アフリカトリパノソーマにグライコダイナミクスを監視する蛍光タンパク質を使用した

サマリー

>jove_content<アフリカのトリパノソーマにおけるグリコソームの動態は、電子顕微鏡や蛍光顕微鏡などの伝統的な細胞生物学技術では研究が困難です。 オルガネラの動的な挙動を観察する手段として、蛍光オルガネラレポーターシステムをフローサイトメトリーと組み合わせて使用し、生きた寄生虫のグリコソームダイナミクスをリアルタイムでモニタリングしています。

要約

トリパノソーマは 、牛^1、ヒトアフリカトリパノソーマ症（HAT）、または睡眠病、及び消耗性疾患、ナガナを引き起こすキネト寄生虫である。哺乳類宿主の血流中及びツェツェバエベクトルとの間の寄生を交互に。多くの細胞小器官の組成物は、これらの異なる細胞外の条件^2-5に応答して変化する。

Glycosomesは解糖に関与する酵素の多くは区画化された専門性の高いペルオキシソームです。発達と環境に調節された様式^4-11グライコ組成が変化。現在、グライコダイナミクスを研究するために使用される最も一般的な技術は、電子と蛍光顕微鏡であり;高価な、時間と労働集約的な技術、簡単にハイスループット分析に適合していない。

これらの制限を克服するために、蛍光グライコレポーター系黄色蛍光タンパク質（のeYFP）を増強する、glycosomes ¹²融合タンパク質を導く配列（PTS2）を標的ペルオキシソーム、に融合される確立されている。 PTS2eYFP融合タンパク質のインポート時に、glycosomes蛍光になる。細胞小器官分解し、フローサイトメトリーによって測定することができる蛍光の損失リサイクル結果。細胞（5,000細胞/秒）の多数は、そのような固定化および実装などの大規模なサンプル調製なしにリアルタイムで分析することができる。この方法は、環境条件の変動に応答して細胞小器官組成の変化を検出する迅速な方法を提供する。

概要

トリパノソーマはアフリカのヒトにおける睡眠病および消耗性疾患、ナガナ、牛が発生します。これらの疾患の治療に用いられる薬剤は、ワクチンが利用可能でない、時代遅れと非常に毒性であり、薬剤耐性の発生の可能性は、新しい薬物標的¹の検索を必要とする。

そのライフサイクル、Tの間トリパノソーマ、昆虫ベクターおよび哺乳動物宿主間で交互;寄生虫が生き残るなければならない非常に異なる環境を提示する二つのホスト。寄生虫は、異なる環境条件に暴露されるように、代謝的および形態学的変化の数が発生する。最も劇的な変化のいくつかは、単一膜結合寄生虫特定のマイクロボディで観察glycosomes ^13と呼ばれる。

血糖値が比較的高い（〜5 mM）の血流中の血流寄生虫は（BSF）は、解糖WHから独占的にATPを生成するニトリルミトコンドリアの代謝は¹⁴抑制される。解糖が細胞質で起こる他の真核生物、T.とは異なりトリパノソーマは glycosomes ^14,15における糖分解酵素の大部分を区分する。寄生虫は吸血中にツェツェバエによって取り込まれ、ハエによって摂取され、15分以内に検出不能なレベルまで低下するグルコースの低下を経験している。昆虫、procyclicフォーム（PCF）、寄生虫の代謝は、より柔軟かつグルコース、ならびにプロリンなどのアミノ酸、ATP ^16-18の合成に使用することができる。比較プロテオミクス研究は、ライフサイクルglycosomalにおける依存性の変化と血流寄生虫で増加し、解糖タンパク質とミトコンドリアタンパク質およびTCA回路と呼吸鎖^13,19に関与ミトコンドリアタンパク質を明らかにした。多くの研究は、BSFとPCF glycosomesとの違いに焦点を当てているが、少しはENVに応答して発生PCF glycosomesの変化についてはほとんど知られていないironmental変化。

ハエの後腸では、血糖値は、摂食²⁰時の過渡的な増加に低い。 インビトロ研究において最もにおいて、PCF寄生虫は、グルコースを含む培地で増殖させる。しかし、最近の研究は、グルコース可用性¹⁷に応答して有意にそのPCF代謝の変化を示した。ブドウ糖、プロリン取り込み及びプロリン脱水素酵素活性の増加¹⁸が存在しない場合には。ミトコンドリア代謝のこの変化は、おそらくグライコ組成および形態の変化を伴うが、これは直接的に評価されていない。

電子および蛍光顕微鏡は、T.でグライコダイナミクスを研究するために使用される一般的な技術であるトリパノソーマ ^2,21-24。これらのプロトコルは、リアルタイムの研究およびハイスループットプロトコルに適応する時間および労働集約的、高価、困難である。この制限は、蛍光オルガネラレポーター系のuを克服するために哺乳動物および酵母系において細胞小器官を研究するためのsed、Tで使用するために変更されましたトリパノソーマ ^12。

蛍光オルガネラレポーター系は、広くそのような酵母、植物、および哺乳動物細胞などの高等真核生物^25-27において使用されている。このようなシステムでは、蛍光タンパク質は、特異的細胞小器官へのタンパク質を標的とするアミノ酸配列に融合される。標的タンパク質の分解又は合成が蛍光により測定され、オルガネラ組成の変化は、細胞の蛍光の変化によって反映される。

強化黄色蛍光タンパク質（EYFP）のオープンリーディングフレームは、タイプIIペルオキシソーム標的配列^（PTS2）12に融合されると、PTS2eYFPタンパク質は成熟した、インポートコンピglycosomes及び蛍光にインポートされ、フローサイトメトリーによってモニターすることができる。グライコ物の変動は、細胞蛍光の変化によって反映される。このシステムは、レゾールのを助けることができるグライコ組成物における環境的に誘導された変化を制御する仕組みをヴィング。

この原稿は、ライブ寄生虫リアルタイムのグライコ動態を監視するためにフローサイトメトリーと組み合わせてPCF寄生虫でグライコレポーター系の生成を記載し、それは異なる環境に応じて、グライコ組成の変化に追従するために使用されている方法の例を提供する。新鮮な培地グライコ組成の変化をトリガに要約すると、グライコ組成物は、細胞外グルコース濃度との対数期培養物の通過によって影響される。このシステムは、トリパノソーマ類および他の寄生虫に他の細胞小器官の動的挙動を研究するために修飾することができる。

プロトコル

1。一般トリパノソーマ畜産

1. SDM79メディア製剤（ 表1）の固形分を秤量する。
2. 50円錐mlまたはジップロック袋に入れて、4℃で保存する。 NOTE：試薬は、少なくとも6ヶ月間安定である。
3. 37℃の水浴中でウシ胎児血清（FBS）を解凍し、逆さにして、定期的に混ぜる。注：FBSを滅菌溶液として供給者から受信される。 FBSを滅菌フィルターは、寄生虫の増殖を支持する能力を低下させる。
4. 全体瓶を解凍されると、熱が血清成分の沈殿を最小限にするために定期的に混合し、56℃の水浴中で30分間、血清を不活性化する。
5. ペニシリン/ストレプトマイシン溶液（ペニシリン/ストレプトマイシン）、ヘミン（50mMのNaOH中2 mg / ml）を、室温で基礎培地イーグルビタミン溶液を解凍する。
6. 千ミリリットルメスシリンダーに、液体成分（ 表2）にSDM79固形物（ 表1）20.2gのを追加し、攪拌プレート上でよく混合する。
7. 7.35にpHを調整し、水で850ミリリットルにボリュームを持って来る。
8. フィルタは、フィルタボトルの底に真空ホースを取り付けることによってメディアを滅菌する。溶液が濾過されるまで吸引する。
9. バイオセーフティキャビネット内でフィルタートップを外し、不活性化FBS、熱の150ミリリットルを追加します。無菌キャップとシールメディアボトルからプラスチック製のカバーを取り外します。
10. 以下の例外を除いてSDM79と同じようにSDM80メディアを準備します。グルコースまたはグルコサミンを追加し、グルタミンを含まないMEMを使用しないでください。 FBS熱不活性の150ミリリットルの代わりに、135不活性化FBS透析し、熱の加えて、不活性化FBS、熱の15ミリリットルを追加します。
11. 27℃で10ミリリットル適切な培地で25cm ^2のフラスコを5％CO ₂中で培養PCF寄生虫。注：細胞は、血球計またはフローサイトメーターを使用して毎日計数されるべきである（セクション6を参照）、培養物を1×10 ^{5〜5×10 6}細胞/ mlの間の密度で維持されるべきである。

2 Trは蛍光レポーター構築とPCF寄生虫のansfection

注：強化された黄色蛍光タンパク質に融合されたアルドラーゼのペルオキシソーム標的配列（PTS2）を含むレポータータンパク質は、寄生虫で表現され、グライコダイナミクスに従ってください。融合タンパク質をコードする配列はprocyclinプロモーターおよびチューブリン遺伝子間領域、ゲノムへの直接相同組換えおよび選択のためのブラストサイジン耐性遺伝子を含むpXS2bla ¹²にクローニングされる。 PTS2eYFP：T7ポリメラーゼおよびテトラサイクリンリプレッサー（PF29-13）をコードする遺伝子を保有するProcyclic細胞株をターゲティング構築物、pXS2で形質転換される。

1. 表3に示す成分を混合することによってcytomixを準備します。フィルター滅菌し、室温で保管してください。
2. DNA（1μgの/μl）を、5μlの制限酵素バッファー、33μlの水10μlをピペットによりMluIでプラスミドDNAを線状化し、2μ;マイクロ遠心チューブにMluIで酵素のlである。 1時間37℃でインキュベートする。
3. 制限は、制限酵素消化に結合緩衝液の1容量を加えることによって消化精製する。ボルテックスで結合バッファーおよび消化したDNAを混ぜる。簡単に言えばチューブの底にサンプルを収集するために遠心する。
4. 2 mlのコレクションチューブにDNA結合列を挿入し、転送は、カラムへのDNA /結合緩衝液を消化した。
5. 1分間のを10,000×g遠心します。遠心分離の後、コレクションチューブからろ液を廃棄し、コレクションチューブにカラムを返す。
6. SPWの700μlを加え、1分間10,000×gでバッファリングし、遠心洗浄する。
7. コレクションチューブからろ液を捨てる、コレクションチューブにカラムを返し、SPW洗浄工程および遠心分離を繰り返します。
8. 残留エタノールを除去するために万×gでろ液を廃棄し、回収用チューブにカラムを戻し、3分間遠心空の列。
9. バイオセーフティキャビネットでは、列を捨てる滅菌マイクロチューブ内lectionチューブと場所の列。
10. 、DNAを溶出カラムに滅菌水を25μl加え、2分間室温でインキュベートする。 1分間万×gで遠心分離する。
11. カラムへのバイオセーフティーフード内で無菌水の別の25μLを加え、2分間室温でインキュベートする。
12. 1分間のを10,000×gの速度で遠心分離。
13. バイオセーフティキャビネットでは、新しい滅菌マイクロチューブにDNAのボリューム全体を転送します。注：この手順は、遠心分離中に開いた蓋からの汚染を防ぐことができます。
14. フィルター滅菌cytomix400μlの滅菌し、精製し、線状化DNA（10μgの）を追加します。
15. RTで15分間、800×gでの遠心分離によって5×10 ^{7〜10 8}細胞をセクション6で説明し、収穫などの細胞を数える。
16. 上澄みを捨て、1mlの血清学的ピペットを用いてDNA + cytomix450μlの中で細胞ペレットを再懸濁します。
17. CEを含む転送ソリューション LLSは、DNA、エレクトロポレーションチャンバー内の滅菌4mmのギャップキュベットと場所キュベットにcytomix。
18. 「指数関数的減衰」を選択し、手動で次の設定に入力します。電圧：1.5 kVの、静電容量：25 MF、抵抗：Ω、およびキュベット：4ミリメートルを。プレスパルス。パルスが完了すると、エレクトロポレーションチャンバーからキュベットを削除し、バイオセーフティキャビネットに戻ります。
19. 新しい無菌フラスコ、ピペットSDM79 10mlに。 SDM79 10mlでフラスコに転換された細胞を転送します。
20. 27°C、5％CO ₂で24時間薬剤選択なしにインキュベートする。 24時間後、G418（15μg/ ml）を、ハイグロマイシン（50μg/ ml）を、およびブラストサイ（10μg/ mlの）を追加します。薬物とのSDM79 9mlの中に薬物との形質転換細胞の1ミリリットルを渡します。
21. 細胞は蛍光性であり、そして1×10 ⁷ / mlの細胞密度に達したときのセクション6で説明し7として毎日の細胞を分析し、（3.1〜3.3）の長期保存のためstabilatesを作る。

ve_title "> 3。Stabilatesを作る

1. メディアを凍結するために、cytomixする100％グリセロールおよびフィルター滅菌し、等量の追加。
2. クリオバイアル中の細胞の800μlの（1×10 ^7）に凍結200μlの培地を追加し、2発泡スチロールのラック間反転と場所によって穏やかに混合し、-80℃で凍結する。
3. （〜24時間）、冷凍したら、液体窒素に細胞を移す。 NOTE：-80℃での長期保存は、細胞生存率の低下につながるようにこれは、24時間後にLN ₂に細胞を移動させることが重要である。

4。解凍冷凍株式

1. -80℃から凍結バイアルを取り出し、約10分間RTで解凍。
2. ピペット新しい無菌フラスコに薬物とのSDM79の9ミリリットル。このフラスコに解凍した細胞を追加します。新しいフラスコ（1×10 ⁵ / mlの最終濃度）でSDM79の9ミリリットルにこの培養液1mlを加えることによって、細胞1:10渡します。
3. 細胞を10 ⁷ / mlの密度に到達する前に、フローサイトメータ設定を開始するアップおよび希釈アッセイ。

5。サイトメーターのセットアップ

1. フローサイトメーターの電源を入れ、CFLOW·プラス·プログラムを開きます。注：いずれかのサンプルを実行する前に、流体工学、工程5.2から5.7に応じてバックフラッシュと洗い流してください。
2. SIPは、空のチューブを格納したナノ純水のチューブを交換してください。
3. 「バックフラッシュ」ボタンを選択します。
4. バックフラッシュが完了すると、SIPからマイクロチューブを取り外して廃棄します。
5. 一口に新しいナノ純水1mlを含む新しいマイクロチューブを置きます。
6. CFLOWプログラムで新しい井戸を選択します。 「ファイル名を指定して実行制限」の下に2分間の時間を設定します。 「流体工学」の下に「高速」と「ファイル名を指定して実行」を選択します。
7. 2分の制限時間が終了すると、「サンプルデータの削除」ボタンをクリックしてください。

フローサイトメーターを使用して6細胞計数

1. カウントされるサンプルと水を交換してください。セット」速い」から「制限」30秒、「流体工学を実行」を選択してから「ファイル名を指定して実行」。
2. 30秒の時間制限がCFLOW、完了したプラスμlの「最後の実行」各培養を繰り返しカウントの下でイベントを/提供した後。注：細胞は1×10 ⁷細胞/ mlに到達する前に、希釈アッセイを進める。 1希釈アッセイが完了した後、細胞を中止すること。長期間培養した細胞は、環境条件に反応する能力を失う。

フローサイトメーターを使用した7。測定蛍光

1. 蛍光を評価するために、10,000事象を「ファイル名を指定して実行の制限」、および「遅い」ための「流体工学」に設定してください。 「設定されたしきい値 "を選択します。 「プライマリスレッシュホールド」の下で、（ドロップダウンボックス）、「永久にイベントをなくす」「FSC-H」を選択し、30,000未満を入力してください。その後「閉じる」、「適用」をクリックします。
2. 選択する220;ヒストグラム」ボタン新しいプロットウィンドウの1つにあると選択し、「FSC-A」をドロップダウンリストから、選択して「FL1-A」を。注：530nmの波長のFL1-Aを測定する蛍光。
3. 「ファイル名を指定して実行」を選択し、すべての文化のために繰り返します。
4. 2分間で2分と水の流体工学ラインを通して洗浄液を実行します。

8。希釈アッセイ

1. 25cm ^2の培養フラスコにSDM79 3ml中の1×10 ⁵細胞/ mlの密度に細胞を通過して、すぐに通過した後に、その後3時間および24時間後に蛍光を測定する。

9。データ解析

1. 選択CFLOWプラスのタブを「分析」。
2. 下の「ヒストグラム」ボタンをクリックして「新しいプロットを作成します。」「FSC-A」を選択し、ドロップダウンリストが表示されます。セレクトチャンネル「FL1-A」。
3. 分析するためによくを強調表示します。 「門」ボタンを選択し、手動でゲートを描く興味のある集団について。
4. フローPlusは、セル、このゲート内の「カウント」と「このプロットの％」を提供します。

結果

このシステムでは、グライコ組成物中のグルコース依存性の変化が観察された。細胞を、グルコース含有培地中で増殖させる場合、2つの集団が観察される; 1明るく1薄暗い（ 図2A）。薄暗い細胞は明るい細胞が成熟および未熟glycosomes ¹²の混合物を抱くながらPTS2eYFPをインポートしていない未熟glycosomesを抱く。グルコースが培地中に存在する場合、グライコタンパク質の誤った局在は致死^15,28とグライコタンパク質発現は、おそらくインポートと緊密に結合されている。この緊密な調節は、細胞が十分なインポート能力を欠いているときグライコタンパク質の発現が抑制された薄暗い細胞の出現の原因である。グライコインポート機械が完全に組み立てと機能したら、次に、細胞を蛍光細胞を得glycosomesにインポートされるグライコタンパク質を発現する。グルコースデプリートメディアでは、グライコタンパク質の誤った局在が容認されているD ^15、及び二峰人口分布は、蛍光のより広い範囲（ 図2B）を有する単一のピークで置き換え...

ディスカッション

Glycosomesが不可欠、ダイナミック、寄生虫固有の細胞小器官である。これらのオルガネラの生合成、維持、増殖およびリモデリングを制御するプロセスは、おそらく、治療目的のために悪用される可能性が薬物標的を含む。そのような薬物標的の可能性の高い存在にもかかわらず、グライコバイオジェネシスの分野は、主に、急速な、動的な、細胞小器官の応答を監視することで扱いやすい、高スループットシステムがないために、他の生物における類似プロセスの研究に遅れをとっている生きた細胞では。

蛍光オルガネラレポーター系は、酵母、植物、真菌および哺乳動物のような高等真核生物^23-25 ​​にオルガネラダイナミクスを研究するために使用されてきた。私たちは、蛍光細胞小器官を得glycosomes成熟することを目的としているPTS2eYFPを表現PCF寄生虫の遺伝子導入株を生成した。グライコ組成の変化は、以下の細胞の蛍光によってモニターすることができ。このシステムを用いて、環境条件、特にグルコースは、グライコ組成物^12を調節することを見出した。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アデノシン	アボカドリサーチケミカルズ株式会社	A10781	SDM79 成分
L-アラニン	アボカドリサーチケミカルズ株式会社	A15804	SDM79 成分
L-アルギニン	CalBiochem	1820	SDM79 成分
p-アミノ安息香酸	ICN バイオメディカル	102569	SDM79 成分
基礎ミディアム イーグル ビタミン溶液 (100x)	シグマ	B6891	SDM79 成分
ビオチン	フィッシャー	BP232-1	SDM79 成分
塩化カルシウム	VWR	BDH0224	Cytomix
EDTA	フィッシャー	S311-100	Cytomix 成分
EZNA ゲル抽出キット	オメガ Biotek	D2500-01	DNA 精製
研究用グレード 血清	フィッシャー	03-600-511	SDM79 成分
葉酸	ICN Biomedicals	101725	SDM79 成分
グルコサミン HCl	ICN Biomedicals	194671	SDM79 成分
グルコース	GIBCO	15023-021	SDM79 成分
L-グルタミン	CalBiochem	3520	SDM79 成分
グリセロール	Acros Organics	Ac15892-0010	凍結培地
Graces昆虫細胞培地粉末	GIBCO	11300-043	SDM79成分
ミン	MPバイオメディカル	194025	SDM79成分
ノシン	アボカドリサーチケミカルズ株式会社	A11328	SDM79成分
HEPES	MPバイオメディカル	194025	SDM79成分
塩化マグネシウム	フィッシャー	BP214-500	サイトミックス成分
L-メチオニン	フィッシャー	BP388-100	SDM79 成分
MEM アミノ酸 (50x)	Cellgro	25-030-CI	SDM79 成分
NEAA 混合物 (100x)	ロンザ	13-114E	SDM79 成分
ミニマル エッセンシャル メディウム (1x) with L-グルタミン	セルグロ	10-010-CM	SDM79 成分
MOPS	フィ	ッシャーBP308-500	SDM79成分
カーボネートナトリウム	ッシャーS233-500	SDM79成分
ニシリンストレプトマイシン溶液	セルグロ	30-002-CI	SDM79
-フェニルアラニン	ICNバイオメディカル102623		SDM79
カリウム	ッシャーP217-500		サイトミックス成分
リン酸二塩基性カリウム 無水	フィッシャー	P290-212	サイトミックス 成分
L-プロリン	フィッシャー	BP392-100	SDM79 成分
L-セリン	アクロス	オーガニック 56-45-1	SDM79 成分
ピルビン酸、ナトリウム塩	アクロスオーガニック	113-24-6	SDM79 成分
L-タウリン	TCI アメリカ	A0295	SDM79 成分
L-スレオニン	アクロス オーガニック	72-19-5	SDM79 成分
L-チロシン	ICN バイオメディカル	103183	SDM79 成分
E.Z.N.A. サイクル ピュア キット	オメガ Biotek	D6492-02	DNA 精製
結合バッファー	オメガ Biotek	PDR041	DNA 精製
SPW 洗浄バッファー	オメガBiotek	PDR045	DNA精製
遺伝子パルサー Xcell	Biorad	165-2660	トリパノソーマ変換
4 mm エレクトロポレーションキュベット	VWR		トリパノソーマ変換

ヘグアバイオフィペ成分L成分塩化フィ