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方法論記事

組み合わせたDNA-RNA蛍光

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DOI:

10.3791/51628

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2014年6月14日

 , 
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

この記事について

サマリー

in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光は、細胞内でのそれらの天然環境中の核酸の検出を可能にする。ここでは、マウス胚性幹細胞におけるX染色体不活性化を研究するために使用することができるFISHによるRNAおよびDNAの合成、同時検出のためのプロトコルを記載している。

要約

in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光は、細胞中の核酸の検出を可能にする分子技術である。 DNAのFISHは、多くの場合、細胞遺伝学および癌の診断に使用され、多くの場合、重要な臨床的意義を有するゲノムの異常を検出することができる。 RNA FISHは、細胞内でRNA分子を検出するために使用することができ、遺伝子発現の調節において重要な洞察を提供した。同じセル内でDNAとRNA FISHを組み合わせることにより、DNAのFISHに適した条件が壊れ、一本鎖RNA分子に対する厳しすぎるかもしれないような、技術的に困難である。ここでは、X染色体にコードされるのXist RNAとDNAの複合、同時検出を可能にし、容易に適用可能なプロトコルを提示する。この結合されたDNA-RNA FISHプロトコルは、おそらくRNAとDNAの両方を検出する必要がある他のシステムに適用することができる。

概要

蛍光in situハイブリダイゼーション （FISH）を用いて細胞や組織を研究することは、1、1970年代後半に導入されて以来、細胞内レベルでのクロマチン組織と遺伝子発現、研究者は遺伝子を研究することができました。 DNAのFISHは、しばしば細胞遺伝学、核型2、癌診断3と着床前遺伝子検査4で使用され、それはそれらの天然環境中の核酸の検出を可能にするので、分子の研究5-6において重要な役割を有している。 RNA FISHによる単一細胞発現解析は、天然の一次転写産物を検出することができるし、非コードRNAは、染色体から転写され、例えばを含む集団レベルでの遺伝子発現を評価する他の技術に利点を提供する定量的RT-PCR、ゲノムワイド発現分析またはノーザンブロッティング。それらの起源部位から直接由来するRNA転写産物を可視化することにより、例えばあった遺伝子発現は7確率的であり、時には8対立遺伝子特異的であることができることに気づいた。技術の改善はあっても、細胞9月11日内の単一mRNA分子の検出および定量を可能にした。

FISHの基本原理は非常に特異的ワトソンとクリックの塩基対形成によって、核酸プローブに細胞内の核酸のハイブリダイゼーションで構成されています。プローブは、顕微鏡的に可視化することができるシグナルを生じる、直接的または間接的に検出することができる。最初の試みは、安全性の問題、制限された空間分解能と時間12月14日に1つだけの標的を検出する能力に基づいて欠点を持っていた放射性標識プローブ、から構成されていた。蛍光色素、ハプテン、および酵素などの非放射性標識のその後の開発は、ルーチン的な分子生物学技術としてFISHの普及使用を可能にした。 FISHプローブは、直接的fluorochで標識することができる核酸の蛍光分子の化学結合によるromes 15及び蛍光標識ヌクレオチドの組込み16-19配列、またはプローブを間接的にコンジュゲートしたハプテン特異的抗体によって（ビオチンおよびジゴキシゲニンを含む）ハプテンの統合およびハプテンの免疫学的検出の後に可視化することができる蛍光レポーターは、20〜21の分子が含まれる。後者のアプローチは、元の信号を増強するために使用される蛍光標識された抗体のいくつかの層を用いてシグナル増幅を可能にし、低レベルで発現されるRNA種の検出を可能にする。直接的および間接的な標識技術および種々のハプテンを組み合わせることによって、いくつかのターゲットが同時に同じ細胞内で可視化することができる。

FISHプロトコルにおける最も重要な工程の一つは、その標的へのプローブのハイブリダイゼーションである。理論的には、プローブは、具体的には、実際には、唯一のその標的へのこの特異的に結合するであろうがプローブは相同領域に結合すること、およびハイブリダイゼーション条件は、常に特定のDNA領域またはRNA種のための理想的ではないでしょう、いつものように、達成されない。それらはFISH手順のストリンジェンシーを増加させることができ、背景雑音の高レベルをもたらすFISHプローブの非特異的結合を防止することができるように、ハイブリダイゼーション後の洗浄は、したがって、特に重要である。 RNA分子は、一本鎖されると、それらは容易にFISHプローブにハイブリダイズすることができる。対照的に、二本鎖DNA分子は、第一プローブがハイブリダイズすることができ、その後の変性工程を必要とする。これは、通常、DNAの変性をもたらす試料の加熱によって達成される。しかし、これらの過酷な条件下では、壊れやすい、一本鎖RNA分子が失われる可能性があります。したがって、合わせたDNA-RNA FISH条件の有意な最適化を必要とし、唯一のRNAまたはDNAの分離検出と比較して、より技術的に困難である。

ここでは、プレゼン私たちは、雌マウスの胚性幹細胞の22〜24の差別化X染色体の不活性化（XCI）を研究することができました組み合わせて、同時DNA-RNA魚TA詳細なプロトコル。 XCIは、女性の胚発生25のために重要なエピジェネティック機構であり、ヘテロクロマチンをもたらし、ひいては女性の個体では2本のX染色体の1 26〜27のサイレン。このプロセスに不可欠RNF12 22〜23とREX1 24タンパク質によって制御されている非コードRNAはXistの 28〜30は 、ある。Xistの発現は、胚発生中またはin vitroでのES細胞の分化の際に、将来の不活性X染色体（XI）にアップレギュレートになる、およびX染色体に沿って広がり、それによってX染色体31の転写シャットダウンするクロマチンリモデリング酵素を引き付けることができる。このXistの RNAの広がりは、X染色体のコーティングとしてRNA FISHによって可視化することができるいくつものXist雲とも呼ばれる。女性のES細胞は、ゲノム不安定性に起因し、そのX染色体の1を失う可能性がありますので、他は唯一の核型、安定した細胞は、この重要なプロセス22,32の分析で評価していることを確認するために、XCIを研究するために結合するDNA-RNA魚を採用している-34。すべての分子生物学技術と同様に、いくつかの異なるプロトコルが優れた35-38を公開されている。ここでは、プローブのハイブリダイゼーション、透過処理およびその後のプローブの取り込みを可能にするために、マウスES細胞、細胞の固定、ニックトランスレーションによるFISHプローブを標識する、固定された細胞の前処理における分化誘導から始めて、我々の方法を提示ターゲット、そして最終的に蛍光標識した抗体によるプローブの検出。プロトコルは提示され、ここには2日間の期間内のXist RNA及びX染色体の忠実な検出を可能にし、この技術の基本はそうOTに適合させることができる彼女のシステムや研究の分野。

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プロトコル

1。女性の胚性幹細胞における分化の誘導X染色体の不活性化を誘導するために

注：（ご要望に応じて入手可能）雌マウスの胚性幹細胞は、マウス胚線維芽細胞（MEFに）でコーティングされたゼラチン化培養皿上で、標準的なES細胞条件下で増殖されています。ここでは、読者は、標準的な細胞培養技術39〜41に精通していることを前提としています。分化を誘導するために、T25皿中で増殖させたES細胞は、MEFのから分離され、分化培地にプレーティングする。

  1. ES細胞培養からES培地を外し、細胞培養、PBSで2回洗浄します。
  2. 1.5ミリリットルのトリプシン-EDTAを（37℃に予め温めておいた）を追加し、7分間37℃で細胞をインキュベートする。 3.5分後、コロニーを分割する優しく料理を振る。
  3. 細胞への分化培地の3.5ミリリットルを追加することにより、トリプシン-EDTAを不活性化する。上下にピペット細胞は、単一細胞溶液を取得し、収集する15mlチューブ中。 200×gで5分間スピンし、分化培地10ml中で細胞を集める。
  4. 非ゼラチン化培養皿に細胞懸濁液を追加し、細胞培養インキュベーター中で1時間インキュベートする。注：ES細胞懸濁液中に残るのに対し、MEFのは、非ゼラチン化培養皿に接着することができるようになります。
  5. 一方で、6ウェルプレートに滅菌したガラスカバースリップ（24×24 mm）を追加し、0.2％ゼラチンを追加し、室温で最小5分間インキュベートする。
  6. 1時間後、主に非接着ES細胞からなるであろうプレめっきES細胞培養物の上清を回収。カバーグラスを含有する6ウェルプレートにプレートES細胞。注：使用⅙6ウェルプレートの6ウェルについてコンフルエントT25皿の目 。これはよく分化の3日後にコンフルエントの差別化を可能にする。日常的にメディアを変更します。長い分化タイムコース、細菌皿で分化培地中でプレート事前メッキES細胞、およびincub用細胞培養インキュベーター中に組み込ま細胞シェーカー上で食べた。これは、細胞が1〜2日前固定をカバーグラスにメッキすることができる胚様体を形成することができます。

その後、DNA-RNA FISH分析のための分化したES細胞の2。固定

  1. 分化培養物から分化培地を外し、細胞培養、PBSで2回洗浄します。注：細胞は洗い流されるのを防ぐために慎重にPBSを追加します。
  2. 細胞培養PBSを除去し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）/ PBSを加えることによって細胞を固定し、室温で10分間インキュベートする。注意：PFAは毒性があり、吸入する場合や、皮膚や目に接触した時に重大な健康リスクを引き起こす可能性があります。さらに、PFAは発がん性がある。
  3. 4％PFA / PBSを削除し、70％エタノールでカバースリップ3回洗う。注：PFAの痕跡は、後続のFISH手順を妨害するように正しい洗浄が重要です。カバースリップの前にF数カ月間-20℃で70％エタノール中で保存することができるISH解析。

FISH実験のためのDNAプローブの3。の標識

注：目的の遺伝子のDNA断片を得る（RNA FISHのための最小限の長さ> 2キロバイト、またはDNA魚> 20キロバイト）、あるいは目的の遺伝子をカバーするBAC。 RNA検出のために、小さなプローブが最も可能性の高い転写を同時に検出することができる、複数の転写をもたらすので、DNAの検出と比較して十分であることができる。単一コピーDNA鎖上の強い信号は、より長いプローブは、組み込まれたハプテンの十分な数を検出することができるように、必要とされる。好ましくは、非転写ゲノム領域を、DNAプローブを設計するために選択される。 RNAを検出するための小さなプローブを使用する場合に加えて、これは完全に排除できないが、RNAが転写されたゲノム遺伝子座を合わせ、DNA-RNA FISH法で検出されることが防止される。マウスXistのを検出するために、5.5キロバイトのcDNAプローブを用いた。 DET用X染色体のECTION、いくつかのBACプローブを使用することができる。良好な結果がのXist遺伝子座のすぐ近くに位置していたBAC RP23-100E1およびBAC CT7-474E4、の混合物で得られている。目的の遺伝子や染色体に応じて、いくつかの異なるプローブが最適な結果を得るために必要とされる場合があります。たびに、滅菌フィルターチップを使用し、RNA-FISHのために使用される材料を扱う、RNA分解酵素フリーのH 2 O、およびクリーンな環境で動作します。

  1. 1μgのDNAを取り、16μlの全容量を H 2 Oに希釈する。ジゴキシゲニンまたはビオチン標識液4μl加え（試薬を参照）、ボルテックスで混和し、90分間16℃でインキュベートする。注：ビオチンまたはジゴキシゲニン標識ヌクレオチドは現在、ニックトランスレーションによって組み込まれます。
  2. 一方、非統合型ヌクレオチドを​​除去するためにG50の列を用意しております。 、2ミリリットルの注射器を取るスタンパーを削除し、シリンジに滅菌綿を追加します。解TにG50ボールを追加O 1分間642×gで15ミリリットルチューブおよび遠心分離器で注射器を配置し、注射器を埋める。注：注射器の約80％が現在、G50で埋めなくてはなりません。少ないG50が存在するときに繰り返します。
  3. 90分後、ニックトランスレーション反応混合物に、H 2 Oを40μLを追加し、G50カラムへの反応を追加します。列の下にある空のチューブを追加し、2分間642×gで遠心する。反応チューブ内を通る流れを集める。
  4. ピペットで通る流れの体積を測定し、総容量200μlに到達するために、H 2 Oを加える。 13.3μlのサケ精子DNA（10 mg / ml）を、13.3μlの酵母tRNA（10 mg / ml）を、26.7μlのマウス用ベッド-1 DNA（1 mg / ml）を28μlの2 MのNaAc、pHを添加することによって通る流れを沈殿させる5.6。ボルテックスで混和し、533μLの氷冷100％エタノールを加える。 4℃で30分間16200×gでチューブ、遠心分離を振る
  5. 上清を除去し、70％エタノールで2回ペレットを洗浄。で5分間16200×gで遠心分離4℃、空気ペレットを乾燥する。 50 +ハイブリダイゼーション溶液の50μlを加えて、溶解を容易にするために30分間37℃でインキュベートする。 NOTE：標識プローブは、-20℃で数年間保存することができる注意：50 +ハイブリダイゼーション溶液は、毒性があり、皮膚、目や呼吸器系を刺激することができ、また、催奇形物質であるホルムアルデヒドが含まれています。

4。透過処理、複合DNA-RNA魚固定した細胞の前処理及びハイブリダイゼーション

  1. 70％エタノールおよび6ウェルプレートに細胞培養PBSの添加を除去することにより、カバースリップ上に固定した細胞を再水和する。 5分間インキュベートします。合計3回繰り返します。
  2. 細胞培養、PBSを外し、6穴プレートに0.2％のペプシンを加え、細胞を透過する。 4分間37℃の水浴中で6ウェルプレートをインキュベートする。ペプシンを削除し、RNA分解酵素フリーのH 2 Oで不活性化する
  3. 室温で5分間、4％PFA / PBSでインキュベートすることにより接尾細胞。 fixati後に上で5分間、細胞培養をPBSで2回洗浄する。
  4. 3分間、3分間、3分間、100％エタノール、90％エタノール、70％エタノールでインキュベートすることによって細胞を脱水する。転送は、6ウェルプレートのうちカバースリップ、数分間空気乾燥したカバースリップ。
  5. 熱板上で1時間65℃でカバースリップをインキュベートすることによって、年齢細胞。
  6. 、分析しようとするすべてのカバースリップのために一緒に追加することにより、マウスCOT-1 DNAとFISHプローブをプレハイブリダイズ50 +ハイブリダイゼーション溶液25μL、0.5μLマウスCOT-1 DNA、ビオチン標識のXistプローブの1μLおよびジゴキシゲニンの1μL X染色体を検出するラベルされたBACプローブ。ボルテックスで混和し、5分間99℃で変性する。プローブ中に存在する配列を繰り返すようにハイブリダイズする簡易ベッド-1 DNAを可能にするために、45分間37℃で直ちにインキュベートする。
  7. 熟成後、スライドガラス上に（SSC/10 10mMのリン酸緩衝液formamide/2x 70％からなる）変性緩衝液50μlをスポットし、細胞がtowarに対向して上にカバースリップを置く変性緩衝DS。 2分間65℃でインキュベートする。
  8. 5分間氷冷70％エタノール中でインキュベートすることによってバック6ウェルプレートにカバースリップ、およびポストフィックスセルを追加する。
  9. 3分間、3分間、3分間、100％エタノール、90％エタノール、70％エタノール中に後続のインキュベーションによって細胞を脱水する。 6ウェルプレートからカバースリップを外し、数分間空気乾燥してみましょう。
  10. スライドガラス上に事前にハイブリダイズしたプローブを見つけ、その上にカバースリップをインキュベートする。場所のSSC formamide/2x 50ミリリットル50パーセントで満たされた加湿チャンバー内にスライドし、37℃で一晩インキュベート

5。ハイブリダイゼーション後の洗浄およびプローブの抗体仲介検出

  1. 2×SSCで6ウェルプレートに充填し、前加温42℃まで一晩のインキュベーションの後にカバースリップを追加し、5分間42℃でインキュベートする。
  2. 2×SSCを取り外し、42℃で10分間50％formamide/2x SSCでカバースリップをインキュベート合計3回（全部で洗浄30分）に繰り返します。
  3. SSC formamide/2x 50％を削除して、室温で2×5分間トリス生理食塩水 - ツイーン（TST）でスライドを洗浄します。
  4. スポット50μlの新しいスライドガラス上カバースリップあたりのトリス - 生理食塩水-BSA（TSBSA）し、TST加湿暗室において室温で30分の間に遮断するための上下を逆にカバースリップをインキュベートする。
  5. 転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。
  6. 新しいガラススライド上にスポットカバースリップあたりのヒツジ抗DIG抗体（TSBSA中1:500）を50μl、およびTST加湿暗室において室温で30分間の最初のインキュベーション工程のためのカバースリップの逆さまをインキュベートする。
  7. 転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。
  8. スポット50ウサギ抗ヒツジ新しいガラススライド上にカバースリップあたりFITC（TSBSA中1:250）と結合した抗体液、およびTST加湿暗室中、室​​温で30分間の第2のインキュベーション工程のために逆さまカバースリップを下にインキュベート。
  9. トランスFERはバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。
  10. スポット50新しいガラススライド上にカバースリップあたりFITC（TSBSA中1:250）と結合したヤギ抗ウサギ抗体液、およびTST加湿暗室中、室​​温で30分間の第三のインキュベーション工程のために逆さまにカバースリップをインキュベートする。 。
  11. 転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。
  12. スポット50の新しいスライドガラス上カバースリップあたりのマウス抗ビオチン抗体の液（TSBSA中1:200）とTST加湿暗室において室温で30分間の第四インキュベーション工程のために逆さまにカバースリップをインキュベートする。
  13. 転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。
  14. スポット50新しいガラススライド上にカバースリップあたりローダミン（TSBSA中1:250）と共役ロバ抗マウス抗体μlの、および逆さまTST加湿暗CHAMB中、室温で30分間の第五のインキュベーション工程のためにカバースリップをインキュベートするER。
  15. 転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。
  16. スポット50の新しいスライドガラス上カバースリップあたりローダミン（TSBSA中1:250）と結合したヤギ抗馬の抗体のμL、およびTST加湿暗室において室温で30分間の第六のインキュベーションステップのために逆さまにカバースリップをインキュベート。 NOTE：ヤギ抗ウマ抗体は、ロバ抗マウス抗体を認識するであろう。とき研究者が利用できる、ヤギ抗ロバ抗体も同様に動作します。
  17. 転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。トリス生理食塩水（TS）でさらに5分間洗浄します。
  18. 3分間、3分間、3分間、100％エタノール、90％エタノール、70％エタノール中に後続のインキュベーションによって細胞を脱水する。 6ウェルプレートからカバースリップを外し、数分間空気乾燥してみましょう。
  19. スライドガラス上に（試薬を参照）DAPIで封入剤のドロップを見つけ、その上に逆さまにカバースリップを追加します。マニキュアでスライドをシールし、蛍光顕微鏡によってFISH結果を評価（ 図1）。

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結果

合わせたDNA-RNA FISHのための上述したプロトコルを用いて、我々は、女性の胚性幹細胞を分化におけるX染色体不活性化を可視化することができた。1は、我々 は Xistの （あるの両方を検出したDNA-RNA FISH実験の代表例を示す図不活性X染色体上のいわゆるのXist RNAの雲とアクティブX染色体上の基礎転写ピンポイント）と、ピンポイント信号として表示されているX染色体の領域として見える。それによってXistの雲が実際に沿って局在化、およびX染色体を被覆していることを示す、ピンポイント信号のいずれかがXistのクラウド内に配置されている。細胞の99％以上では（データは示していない）正しいDNAシグナルを我々のプロトコルを使用して検出する。 RNA-FISHと比較して、Xistの雲が組み合わされ、DNA-RNA FISH法を用いて可視化変性したDNAが大きな面積を占めるように見えるように、時には大きく見える。私たちは、OBを持っているヒト...

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ディスカッション

DNAの魚に適した条件が少なく、安定したRNA分子のためにあまりにも過酷なように組み合わせたDNA-RNA FISHは、技術的に挑戦することができます。いくつかのアプローチは、DNAおよびRNAの両方を検出するプローブとの同時インキュベーションの必要性を回避し、同じ細胞においてDNA及びRNAの両方を研究するために適用されている。例えば、重畳アプローチにおいて、最初のRNA FISHが行われ、細胞が撮像され、その座標が取られる。その後、同じスライドをRNA FISHの信号が失われている間、DNA FISHのために使用される。 DNA FISH後、細胞を再び撮像して、RNAおよびDNA FISHの両方から得られた画像が重畳される。固定した細胞のDNAは安定しており、初期のRNA FISHのために必要な処置によって影響を受けないように、このアプローチは、ほとんどの場合では使えますが、これは、少なくとも4日間の費用がかかりますが非常に手間のかかるアプローチです。別のアプローチでは、第一のRNA FISHが行われ、RNAのFISH信号はoを添加することによって固定されているDNAのFISHを適用した後のfの固定剤、。また、このアプローチは動作...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

著者は、過去数年間のエラスムスMCの生殖開発部門の過去および現在のメンバー全員に感謝します。また、有益なフィードバックを提供してくださった 3 人の匿名のレビュアーにも感謝します。Gribnau研究室での研究は、オランダの研究評議会(NWO-VICI)からの資金提供とERCの設立助成金によって支えられています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
雌マウス胚性幹細胞は、
E13.5胚から、または商業的なソース例えばミリポア
DMEM、15%ウシ胎児血清、100 U/mlペニシリン、100 mg/mlストレプトマイシン、非必須アミノ酸、0.1 mM γ-メルカプトエタノール、および1,000 U/ml LIF。フィルター滅菌し、4°で保管します。Cは最大2週間。
LIFChemiconESG1107
DMEMInvitrogen11960085
Fetal Calf SerumInvitrogen10099141
Penicillin–ストレプトマイシン (100x)Invitrogen15140-122
非必須アミノ酸Invitrogen11140-050
γ-メルカプトエタノールSigma-AldrichM7522
ES 細胞分化培地IMDM-Glutamax, 15% 熱不活化ウシ胎児血清, 100 U/ml ペニシリン, 100 mg/ml ストレプトマイシン, 非必須アミノ酸, 37.8 μl / Lモノチオグリセロールおよび50μg/ml アスコルビン酸
IMDM-GlutamaxInvitrogen31980-030
アスコルビン酸 (50 mg/ml)Sigma-AldrichA4403
モノチオグリセロールSigma-AldrichM6145
T25 細胞培養皿Greiner Bio-one690160
6-well 細胞培養皿Greiner Bio-one662160
細胞培養グレード PBSSigma-AldrichD8537
トリプシン-EDTA 0.25% (v/v) トリプシン/0.2% (w/v) PBSの EDTA Gibco25200-056
ファルコンチューブファルコン352196
24 x 24 mm カバースリップMenzle780882
ゼラチンSigma-AldrichG1890-100G0.2% ゼラチン/細胞培養 PBS 溶液を準備し、オートクレーブ
PepsinSigma-AldrichP70000.01 M HCl (pH 2.0)で0.2%に希釈
絶対100%エタノールSigma-Aldrich32221-2.5L絶対100%エタノールとRNAseフリー水を使用して70%および90%エタノール溶液を作る
バクスターTKF7114
滅菌フィルターチップレイニンバイオクリーンGP-L10F、GP-L200F、RT-1000F
ジゴキシゲニンラベリングキット(DIG-Nick翻訳)ロシュ11745816910
ビオチンラベリングキット(ビオチンニック翻訳)ロシュ11745824910
セファデックスG50グマアルドリッチG5080
2mlシリンジBDプラスティパック300013
滅菌綿
エッペンドルフチューブエッペンドルフ
酵母 tRNA 10 mg/mlInvitrogen15401-029
サケ精子 DNA 10 mg/mlInvitrogen15632-011
マウスベビーベッド-1 DNA 1 mg/mlInvitrogen18440-016
エッペンドルフベンチトップ微量遠心分離機EppendorfModel 5417R
Eppendorf 冷蔵遠心分離機Eppendorfモデル 5810R
2 M NaAc、pH 5.6Sigma-AldrichS7670
50+ ハイブリダイゼーション溶液50% ホルムアミド、2x SSC、50 mM リン酸緩衝液 pH 7、10% デキストラン硫酸塩 pH 7
ホルムアミド Acros 有機物3272350000
デキストラン硫酸Fluka31403
10 mM リン酸緩衝液、pH 757.7 mLの1 M Na2HPO4と42.3 mLの1 M NaH2PO4を追加します。DEPC 処理水およびオートクレーブ
変性緩衝液70% ホルムアミド/2x SSC/10 mM リン酸緩衝液 pH 7
Tween-20Sigma-AldrichP2287
2 M Tris pH 7.5 溶液
Tris-saline-Tween 洗浄液 (TST)100 ml 10x 生理食塩水、50 ml 2M Tris、500 μl Tween-20、1 L
10x生理食塩水85 gのNaClを1 L RNAseフリーH2Oに溶解
Tris-saline-BSA(TSBSA)500 μl 10x生理食塩水、250 μl 2 M Tris、1 mL 100x BSA、3.25 ml RNAse フリー H2O
BSA、精製、100xNew England BiolabsB9001S
羊抗 dig 抗体Roche diagnostics使用 1:500 を TSBSA
ウサギ抗羊抗体Jackson で結合 Jackson labs:250 を TSBSA
ヤギ抗ウサギ抗体で希釈した1:250
ロシュの診断で希釈した1:200
で希釈した1:250
10 ml 10x 生理食塩水、5 ml 2 M Tris、85 ml RNAse free H2O
Vectashield 封入剤、DAPIVectorlabsH-1200
ネイルワニス
蛍光ミスクロスコープ
ES細胞培養培地に由来することができます。します。シ30120086塩 を使用 するまでRNAseフリー水を加え、オートクレーブで希釈し、FITC で 1で希釈ラボでは、TSBSAマウス抗ビオチン抗体を使用 では、ローダミン・ジャクソンと結合したTSBSAロバ抗マウス抗体を使用 ラボでは、ローダミン・ジャクソンと結合したTSBSAヤギ抗ウマ抗体で希釈して1:250を使用 ラボでは、TSBSAトリス生理食塩水洗浄液(TS)を使用

参考文献

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