臍帯血移植後の水痘帯状疱疹ウイルス特異的細胞性免疫を評価するために、IFN-γELISPOTアッセイの開発

サマリー

単一細胞レベルでのサイトカイン産生を検出し、T細胞応答の両方の定量的および定性的特徴づけを提供するようなγインターフェロン（IFN-γ）のELISpotのような機能アッセイの新規世代水痘帯状疱疹に対して向けられた細胞性免疫応答を評価するために使用することができるウイルス（VZV）。

要約

水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）は、臍帯血移植（UCBT）以下の罹患率および死亡率の重要な原因である。このため、抗ヘルペス予防は、VZV感染に伴う合併症を防ぐために、小児UCBT受信者に体系的に投与されたが、その最適な期間を定義強い、エビデンスに基づくコンセンサスが存在していません。 T細胞媒介性免疫は、UCBTの予防を維持すべきかまたは中止することができるかどうかの指示を提供することができ、以下のVZV特異的T細胞応答の再構成を評価し、VZV感染の制御に関与するからである。そのためには、VZV特定γインターフェロン（IFN-γ）酵素結合免疫（エリスポット）アッセイは、照射された弱毒生VZVワクチンを用いたin vitro刺激に応答してTリンパ球によるIFN-γ産生を特徴づけるために開発されました。このアッセイは、VZV固有のCの、迅速な再現性かつ高感度な測定を提供エル臨床現場でのVZV特異的免疫の再構成を監視し、VZV抗原に対する免疫応答性を評価するのに適した免疫を媒介した。

概要

1989年に初めて行われ、UCBTは、ますます子供¹における種々の新生物および非腫瘍性血液疾患の治療の一部として使用される。 VZVは（再活性化後）2異なる疾患、（一次感染後）水痘や帯状疱疹を引き起こす細胞変性人間アルファヘルペスウイルスである。一次感染後、VZVは後根神経節の感覚神経内守らホストの寿命を通じて持続します。 UCBT次の最も脅かす感染性合併症の一つは、VZV ^2-4に関連している。当社の臨床センターでは、VZV予防がない場合には、VZV病のVZV疾患の累積発生率は3年でpostUCBTは46％であった^。これらの患者において、 デノボでの感染又はVZVの再活性化は、多くの場合、中枢神経系、肺及び肝臓^5-7に内臓の普及に関連している。その結果、アシクロビル、バラシクロビル、またはファムシクロビル予防は、一般的にUBに投与されているCTの受信者^8,9。しかしながら、この治療戦略が考慮VZV特異的Tリンパ球またはVZV特異的T細胞応答の再構成の速度論の保護電位をとらない。長期的な抗ヘルペス予防の拡大使用に伴う潜在的な問題）は、患者過剰治療が含まれ; b）は、抗ウイルス薬剤耐性^10,11の開発、およびC）VZV特異的免疫再構築^12,13の減損。機能のVZV特異的なTリンパ球の検出は、VZV感染と臨床転帰の改善^4,14,15からの長期的な保護の存在と相関するので、移植後の期間の間に、VZVに対して向け細胞性免疫応答を監視するウイルスのより合理的な使用をもたらすかもしれませんVZVの恩恵を受ける患者を区別するために医師を可能にすることによる治療は、免疫システムのVZV複製^4,13を制御することができるものと予防。

IFN-γELISpotアッセイが広く、実験系および種々の臨床症状のモニタリング細胞媒介性免疫応答のために使用される。スポットは、反応部位に表示され、安定した沈殿物を生成し、発色基質の切断後に生成される。個々のスポットは、それによって個々のサイトカイン産生細胞のフットプリントを表しています。 IFN-γELISpotは、同族抗原とin vitroでの刺激に応答してIFN-γを産生する個々の細胞をex vivoでの能力を測定するだけでなく、所与の細胞集団^16,17における細胞応答の頻度の推定値を提供する。その高い感度に加えて、IFN-γELISPOTは、抗ウイルス治療の開始や停止を誘導することを目的とし、個人の臨床プロトコルの文脈で可能なのを利用して、実行するのは簡単である。 describ下に詳述した手順エス具体VZV由来抗原によるインビトロ刺激後の末梢血単核細胞によるIFN-γの産生を検出し、測定するように設計されELISpotアッセイ。

プロトコル

この研究計画は、研究を行ったCHUサントジュスティーヌ、モントリオール、ケベック、カナダの機関倫理審査委員会によって承認された。インフォームドコンセントを求め、すべての研究参加者、両親または法的保護者から得られた。すべての手順は、1日目に行い、2（層流フードの下で、すなわち ）、無菌条件下で行わなければならない。ヒトの血液を処理するための標準的な安全手順を厳守しなければならない。

1。プレートコーティング

1. 各ウェルに1分間、35％エタノールを20μl添加することにより、96ウェルマルチスクリーンIP白色のELISpotプレートの底部にポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜を透過。膜はやや半透明になる必要があります。
2. MULを用いて、直ちに1×リン酸緩衝生理食塩水（137mMのNaCl、2.7mMのKCl、10mMのNa ₂ HPO _4、2mMのKH ₂ PO _4、pH7.4のPBS）200μlでウェルを3回洗浄するピペットまたは同様のデバイスをtichannel。このステップは、エタノール残基は細胞生存率および捕捉抗体​​の結合に影響を与えることができることが指定されて重要である。 ELISPOTプレートは壊れやすく、取り扱いに注意する必要があります。自動プレート洗浄機の使用はお勧めしません。
3. コー​​ト10μg/ mlの終濃度になるように1×PBSで希釈した精製マウス抗ヒトIFN-γ捕捉抗体​​を10μlでウェル。定期的なプラスチック製のラップでプレートをカバーし、4℃で一晩インキュベート

2。プレートをブロッキング

1. 井戸を空に、乾いたそれらをタップし、1X PBS200μlでプレートを5回洗浄する。
2. 完全RPMI 1640培地200μlでウェルを満たし、（閉塞工程）、37℃で2時間、プレートをインキュベート。
3. プレートを1X PBS200μlで5回洗浄し、細胞がメッキされる準備が整うまで、フル1X PBSでのウェルを保つ。

3。細胞播種と刺激

1. Pを準備する標準的な手順を用いて、フィコール·パック勾配での遠心分離によりヒト静脈血サンプルからeripheral血単核細胞（PBMC）。あるいは、標準的な方法を用いて、液体窒素下で凍結PBMCのアリコートを解凍。最後の遠心分離、再懸濁mlの2×10 ⁶細胞/の最終濃度で細胞およびウォータジャケットインキュベーター中5％CO ₂雰囲気下37℃で一晩インキュベートした後。
2. インキュベーターからのPBMCを削除し、完全RPMI 1640培地5mlの最終容量で再懸濁します。
3. 室温で5分間セラチアから遺伝子工学的にエンドヌクレアーゼを10μlの存在下でPBMCをインキュベートする。
4. PBMCの50μlアリコートを取り出して、トリパンブルー色素を50μlと混合。細胞を計数し、血球計数器および顕微鏡検査（色素排除法）を用いて％生存率を推定する。細胞計数および細胞生存缶らの評価のための様々な自動化された方法そのように使用すること。 PBMCを> 95％生存である必要があります。生存率が95％未満であるときにサンプリング捨てる。
5. 5分間700×gで遠心分離PBMC、上清を捨て、2％を補充したAIM-V培地中で再懸濁細胞（v / v）の2×10 ⁶細胞/ mlの最終濃度で（HIS）ヒト血清を不活性化。刺激の混合物をプレートに添加されるまで、37℃で保管してください。
6. 、ウェルに一度に1滴、適切な刺激混合物100μlを加える。後述するように3つの刺激の混合物が使用されるべきである。
   1. 使用AIM-V培地は、2％（v / v）の不活性化ヒト血清（IHS）のような陰性対照を補充した。
   2. 0.5μg/ mlの陽性対照として）の最終濃度2％（v / v）のIHSを補充したAIM-V培地中に希釈した抗CD3モノクローナル抗体（クローンOKT3）を使用する。
   3. γ線照射のいずれかの形態で、VZV抗原を使用（10,000 Gyを、30分間の曝露時間）は弱毒化VZVワクチン（1,350プラーク形成単位[PFU] / ml）を生きDILUAIM-Vの2％（v / v）のIHSを添加した培地）またはVZV直ちに初期（IE63）リンタンパク質の配列に基づいて合成された67ペプチド（15アミノ酸残基）の等モル混合物を1μgでテッド1:200 。 PBMC培養中の4日後に細胞変性効果の明らかな兆候がないことを監視することで、照射の有効性を制御します。
   4. 重複してすべてのウェルを準備します。
7. 、ウェルに一度に1滴、適切なウェルにステップ5.4で調製した細胞を100μlを加える。 2つの井戸は、細​​胞（ネガティブコントロール）を使用せずにしておきます。ウォータージャケットインキュベーター中で5％CO ₂雰囲気下、37℃で20時間インキュベートする。 、振って移動、またはインキュベーション中互いの上にプレートを積み重ねないでください。

4。スポットの開発と検出

1. セルを廃棄し、1×PBSでプレートを10倍を洗い、0.05％（V / V）のTween 20（PBST）を加えたもの。トゥイーン20をPVDF私に付着した細胞を剥離役立ちます一晩インキュベーション後のmbrane。
2. マルチチャンネルピペットを用いて、0.5％（w / v）ウシ血清アルブミン（BSA）を含有する1×PBSで希釈した0.5 mg / mlのビオチンコンジュゲート抗IFN-γモノクローナル抗体（4S.B3クローン）100μlを添加する。室温で2時間、プレートをインキュベート。
3. ウェルをPBSTで6倍および0.5％（w / v）のBSAを含む1×PBS中で1:1,000に希釈したアルカリホスファターゼで各ウェルにストレプトアビジンconjugatd100μlのを追加洗う。プレートを覆い、室温で1時間インキュベートする。
4. プレートをPBSTで3回洗浄し、1×PBSで3回。 5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリルリン酸（BCIP）/ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（NBT）基質溶液100μlを添加し、室温で5分間インキュベートする。
5. 蒸留流水でプレートを洗ってください。 ELISPOTプレートの下部を外し、蒸留水で膜の両側を洗う。空気はプレートを乾燥させます。
6. 井戸を調べ、立体Dを使用してスポットを列挙issection顕微鏡や自動化されたスポットカウンターを使用して、プレートをスキャンします。彼らは同じ日に検査することができない場合、離れて光からプレートを保管してください。
   1. 二連のウェルに対応する計数スポットの数を平均化し、試験ウェルで計数したスポット数から負のコントロールとなるウェル（細胞なし）で計数したスポットの数を差し引く。
   2. 10 ⁶ PBMCあたりのスポット形成単位数（SFU）として、IFN-γ産生を発現する。
   3. SFUの数は、陰性対照以上> 50〜10あたり⁶ PBMCおよび2標準偏差（SD）である場合、そのテストサンプルが陽性で考慮する（細胞+ AIM-V培地は、2％（v / v）のIHSを補充した）。
   4. スポットがカウントされるには余りにも多数であるとき、ウェルあたり400 SFUの値を使用します。
7. エリスポットデータが正常にコルモゴロフ - スミルノフ検定を使用して分散されているか否かをテストする。データが正規分布している場合、スチューデントのt TESを用いて統計的比較を行うT（2グループ）またはANOVAとボンフェローニポストテスト（多重比較）。データが正規分布していない場合には、マン-ホイットニーU検定 （2群）またはクラスカル·ワリス検定およびダンの事後検定（多重比較）を使用する。

結果

上記に詳述IFN-γエリスポットプロトコルは大きさおよびVZV ⁴に対して向け細胞媒介性免疫応答の質を測定するために開発され、我々の研究室で最適化した。 VZV抗原の多様なソースは、刺激工程のために使用することができる。これらは、a）VZVから市販されている洗剤の不活化抽出物は、Vero細胞を^18感染 ; IE63 ¹⁵とORF4 ¹⁹を含む特定のVZVコードされたタンパク質から合成ペプチドの重複B）のプール; C）の弱毒水痘帯状疱疹ワクチン^20を生きる;及びd）破砕VZVの清からのVZV抗原のUV不活性化された製剤には、MRC細胞^14を感染させた。抗原ソースと準備の均一性を確保するために院内transmissio臨床現場で生きた野生型VZV株の文化や操作を制限するために、VZVの派生我々の場合では、弱毒生VZVワクチンの希釈液を、細胞培養よりも優先されたnは深刻な懸念¹⁰です。また、γ照射が原因γ放射線の線量が配信することができ、紫外線とは異なり、γ線を効率的に密封されたVZVはバイ...

ディスカッション

修正およびトラブルシューティング：IFN-γエリスポットアッセイは、ヒト免疫不全ウイルス1型^{（HIV-1）24,25、C}型肝炎ウイルス^（HCV）26を含む微生物病原体の種々に対して向けられた細胞性免疫応答を調べるために使用されてきた^{、 27、}および結核菌 ^28,29は 、ほんの数名に。ここでは、小児UCBT受信者の回復にVZV特異的免疫再構築の相関を定義する希望を持って、に対する細胞性免疫を測定するために、IFN-γELISPOTアッセイの開発について述べた。

このアッセイの主な特徴は4つある。第一に、それは時間がかかるT細胞の事前のインビトロ増殖を必要としない。第二に、アッセイ間のばらつきを最小限に抑えるために最適な、凍結保存されたPBMC試料を用いて行うことができる。さらに、凍結保存及び並列処理は、当longitudiするように適合されているサンプルはバッチで処理されることを必要と内部研究。第三に、P...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ロイコセップチューブ	VWR	89048-936/89048-932	血液量に応じて、12mlまたは50mlのチューブを使用できます。
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	光から保護します。
ベンゾナーゼヌクレアーゼ	Novagen	70746-3	-20 °C.
MultiScreenHTS-IPフィルタープレート	ミリポア	MSIPS4W10	、細孔径0.45μmの滅菌
マウス抗ヒトIFN-&γ;捕捉抗体	BDバイオサイエンス	551221	NIB42クローン
Pepmix VZV IE63	JPT Peptide Technologies	PM-VZV-IE63	1つのバイアルの内容物を40 μに溶解します。DMSOのl。6ヶ月以内にご使用ください。
ビオチン標識抗IFN-&γ;モノクローナル抗体	BD Biosciences	554550	4SB3クローン。
ストレプトアビジンとアルカリホスファターゼを結合させたもの	Bio-Rad Life Science	170-3554	希釈して同日使用してください。
BCIP/NBT	バイオ・ラッド ライフサイエンス	170-6432	光から保護します。

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