次世代シーケンシングのための収集と唾液DNAの抽出

Summary

唾液からの

DNA抽出は、分解/断片化がほとんどまたはまったくない、高分子量DNAの容易に利用可能な供給源を提供することができます。 このプロトコルは、唾液の収集/保存とDNA抽出に最適化されたパラメータを提供し、高品質の要件を持つダウンストリームのDNAアッセイに十分な品質と量を提供します。

Abstract

ヒト遺伝学研究におけるDNAの好ましい供給源は、血液、または血液由来の細胞株です。なぜなら、これらの供給源は大量の高品質のDNAを生成するからです。 しかし、唾液からのDNA抽出は、分解/断片化がほとんどまたはまったくない高品質のDNAを生成することができ、瀉血専門医の費用をかけずにさまざまなDNAアッセイに適しており、郵送でも取得できます。 しかし、現在のところ、次世代シーケンシングのための唾液DNA収集/抽出プロトコルは文献で提示されていません。 このプロトコルは、唾液の収集/保存とDNA抽出のパラメータを最適化して、マイクロアレイジェノタイピングや次世代シーケンシングなど、最高水準のDNAアッセイに十分な品質と量を実現します。

Introduction

ヒト遺伝子研究のための高品質のDNAを得ることは、疾患遺伝子発見プロセスに不可欠である。血液は、侵襲的処置を必要とし、また、唾液収集よりも高価であるものの、機能的研究のためのDNA、またはiPS細胞の無限の供給源として不死化細胞株を作成するために好まれ、そして細胞株が利用できない場合、時には血液DNAが使用される。しかし、血液を得ることは訓練された瀉血専門医を必要とし、血液、唾液¹より短い半減期を有する。それによりよく病院や研究室²の集水域を越えて潜在的な対象プールを増加、瀉血専門医を必要とせずにメールを介して収集して送信することができますので、唾液からのDNAを、安価で入手が容易である。被験者はその代わりに、血液^3,4の唾液試料を提供するオプションを有する場合、研究登録を向上させることができる。唾液からのDNAの量と質についての懸念は、その広範なたちが限られている可能性唾液^{2、3、4、5、}かなりの量を取得しなかった古い頬スワブ法よりもDNA検査のためのミリリットル当たり4.3×10 ⁵細胞の平均で、全唾液の適合性を示す多くの研究の最近の研究にもかかわらず、電子^、ささやかな文献は、マイクロアレイに基づく方法^8,9,10を含むジェノタイピングアプリケーション用の全唾液由来のDNAの適合性を示す存在するが^6。、何の研究では、次世代シーケンシング（NGS）を検討し....

Protocol

注：前に唾液サンプルを提供するために、すべての被験者は、全国の小児病院でのヒト対象の治療のためのガイドラインに準拠したインフォームドコンセントを与えた。

1唾液の収集と保管

1. 唾液収集の前に、被験者の口は、被験者が水で彼らの口をすすぎ有し、食べないように、またはサンプルを収集する前に、30分間、飲むことによって食物やその他の異物がないことを保証する。
2. 必ずキャップやチューブの内側に触れないようにすること、DNAの安定化緩衝液²の2.5ミリリットルと15ミリリットルの遠心管を開き、被写体が緩衝溶液中に唾液の2.5ミリリットルを吐くがある。注：唾液以上の2.5ミリリットルを収集するには、サンプルの不十分な比率からのDNAの安定化バッファにサンプルの劣化につながることができます。少なすぎる唾液を収集するプロトコルから、期待利回りが低下します。収集量を評価するために、tの側の偶数勾配を使用し彼はチューブ。
3. キャップを元に戻し、混合物を均質化されるまで転倒混和。激しく振盪は必要ありません。短期保存または長期保存のために4°C（> 3ヶ月）のための室温​​でサンプルを記憶する。

2。初期準備と細胞溶解

1. 抽出を開始する前に、37℃に水浴を加熱し、氷のバケツを用意。三つ15ミリリットルの円錐遠心管に抽出された各サンプルのために必要とされる。 3本のチューブは、細胞およびタ....

Results

DNAは対になったDNA抽出のシリーズが行われた抽出のための最適なパラメータを決定すること。単一の唾液試料は、与えられた変数のための2つの可能な値の一つで分割し、各部分を試験した。各ペアの試験のうち、少なくとも8回の反復は、（ 例えば 、単一の唾液サンプルを用いて、初期50℃でのインキュベーションない場合の両方の抽出をテストするために等分した）を実施した。断片化を評価するために、総DNA収量、260/280値、260/230値、および泳動DNAの目視検査：最適化は、標準的な4つの測定基準に基づいていた。変数のすべてではない可能性のある組み合わせは、個別に各変数の限界効果を評価するために代わりに選ぶ、（N = 169の組み合わせ）の統計的な相互作用を評価した。効果は、マルチウェイ反復測定ANOVAを用いて試験し、推定効果は同等の回帰式から誘導した。すべての重要な効果は、AVERとして示し、 表1に要約されている歩留まりの年齢変化やDNAの質（260/280と260/230）（唾液入力の1mlあたりngの/μl）を。

蓄積バッファに.......

Discussion

本手順は、かなりDNAの品質を損なうことなく、標準的な方法に比べて高分子量DNAの収量が改善された最適化されたDNA抽出プロトコルである。収量を最大限に最も大きな影響を持つ重要なステップは、広く^11を配布していなかったものを除く、ここでレビュー公開済みプロトコルよりエタノール沈殿中に長い遠心分離工程を含むステップ5.2であった。この長い遠心分離と関連するDNAの質の変更は全唾液コレクションから入手可能なDNAの大部分が分解され、高分子量ではないことを示し、検出されなかった。

全唾液収集は、収集段階で最小限に抑える必要があり、外国の汚染物質の可能性や、潜在する感染の徴候である可能性があり、サンプル中の過剰なタンパク質の存在として、サンプルの質の制限があります。タンパク質または外国の汚染物質の大量の缶それによって、定量化が不正確作り、最終的な抽出されたDNAに残る。残留タンパク質または汚染物質は、再水和の後に存在する場合（ステップ6）が疑われる試料クリーンアップサンプル入力ボリュームを反映するようにスケーリングされた試薬量を有するタンパク質沈殿工程から開始すること.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mlの遠心分離機の管フィ		ッシャー12-565-268
細胞の溶解液	Qiagen	158908
のプロテイナーゼK	のΣ PσP6556
蛋白質沈殿物	の液Qiagen	158912
Isopropanol	Fisher	A416-4
コーゲン	EZ-BioResearch	S1003
70% エタノール	フィッシャー	04-355-305
Tris-EDTA (TE)	フィッシャー	BP2473-1
NaCl	フィッシャー	AC194090010
トリス HCl	フィッシャー	BP1757-100
EDTA (0.5 M) ソリューション	フィッシャー	03-500-506
ドデシル硫酸ナトリウム	フィッシャー	BP166-100
アナログの渦ミキサー	のフィ	ッシャー02-215-365
遠心分離機5810R	Eppendorf	5811 000.010