタンパク質凝集物で汚染された孤立したEVの製剤中の非絶縁電気自動車を操作する場合、機器を操作することは困難な場合があります。これらの課題は、主にナノ細孔ブロッキング（ベースライン電流の急激な低下）、キャリブレーション測定または同一のサンプル（ 図3a）の間の粒子率の有意差の3％以内にベースライン電流を回復することができない率の高さで構成されています。電気自動車を定量化するための代替プロトコルこれらの問題を表示するサンプルについては^17を開発した。この方法は、目的のサンプル（ 図3b）に大きなポリスチレンキャリブレーションビーズの導入に依存している。この代替プロトコルの詳細な手順については後述する。

2.1。サンプル準備

注意：代替方法を使用してサンプルを調製する、それはまた、周囲の1のEV対ビーズ比を確立することが望まれる場合には、サンプル」のみのキャリブレーションビーズ」を含めることが不可欠である、正確な「ゲーティング」を可能にするために緩衝液中に存在する（例えば、タンパク質凝集のため）バックグラウンド粒子の数を決定するためのキャリブレーションビーズ。

1. 300×gで7分間、細胞培養上清の遠心100μlの
2. 20μlのPBSに20μlの上清を加え、75回の10μlの335 nmのポリスチレンビーズ（在庫7e10 / ml）で希釈。

2.2。サンプルの測定

1. 最適な計測器の設定を決定するために、1.2節で説明した戦略を使用してください。
2. 最初のサンプル 'のみのキャリブレーションビーズ」を測定します。小さな非ビーズ粒子のバックグラウンドの検出が可能な限り低くなっていることを確認し（ビーズの<10％）。
3. 各個別のSAを測定しますmple一度均等に異なるサンプルにわたってナノポア条件の変動を分配するために、反復を記録する前に。各サンプルの少なくとも3回の反復を測定する。
4. 全てのサンプルの記録が終了した後に「キャリブレーションビーズのみを 'サンプルを再測定。

2.3。データ分析

注：代替プロトコルを使用する場合は、IZONコントロールSuiteソフトウェアを排他的に使用が濃度計算のために十分ではない。付加的な表計算ソフトが必要となる。 表1は、図3に示すサンプルの濃度計算の例を示している。

1. 「キャリブレーションビーズのみ」のサンプルと1つ以上のサンプルファイルを開きます。
2. （nAの中で）イベントサイズがEVやポリスチレンビーズとを区別するためのカットオフとして使用することができる封鎖決定する。ポリスチレンビーズ集団の左ベースに対応する封鎖値（NA）を決定する（ 図3b）。注：すべての測定値のビンのサイズの等しい設定を確認します（「個人ブロッケード·トレース」下の「ポップアップ」ボタンをクリックしてアクセスされる「ViewSettings」で調整することができます）。
3. 試料の「粒子解析の概要」タブをクリックすることで各サンプルの総粒子数の値を取得します。
4. ステップ2.3.2で決定したカットオフレベルを使用してデータセットをフィルタ処理する。 「データのフィルタリング」ポップアップを選択することによって。表示のみのカットオフよりも小さい粒子。
5. 「粒子解析の概要」から各サンプルについて、EV·カウントの値を取得します。
6. キャリブレーションビーズの量を決定するために、総粒子からEVの量を引きます。
7. キャリブレーションビーズカウントでEV数を割ることによって、EV対ビーズ比を決定します。
8. 各＆について決定比率を平均して平均バックグラウンド比を決定する＃8220;唯一の "キャリブレーションサンプルをビーズ。各個別のサンプルからこの値を引きます。
9. 各サンプルの電気自動車の濃度を決定するためのキャリブレーションビーズの濃度によって調整されたEV対ビーズ比を乗算する。
10. EVサンプルにキャリブレーションビーズを添加することによって導入されたEV希釈係数によってステップ2.3.9に見られる濃度を掛ける。注：例サンプルセットアップでは、PBSおよびキャリブレーションビーズ中の試料の全希釈は2.5倍であり、従って、ステップ2.3.9に見られる濃度は、生のEVの試料濃度を決定するために2.5を乗じれるべきである。
11. そのような平均、標準偏差およびレプリケートの各グループの平均値の標準誤差などの統計を計算します。
    注：いくつかのケースではEVやスパイクポリスチレンビーズ間で重複が観察される。 EV濃度の過小評価のための補正が必要な場合、スパイクされたポリスチレンビーズなしの試料は、測定されるべきである。同じカットを使用してくださいスパイクされたポリスチレンビーズの範囲内EVの比を計算するために、「ビーズ対EV」比を決定するステップ2.3.2で決定されるようにオフ。このビーズ対EV比率はステップ2.3.8で決定し、EV対ビーズ比に追加する必要があります。

2.4。オプション：別の方法を使用して、EV径分布。

1. コントロールSuiteソフトウェアで二度記録したサンプルを開きます。
2. 上記決定されるカットオフよりも大きいだけ表示粒子への試料の一つのフィルタオプションを設定します。これは、キャリブレーション粒子が表示されます。
3. 「キャリブレーションファイル」を濾過した試料を設定し、キャリブレーションビーズのモードサイズを入力してください。
4. カップルサンプルファイルおよび1.4.2で説明したようにステップ2.4​​.3で作成した「キャリブレーションファイル」。サンプルファイルは現在、スパイクされたキャリブレーションビーズに基づいてEVやキャリブレーションビーズの両方のサイズ分布が表示されます。
   注：標準のオペラティンプロトコルは、ほとんどの場合、EVのサイズ分布を決定するために十分であろう。時には、しかし、正確な緩衝液成分は不可能興味のある電気自動車と同じ緩衝液中にキャリブレーションビーズのサンプルを調製することを可能にするどの（血漿または尿中など）未知である。較正粒子でスパイクEVサンプルは、これらの特定の条件でEVサイズ推定のために使用することができる。

Results

のTRP器具を使用するには、非導電性ナノ細孔は、マシン（ 図1a）の4腕の上に配置する必要があり、電圧（ 図1b）が適用されなければならない。電気ベースライン電流が確立されると、図1cに示されるように、細孔を通過する粒子に起因する抵抗のパルスが検出される。

電気自動車は、超遠心分離による神経膠芽腫細胞株U87-MG / EGFRvIIIの細胞培養上清から精製した。 NP100のナノ細孔に孤立した電気自動車（ 図2a）を測定する際に安定な粒子速度プロットが観察される。この安定した粒子速度プロットは、信頼性のEV濃度測定のために必要とされる。 115nmのポリスチレンキャリブレーションビーズの記録への録音EV-サンプルのペアリングした後、粒度分布（ 図2b）とEV-サンプルの濃度の推定値を得ることができる（データは示さず）。

（Figrue 3aの ）変動をもたらす。これは、不正確なEV濃度の推定をもたらす。既知の濃度およびサイズのポリスチレンビーズでサンプルをスパイクすることによって、EV対ビーズ比を決定することができる。 図3bは、サイズが 335ナノメートルのポリスチレンビーズを細胞培養上清をスパイクした後に得られた結果を示している。二つの明確な集団が観察される。少ないし、0.46 nAの体の遮断を誘発する粒子はより大きな粒子は、ポリスチレンビーズを決定し、決定した電気自動車である。ポリスチレンビーズに対するEVの比は、電気自動車（ 表1）の原料濃度を計算するために使用される。 図3cは、スパイクされたポリスチレンビーズに基づく2つの集団のサイズ推定を示す図である。再使用されるナノ細孔のセットアップサイズの電気自動車> 140nmの検出においてsulted。これは、ナノポア開口部を減少させることによって低下させることができるが、これはまた、より詰まり事象をもたらすであろう。

図1：qNano機器と動作モード。 （A）装置の写真。ナノポアは、上部流体セルから低い流体セルを分離する、器具上に位置決めされる。流体セルは、遮蔽キャップによる環境の電気的干渉から保護されています。（B）イラストチューナブル抵抗パルス検出（TRPS）を概説する。非導電性弾性ナノ細孔は、2つの流体細胞を分離します。電圧を印加して電流がナノポアにパンクチャ細孔を介して確立される。細胞外小胞がナノポアを移動すると、イオンの流れが変更され、抵抗性のパルスとして検出される。のTRPにナノポアの開口寸法は、器具の対向するアームの間の距離を増大するか、この距離を減少させることにより、ナノポアを延伸することにより（減少または増加）を調整することができる。（C）、抵抗パルスの具体例。単一の抵抗パルスの大きさは、粒子の体積に比例する：より大きなパルスが大きな粒子を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：粒子カウントプロットとU87-MG / EGFRvIIIの細胞培養上清から分離された電気自動車の測定から得られたサイズ分布全体の一定の粒子検出を示す（A）粒子カウントプロット。粒子フィルタの簡単な減少ルの検出は、記録の80と100秒の間で観察された。録音を一時停止し、シールドキャップをタッピングした後、粒子速度は、記録が再開された。（B）単離されたEVのサイズ分布は、115 nmのポリスチレン較正ビーズに未知試料（電気自動車）を校正した後にプロットした後に安定化した。 （5nmのビンサイズ）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：代替プロトコルを用いて細胞培養上清中のEVのTRPを定量化。 （A）生物学的流体中に直接電気自動車を測定したときに得られる典型的な粒子速度のプロット。細孔の目詰まりは、粒子検出率の短い中断や変動の原因となる。それぞれプロットは、同じサンプルの複製の測定値を表す。（B）335 nmのポリスチレン較正ビーズを細胞培養上清をスパイクした後に得られる3つの複製のサイズ分布のグラフ。 0.46未満の抵抗nAのパルスを誘導する全ての粒子が電気自動車として選択される。（C）スパイクされたポリスチレンビーズは、サンプルのサイズ分布を得るために用いることができる。 （5nmのビンサイズ）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

測定	キャリブレーションのみで第1位	キャリブレーションのみ＃2	上清＃1	上清＃2	上清＃3
平均電流（NA）	117	120	116	118	120
粒子速度	172	194	250	246	196
カットオフ使用（NA）	0.46	0.46	0.46	0.46	0.46
総粒子	303	317	489	488	454
細胞外小胞	3	1	213	215	213
スパイクのキャリブレーションビーズ	300	316	276	273	241
電気自動車/キャリブレーションビーズ	0.01	0.003	0.772	0.788	0.884
サンプル - バックグラウンド			0.765	0.781	0.877
Extracelullar小胞（10 7）/ mlの			7.14	7.29	8.18
サンプル2.5倍に希釈
生の濃度電気自動車（10 7）/ mlの			17.85	18.22	20.46

表1：代替プロトコルを用いてEV濃度の計算例カットオフ値は、キャリブレーションビーズから電気自動車を区別することが決定される。続いて、EVやビーズの総数は、検索することができる。測定毎にEV対ビーズ比を算出する。 （例えば、タンパク質凝集のため）、電解質中のバックグラウンド粒子の量は、「キャリブレーションビーズのみ」試料の個別の測定のためのEV対ビーズ比を平均することによって計算される。各サンプルについてバックグラウンド比が得られる比から減算される。このadjuste（：9.33e7 / mlのこの例では）d比は、サンプル中のキャリブレーションビーズの濃度が乗算される。 EVの生の濃度を決定するために、得られた濃度は、（：2.5この例では）総電気自動車の希釈率を掛けている。

Discussion

定量化とのTRPを使用して、電気自動車の大きさの特徴付けのためにこの原稿募集の方法論に記載されているプロトコルを。のTRPプラットフォームの主な利点は、小さなサンプルサイズ、比較的短い測定時間と必要なサンプル操作の欠如である。

正確なのTRP測定のための前提条件は、校正とサンプルの測定値の間で同一の条件を維持することです。これは、同一のバッファの使用方法ならびにそのようなナノ細孔の大きさ、電圧、印加された圧力と同一の機器の設定を包含する。オリジナルのVPMは、それによって、サンプル間の印加圧力のわずかな違いを引き起こし、加えられた圧力の正確な設定のためのメカニズムを欠いている。異なる時点で測定したときにも、VPMにおけるプライミング液の蒸発はわずかな圧力差を誘発することができ、VPMは、したがって、多くの場合、再プライミングされるべきである。これらの制限は、潜在的にVPM2の導入によって解決されているクリックベースのスケーリングを有し、空気圧基づいている。

この原稿に記載されて代替プロトコルは、非精製された生物学的サンプル中¹⁷ EVの測定に特に適している。私たちは、例えば、糖、脂質、タンパク質および他の大きな破片などの緩衝成分は、いくつかの場合に適用可能にする標準プロトコルのためのあまり測定条件に影響を与えることができると考えている。 2個別の測定値を比較するサンプルにキャリブレーションビーズを添加するというよりは、「リアルタイム·キャリブレーション」を紹介します。異なるおよび/ ​​または未知の流体背景含量を有するサンプル（異なるドナーの、例えば血漿）を比較する場合は、この方法が特に適している。違いはEVやポリスチレン粒子（ 例えば、粒子密度及び表面電荷）との間に存在するが、理論モデルならびに実験データは、EVの定量化およびサイズプロファイリングのためのポリスチレンビーズの有用性を強調するかなりの圧力が^15,19適用されていることを前提条件の下で。動電力の影響を最小限に抑えるために、比較的大きなNP150 / NP200のナノ細孔と有意な正の圧力の使用が推奨されます。

EVやキャリブレーションビーズは大きさによって区別される。したがって、ナノポアは、EVや大きな校正粒子の両方の検出が観察される直径に、ストレッチを適用することによって開かれなければならない。気孔の開口部が、より小さい粒子に対する感受性が減少するので（335 nmのキャリブレーションビーズを使用する場合>しばしば電気自動車120 nm）を、特定のサイズよりも大きいのみ電気自動車が記録される。電気自動車の最小検出限界は、NP150のナノ細孔に203 nmのキャリブレーションビーズを用いて、90nm程度まで小さくすることができる。より大きな電気自動車のナノ細孔を頻繁に目詰まりを誘発しかし、このセットアップは実行不可能かもしれません。これらの妨害EVの存在はどこにレアには小さすぎるEVの人口、セットアップの利用を強制することが検出閾値をCHであり、検出されません。

サイズが100nm未満の粒子を測定しようとすると、システムを操作する困難さは増大する。このような場合において、検出は、電解質の塩濃度を増加させることによって改善することができる。増大したイオン濃度は、小さな粒子（より大きな信号対雑音比）が相対的に増加封鎖大きさを誘導する。 EVの測定のためのこの技術の実行可能性が増加塩濃度は、EVの容積に影響を与える可能性がある、しかし、検証されなければならない。

結論として、TRPをプラットフォームは、EVの直接定量およびサイズ​​特徴付けのために使用することができる。全く隔離またはEV操作（抗体結合または蛍光標識）が必要ないので、プラットフォームは生物学的液体中の直接のEV定量化に適しています。代替プロトコルは、緩衝液成分が有意な細孔clogginを誘導サンプルのために有益であり得るが提供される実行不可能な標準プロトコルの信頼性の高い使用率を作るグラムイベント。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
qNano instrument	Izon Science Ltd.	N/A
可変圧力モジュール	Izon Science Ltd.	N/A
Nanopore	Izon Science Ltd.	NP100、NP200	ナノポアの選択肢は、ターゲット粒子によって異なります。さまざまなターゲットサイズに対して、さまざまなナノポアが利用可能です。
キャリブレーション粒子	Izon Science Ltd.	CPC100、CPC200、CPC400	キャリブレーション粒子は、さまざまなサイズで利用できます。
超音波処理槽	複数利用可能		基本的な超音波処理槽で十分です
(ミニ) ボルテクサー	複数の利用可能な
リフトフリーティッシュ	複数の利用可能な
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)	複数の利用可能な
Windowsベースのコンピュータ
Izon Control Suite 2.2	アイゾンサイエンス(株)	N/A
スプレッドシートソフト	複数可	N/A