主要組織適合性複合体クラスII dextramersとの直接染色により脳及び心臓における自己反応性CD4 T細胞を検出するためのプロトコルは、このレポートに記載されている。総合的な分析のために、 その場での抗原特異的CD4 + T細胞の頻度を列挙するための信頼できる方法も考案されている。
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方法論記事
主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出に
この記事について
サマリー
要約
この報告は、SJLマウスにおけるミエリンタンパク質タンパク質(PLP)139-151誘発実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)およびA/Jマウスにおける心筋ミオシン重鎖α(Myhc)334-352誘発実験的自己免疫性心筋炎(EAM)における自己反応性CD4 T細胞in situの検出のための主要な組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIIデキストラマーの使用を示しています。 デキストラマー試薬の2セットのカクテルを使用し、デキストラマー+細胞をレーザー走査型共焦点顕微鏡(LSCM)で分析しました:EAE、IAs / PLP 139-151デキストラマー(特異的)/抗CD4およびIAs / Theilerマウス脳脊髄炎ウイルス(TMEV)70-86デキストラマー(コントロール)/抗CD4;およびEAM、IAk/Myhc 334-352デキストラマー/抗CD4およびIAk/ウシリボヌクレアーゼ(RNase)43-56デキストラマー(コントロール)/抗CD4。EAEマウスから得られた脳切片のLSCM分析では、CD4およびPLP 139-151デキストラマーに陽性の細胞の存在が示されましたが、TMEV 70-86デキストラマーには陽性ではありませんでした。 同様に、EAMマウスから調製した心臓切片もMyhc 334-352の存在を明らかにしましたが、予想されたRNase 43-56-デキストラマー+細胞の存在は明らかではありませんでした。 さらに、「Z」シリアル画像中の抗原特異的CD4 T細胞の頻度を定量的に解析するための包括的な方法も考案されました。
概要
抗原特異的CD4 T細胞の検出のための主要組織適合性複合体（MHC）クラスII四量体を使用することは挑戦であった1-7。 MHCクラスII四量体の検出感度を高めるために、研究チームは、次世代のテトラマー、指定された「dextramers「8を作成した。 Dextramersは、複数のストレプトアビジン-フルオロフォア部分は、いくつかのペプチドテザー、ビオチン化MHCモノマー一つデキストラン分子9に取り付けることができるようにコンジュゲートしたデキストラン骨格を含有する。このように、いくつかのMHC-ペプチド複合体が含まれているのMHC dextramersの大きな集合体は、複数のT細胞受容体（TCR）と対話することができます。
このグループは、最近、様々な自己抗原に対するdextramersを生成し、dextramersの検出感度は、約8四量よりも5倍であることを示した。実験システムは、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAを含むE）、プロテオリピドタンパク質（PLP）SJLマウスにおける139-151で誘導し; C57BL / 6マウスにおいて、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）35-55を用いて誘導EAE;心臓ミオシン重鎖α（MyHCの）A / Jマウスにおける334から352で誘導し、実験的自己免疫性心筋炎（EAM）。この研究は、PLP 139-151の使用を示す- 、それに....
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プロトコル
倫理声明：
全ての動物手順は、実験動物の管理と使用に関するガイドラインに沿って行われ、ネブラスカ大学リンカーン、リンカーン、ネブラスカ大学によって承認された。
EAEの1。誘導
- 工程1.1：EAEを誘導するために、以下の改変を伴う11に記載のようにペプチド/完全フロイントアジュバント（CFA）エマルジ ョンを調製する。1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中1 mg / mlの濃度でPLP 139-151を調製するステップ1.4：動物1匹当たりのPLP 139-151100μgのを含むCFA乳化液200μlを使用する1.4.1ステップ ：10動物を免疫するために、PLP 139-151の1ミリリットル1Xにおける（1 mg / mlのを混合することにより、エマルジ ョンの2ミリリットルを用意。PBS）とCFAを等量の1.5ステップ ：2鼠径領域（〜75μLずつ）と5対6週齢の胸骨領域（〜50μL）に皮下分割用量でエマルジ ョン200μlのを注入FEMAルSJL / Jマウス。 1.7と1.8は、EAEの誘導には適用されません繰り返します。
EAEマウスと大脳の収穫の2。臨床スコアリング
- 臨床徴候の出現のために動物を監....
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結果
本報告書では、MHCクラスII dextramersとの直接染色による抗原特異的、自己反応性CD4 T細胞のin situ検出に記述されている。新たに切断した脳のセクションでは、EAEマウス由来し、PLP 139-151（特定）またはTMEV 70から86（コントロール）dextramersおよび抗CD4を含むカクテルで染色した。 図1のトップパネルは、二重陽性細胞が出現し、黄色のPLP 139-151 dextramers（赤）とCD4抗体（緑）で同時染色脳切片のLSCM分析を示す。このような特徴はTMEV 70から86（コントロール）dextramers（下パネル）で染色した切片には存在しなかった。共染色（DEXT + CD4 +）細胞が周囲に点状のドットを示した。脳切片におけるPLP特異的T細胞の定量分析は、以下のステップ（ 図2）関与する：1）三組の切片を作製し、各対からの1つのセクションは、抗CD4およびPLP 139から15で個別に染色した1 dextramers。同様に、三つのセクションの別のセ.......
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ディスカッション
MHCクラスIテトラマーとは違って、日常的なアプリケーションのためのMHCクラスII四量体の使用は、特にそれらの活性化の依存関係6,15-17に一部起因低親和性自己反応性CD4 T細胞の前駆体頻度を列挙するために、挑戦的であり続けている。最近では、この問題は、PLP 139-151、MOG 35〜55およびMyHCの334などの自己抗原の数の抗原特異的CD4 T細胞を検出するために、私達を許可する」、dextramers」と呼ばれる、四量体の次の世代を作成することによって回避されました - 352 8。本報告では、初めて、 その場で自己反応性CD4 T細胞を検出及び定量するためのMHCクラスII dextramersの有用性は、EAEマウス由来の脳切片、及びEAMマウスからの心臓切片を用いて実証されている。反応に基づいて、dextramersはMHC /ペプチド複合体の少量を必要とするという利点を提供する。このプロトコルでは、各反応は、0.75μgのMHC /ペプチドモノマーのを必要とする。また、STAdextramersとiningはdextramers抗CD4と共インキ.......
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開示事項
利害の競合が宣言されなかった。
謝辞
この作品は、アメリカ心臓協会と子供の心筋症財団（SDG2462390204001）、および国立衛生研究所（HL114669）によってサポートされていました。 CMは心筋炎財団、ニュージャージー州によって授与ポスドク研究フェローシップ助成金の受取人である。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| CFA | シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ | 5881 | 4°C |
| MTB H37Rv抜粋 | Difco Laboratories、デトロイト、ミシガン州 | 231141 | 4 ° でストア。C |
| PT | リスト生物製剤研究所、キャンベル、カリフォルニア州 | 181 | 4°C |
| 1x PBS | コーニング、マナッサス、バージニア | 21-040-CV | ストア4°C |
| 雌型A/Jマウス | ジャクソンラボラトリーズ、バーハーバー、ME | 646 | |
| メス SJL/J マウス | ジャクソンラボラトリーズ、バーハーバー、ME | 686 | |
| Leur-lok 滅菌 1 ml シリンジ | BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー州 | 309628 | |
| Leur-lok 滅菌 3 ml シリンジ | BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー | 309657 | |
| 滅菌針、18 G | BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー州 | 305195 | |
| 滅菌針、27 1/2 G | BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー | 州305109 | |
| 3方向活栓 | Smiths Medical ASD, Inc. オハイオ州ダブリン | MX5311L | |
| Kerlixガーゼ包帯ロール | Covidien、マンスフィールド、マサチューセッツ | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional、ロズウェル、ジョージア | 州 34155 | |
| アガロース、低融点、分析グレード | Promega corporation、ウィスコンシン州マディソン | V2111 | |
| 免疫純度の正常なヤギ血清 | Thermo Scientific、Waltham、MA | 31873 | -20 ° で保存。 |
| C Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | 4 ° でストア。C |
| パラホルムアルデヒド | 電子顕微鏡科学、ハットフィールド、ペンシルバニア | 州 19202 | 4 °C |
| Faramount 水性マウンティング メディウム | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| コニカル チューブ (15 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
| コニカル チューブ (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| 24 ウェル平底組織培養プレート | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| 水彩 #2 ブラシ | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| Premium Cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| Disposable deep base mold histology cassettes | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite 瞬間接着剤 | ヘンケルコーポレーション、ウェストレイク、オハイオ州 | 1471879 | |
| カミソリ刃 | ジレットスーパー | ||
| 334-352(DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | ネオペプチド、ケンブリッジ、マサチューセッツ | 4°で店舗。C | |
| PLP 139-151(HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide、ケンブリッジ、マサチューセッツ州 | 4°で保存。C | |
| MHCクラスII / IA | 4°で保管します。C | ||
| MHCクラスII / IAkMyhc 334-352または またはRNase 40-56デキストラマーは、APC染料 | 4°で保管します。C | ||
| DextranはSA-APC | Immundex、コペンハーゲン、4 | 。C | |
| 滅菌手術用ハサミと鉗子 | INOX tool Corporation | ||
| Micro oven | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. イリノイ州 | ||
| Olympus BX 60 レーザー走査型共焦点顕微鏡 | Olympus America, Inc. ペンシルベニア | ||
| Nikon A1-Eclipse 90i 共焦点顕微鏡 | Nikon Inc. ニューヨーク |
参考文献
- Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
- Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E.
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