DNA抽出は、分解/断片化がほとんどまたはまったくない、高分子量DNAの容易に利用可能な供給源を提供することができます。 このプロトコルは、唾液の収集/保存とDNA抽出に最適化されたパラメータを提供し、高品質の要件を持つダウンストリームのDNAアッセイに十分な品質と量を提供します。
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この記事について
サマリー
唾液からの
要約
ヒト遺伝学研究におけるDNAの好ましい供給源は、血液、または血液由来の細胞株です。なぜなら、これらの供給源は大量の高品質のDNAを生成するからです。 しかし、唾液からのDNA抽出は、分解/断片化がほとんどまたはまったくない高品質のDNAを生成することができ、瀉血専門医の費用をかけずにさまざまなDNAアッセイに適しており、郵送でも取得できます。 しかし、現在のところ、次世代シーケンシングのための唾液DNA収集/抽出プロトコルは文献で提示されていません。 このプロトコルは、唾液の収集/保存とDNA抽出のパラメータを最適化して、マイクロアレイジェノタイピングや次世代シーケンシングなど、最高水準のDNAアッセイに十分な品質と量を実現します。
概要
ヒト遺伝子研究のための高品質のDNAを得ることは、疾患遺伝子発見プロセスに不可欠である。血液は、侵襲的処置を必要とし、また、唾液収集よりも高価であるものの、機能的研究のためのDNA、またはiPS細胞の無限の供給源として不死化細胞株を作成するために好まれ、そして細胞株が利用できない場合、時には血液DNAが使用される。しかし、血液を得ることは訓練された瀉血専門医を必要とし、血液、唾液1より短い半減期を有する。それによりよく病院や研究室2の集水域を越えて潜在的な対象プールを増加、瀉血専門医を必要とせずにメールを介して収集して送信することができますので、唾液からのDNAを、安価で入手が容易である。被験者はその代わりに、血液3,4の唾液試料を提供するオプションを有する場合、研究登録を向上させることができる。唾液からのDNAの量と質についての懸念は、その広範なたちが限られている可能性唾液2、3、4、5、かなりの量を取得しなかった古い頬スワブ法よりもDNA検査のためのミリリットル当たり4.3×10 5細胞の平均で、全唾液の適合性を示す多くの研究の最近の研究にもかかわらず、電子、ささやかな文献は、マイクロアレイに基づく方法8,9,10を含むジェノタイピングアプリケーション用の全唾液由来のDNAの適合性を示す存在するが6。、何の研究では、次世代シーケンシング（NGS）を検討していない。この全体の唾液のDNA抽出プロトコルを最適化するための目標は、簡単に一般的な試薬や消耗品研究所で実施され、コスト効果の高い方法で遺伝学·アプリケーションの量と質を最大にすることであった。
1）収集および記憶、2）細胞溶解、3）RNase処理、4）タンパク質沈殿、5）エタノール沈殿、6）DNAの再水和：唾液からのDNA抽出は、いくつかの手順が必要である。記載のDNA安定化緩衝液、以前2、変更することなく十分に機能します。 RNase処理とDNA再水和工程を最適化する試みはなされなかった。残りの各ステップについては、歩留まりに影響を与える可能性がいくつかの変数を同定した。各変数は、個別に操作され、収量と品質の改善が統計的に評価した。収率および/またはDNAの質を改善することが示された変数の場合、最適値は、最終的なプロトコールに含めた。
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プロトコル
注：前に唾液サンプルを提供するために、すべての被験者は、全国の小児病院でのヒト対象の治療のためのガイドラインに準拠したインフォームドコンセントを与えた。
1唾液の収集と保管
- 唾液収集の前に、被験者の口は、被験者が水で彼らの口をすすぎ有し、食べないように、またはサンプルを収集する前に、30分間、飲むことによって食物やその他の異物がないことを保証する。
- 必ずキャップやチューブの内側に触れないようにすること、DNAの安定化緩衝液2の2.5ミリリットルと15ミリリットルの遠心管を開き、被写体が緩衝溶液中に唾液の2.5ミリリットルを吐くがある。注：唾液以上の2.5ミリリットルを収集するには、サンプルの不十分な比率からのDNAの安定化バッファにサンプルの劣化につながることができます。少なすぎる唾液を収集するプロトコルから、期待利回りが低下します。収集量を評価するために、tの側の偶数勾配を使用し彼はチューブ。
- キャップを元に戻し、混合物を均質化されるまで転倒混和。激しく振盪は必要ありません。短期保存または長期保存のために4°C（> 3ヶ月）のための室温でサンプルを記憶する。
2。初期準備と細胞溶解
- 抽出を開始する前に、37℃に水浴を加熱し、氷のバケツを用意。三つ15ミリリットルの円錐遠心管に抽出された各サンプルのために必要とされる。 3本のチューブは、細胞およびタンパク質ペレットを、最終的な抽出のgDNA、イソプロパノールおよびエタノール上清を保持するために使用される。
- 15秒間、次に中程度の速度で渦をストレージからのサンプル、及び転化サンプル数回を取得します。
- 清潔な15mlの遠心管にサンプル2.5mlの分注、および細胞溶解溶液の5ミリリットルを追加。反転によって試料を50回混合し、室温で30分間インキュベートする。
3 RNAの取り外し
- RNase Aをソルの40μl添加100 mg / mlの少なくともution、15分間37℃でインキュベートする。
- 37℃の水浴からサンプルを取り出し、3分間氷上で冷却する。
- RNアーゼAのインキュベーション後、プロトコルのDNAの再水和工程のために65℃の水浴の温度を上昇させる。
4。タンパク質および脂質の除去
- 、ミリリットル/ 20 mgのでプロテイナーゼK溶液50μLを追加逆さにして数回混合し、最低30分間RTでインキュベートする。注：これは、プロトコルのための可能なポーズポイントです。抽出が完了できるまで、プロテイナーゼK溶液を加えた後、試料を4℃で保存することができる。最大24時間、4℃での貯蔵は、抽出収率またはDNAの質に大きな影響を有することが示されなかった。この段階での長期保管は、評価されていない。
- タンパク質沈殿溶液、高速で20秒間激しくボルテックスし、氷上で10分間場所の1.7ミリリットルを追加します。
- サンプルを10分間、3000×gで10分間遠心分離し、4℃、氷上で冷却した後。沈殿したタンパク質は、継続して固いペレットを形成しなければならない。ペレットがタイトではないか、解決策はまだ濁っている場合には、サンプルはより5分間氷上で冷却することができるし、遠心分離を繰り返した。サンプルは固いペレットを確実にするために氷上に保持されなければならない。
gDNAの5。単離および精製
- 清潔な15mlの遠心管に、ピペットイソプロパノール5mlのおよび20mg / mlの純粋なグリコーゲンソリューション8μlの。
- 沈殿したタンパク質ペレットを残し、イソプロパノールおよびグリコーゲン溶液を含むチューブにステップ4.3からのgDNAを含む上清を注ぐ。上清が添加された後、穏やかに3000×gで、4℃で30分間反転遠心によって試料を50回混合する。
- 清潔な15mlチューブにゆっくりと上澄みを注ぐ。上清を除去した後、70％エタノールを1ml加えるゆっくりと揺れ、ゆっくりと沈殿したペレットを数回にわたってエタノールを移動させることにより、ペレットを洗浄。チューブ内のエタノールを保持します。
- 最初の洗浄の後、2000×gで、20℃で1分間のサンプルを集める。この遠心分離工程は、4℃または20℃のいずれかで行うことができる。温度の有意な影響は、このステップのために示されていない。
- ペレットの最初の洗浄および遠心分離した後、ゆっくりとステップ5.3および5.4を繰り返して二回目の洗浄を行い、その後、チューブからエタノール洗浄を注ぐと捨てる。
- 二回目の洗浄から上清を除去した後、15分間空気乾燥ペレットを可能にする。
- 試料が完全に乾燥していない場合、さらに15分間空気乾燥。
gDNAの6。再水和
- サンプルが乾燥した後、乾燥させたgDNAペレットを再水和するトリス-EDTAを300μlを追加。
- 中程度の速度と場所で5秒間のボルテックスのサンプル1時間65℃の湯浴。
- 水浴からサンプルを取り出し、室温でO / Nインキュベートする。
注：すべての製 品および試薬材料表にリストされて使用されるだけでなく、 表4。
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結果
DNAは対になったDNA抽出のシリーズが行われた抽出のための最適なパラメータを決定すること。単一の唾液試料は、与えられた変数のための2つの可能な値の一つで分割し、各部分を試験した。各ペアの試験のうち、少なくとも8回の反復は、（ 例えば 、単一の唾液サンプルを用いて、初期50℃でのインキュベーションない場合の両方の抽出をテストするために等分した）を実施した。断片化を評価するために、総DNA収量、260/280値、260/230値、および泳動DNAの目視検査：最適化は、標準的な4つの測定基準に基づいていた。変数のすべてではない可能性のある組み合わせは、個別に各変数の限界効果を評価するために代わりに選ぶ、（N = 169の組み合わせ）の統計的な相互作用を評価した。効果は、マルチウェイ反復測定ANOVAを用いて試験し、推定効果は同等の回帰式から誘導した。すべての重要な効果は、AVERとして示し、 表1に要約されている歩留まりの年齢変化やDNAの質（260/280と260/230）（唾液入力の1mlあたりngの/μl）を。
蓄積バッファに...
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ディスカッション
本手順は、かなりDNAの品質を損なうことなく、標準的な方法に比べて高分子量DNAの収量が改善された最適化されたDNA抽出プロトコルである。収量を最大限に最も大きな影響を持つ重要なステップは、広く11を配布していなかったものを除く、ここでレビュー公開済みプロトコルよりエタノール沈殿中に長い遠心分離工程を含むステップ5.2であった。この長い遠心分離と関連するDNAの質の変更は全唾液コレクションから入手可能なDNAの大部分が分解され、高分子量ではないことを示し、検出されなかった。
全唾液収集は、収集段階で最小限に抑える必要があり、外国の汚染物質の可能性や、潜在する感染の徴候である可能性があり、サンプル中の過剰なタンパク質の存在として、サンプルの質の制限があります。タンパク質または外国の汚染物質の大量の缶それによって、定量化が不正確作り、最終的な抽出されたDNAに残る。残留タンパク質または汚染物質は、再水和の後に存在する場合（ステップ6）が疑われる試料クリーンアップサンプル入力ボリュームを反映するようにスケーリングされた試薬量を有するタンパク質沈殿工程から開始すること...
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作業は、国立衛生研究所R01（CWBへのDC009453支援）によって資金提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 15 mlの遠心分離機の管フィ | ッシャー12-565-268 | ||
| 細胞の溶解液 | Qiagen | 158908 | |
| のプロテイナーゼK | のΣ PσP6556 | ||
| 蛋白質沈殿物 | の液Qiagen | 158912 | |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 | |
| コーゲン | EZ-BioResearch | S1003 | |
| 70% エタノール | フィッシャー | 04-355-305 | |
| Tris-EDTA (TE) | フィッシャー | BP2473-1 | |
| NaCl | フィッシャー | AC194090010 | |
| トリス HCl | フィッシャー | BP1757-100 | |
| EDTA (0.5 M) ソリューション | フィッシャー | 03-500-506 | |
| ドデシル硫酸ナトリウム | フィッシャー | BP166-100 | |
| アナログの渦ミキサー | のフィ | ッシャー02-215-365 | |
| 遠心分離機5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
参考文献
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再版と許可
