マイクロスケール渦アシストシーケンシャル分子送達用エレクトロポ

Summary

マイクロ流体渦補助エレクトロポレーション·プラットフォームは、正確かつ独立した投与量制御を備え​​た同一の細胞集団への複数の分子の順次配信のために開発されました。分子の送達効率および加工細胞の生存率を向上させるために支援エレクトロポレーションの前に、システムのサイズベースの標的細胞精製工程。

Abstract

それは物理的に細胞内に非浸透性の外因性分子プローブを導入するための非常に強力な技術であるため、エレクトロポレーションは、過去数年間でますます注目を受けている。この作品は、精密な分子に依存するパラメータ制御で、哺乳動物細胞への複数の分子送達を行うことが可能なマイクロ流体電気穿孔プラットフォームを報告します。均一なサイズ分布を有する細胞を単離するシステムの能力は、与えられた電界強度あたりのエレクトロポレーション効率のより少ない変動を可能にする;したがって、サンプルの生存率を高めた。また、そのプロセスの可視化機能は、効率向上のために、その場で迅速な分子デリバリーパラメータ調整を可能にする、リアルタイムで蛍光分子の取り込み過程を観察することができます。報告されたプラットフォームの膨大な機能を表示するには、異なるサイズおよび電荷（3,000 70,000 DaでMWを有する、例えばデキストラン）を持つ巨大分子であったすべての試験した分子に対して高い送達効率（> 70％）で転移性乳癌細胞に送達する。開発プラットフォームは、オンチップエレクトロポレーション技術は有益である研究分野の拡大に使用するための可能性を証明した。

Introduction

近年では、細胞外分子のサイトゾル送達を容易にするために、電気パルスの使用は、哺乳動物細胞を操作する魅力的な手段となっている^。1もエレクトロポレーションと呼ばれるこのプロセスは、可逆的にアクセスするために、本 ​​質的に膜不透過性分子を可能にする、細胞膜を透過性に細胞の細胞内環境に。実質的に任意の分子がエレクトロポレーションを用いた細胞の任意のタイプの膜に一時的に作成細孔を介してサイトゾルに導入することができ、この技術はより再現性であると報告されており、普遍的に適用、およびウイルス媒介化学を含む他の方法よりも効率的であるため細胞が生存し、そのまま保ちながら光学的ア ​​プローチ^2-3この技術は、蛍光分子を導入する⁴医薬品⁵および核酸^6-7利用されている。これらの利点を考えると、エレクトロポレーションは、一般的な労働力として採用されているDNAトランスフェクションのためのatory技術、 インビボ遺伝子治療⁸および細胞ワクチン接種の研究。成功したエレクトロポレーションに必要な電界強度が密接に細胞の直径と相関するので、従来のエレクトロポレーションシステムは、同時に、サイズが大きな不均一性を有するサンプルのための実用的な効率および生存率を達成することは依然としては困難である。さらに、これらのシステムは、複数の分子量の正確な制御は、バルク確率的分子送達プロセスへの依存に起因して配信されることはできない^。9にこれらの問題に対処するために、多くのグループが、より低いポレーション電圧の利点を提供する、マイクロ流体エレクトロポレーション·プラットフォームを開発したより良いトランスフェクション効率、細胞死亡率の大幅な削減、および複数の分子を送達する能力^。10〜13これらの利点は、電極ピッチマイクロエレクトロポレーションシステムの小さなフットプリントにより可能となった長さは飛躍的に成功した配信のために必要な電圧を減少させ、サブミリメートルである。さらに、これらのマイクロエレクト​​ロポレーションシステムは、均一な電界分布を得ることができ、迅速に送達効率を高めつつ、縮小細胞死を生じ、発生した熱を放散する。これらのマイクロチップのための透明な材料を利用し、さらに迅速なパラメータ変更のためのエレクトロポレーションプロセスのその場観察ができます^。2,12しかし、投与量の制御とmolecular-と携帯依存のパラメータ制御の正確な新興研究および治療 ​​用途のために必要^{、6、 14-16は}依然として未解決のまま。

この研究は、標的細胞の予め選択された同一集団に順次複数の分子を送達することができるマイクロ流体渦アシストエレクトロポレーションシステムを提示する。均一なサイズ分布を有する細胞は、以前に報告されたSiを用いたエレクトロポレーションの前に単離されるぜ選択的捕捉機構^。17-18与えられた電界強度あたりのエレクトロポレーションの効率および拡張生存率の小さい変化が達成された、均一なサイズ分布を有することにより、 ^図19さらに、連続的に横切る分子の均一な送達のために許可されたマイクロスケールの渦を用いて捕捉された細胞を撹拌結果と一致する全体細胞質ゾルは、以前に別の渦アシストエレクトロポレーションプラットフォームを使用して報告した^。20このシステムは広範囲の分子量を有する巨大分子をに配信された、一般的に生物学的用途で利用される分子の広い範囲に適用可能であることを示すために転移性乳癌細胞。また、リアルタイムのプロセス監視の助けを借りて、この作品はelectrporation中の分子配信のメカニズムについての長年の論争に終止符を打つためのより多くの証拠を提供し、主に拡散媒介対電気泳動媒介されている^。14 他のエレクトロポレーションシステムとは異なり、このプラットフォームは、一意的に正確なマルチ分子送達、高分子送達効率、最小の細胞死、サイズ、送達分子の電荷の広いスパン、ならびにエレクトロポレーションのリアルタイム可視化を組み合わせた利点を提供するプロセス。これらの機能を考えると、開発したエレクトロポレーションシステムは、セルラーリプログラミング研究^{、6,14,21-22}薬物送達用途^10,19およびエレクトロ分子配信メカニズムの深い理解のために必要とするアプリケーションのための汎用ツールとして実用的な可能性を秘めています。

Protocol

1。細胞調製

1. リーボビッツL-15培地中で組織培養用T75フラスコあたり10 mlの容量でプレート転移性乳癌細胞株MDA-MB-231 1×10 ⁵細胞/ mlを、10％（v / v）のウシ胎児血清および1を補充％ペニシリン - ストレプトマイシン。
2. 0％CO ₂環境下で37℃の加湿インキュベーター中MDA-MB-231細胞をインキュベートします。
3. 2分間0.25％トリプシン-EDTAで細胞を処理し、増殖培地を8mlを添加することによりトリプシンの酵素活性を不活性化することにより2日間播種後の実験のために細胞を回収する。
4. 5×10 ⁵細胞/ mlの最終濃度になるようにダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（のCa ^{2 +}およびMgなしDPBS、1倍^{、2 +）}で200×gで再懸濁し、5分間の遠心分離により細胞をペレット化。

2デバイスの設計と製作

注：マスク、マスタ金型捏造とプロセスを囲むマイクロチャネルは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ鋳造法は、通常の実験室ベンチトップ上で実行することができるが、クリーンルームの内部に行われるべきである。

1. AutoCADのと、図1に示すように、マイクロ流体デバイスを設計します。デバイスは、（L = 7ミリメートルW =40μmであり、H = 70μm）を、複数の注入ポート、粗いフィルターと2平行な長方形の慣性中心にチャンネルの入口で構成する必要があります。個別のストレートチャンネルは、アルミニウム電極用の穴を介して2つとは別に800μmで配置されている5エレクトロポレーションチャンバー（W _C = 400μm）で構成されています。二つの横方向に隣接したエレクトロポレーションチャンバーは、負極用の穴を共有しています。二つのストレートチャンネルは、エレクトロポレーション領域の下流にある出口に合流する。
2. LinkCADを使用してGDSIIファイルに微細パターンを持つCADファイルを変換します。 5 "×5"フォトマスクブランク上に微細なパターンを書くレーザーマスク描画装置を用いた。製造業者のプロトコルに従って、マスクを開発する。 NOTE：マスク開発プロセスは、フォトレジストの現像、クロムエッチングおよびレジスト除去を含む。代替的に、高解像度の透明度（>2万解像度）に印刷微細パターンが第三者の製造業者から購入し、フォトマスクとして使用することができる。フォトマスク上の最終的なマイクロスケールの機能は、ネガ型フォトレジストの極性を一致させるために透明でなければならない。
3. 70μmの最終的な厚さを有するように、2000rpmで4インチシリコンウェハー上にネガ型フォトレジストスピンコートを有する標準ソフトリソグラフィー技術^23を用いて、デバイス設計の鋳型を製造する。
4. 95℃で20分間、ネガ型フォトレジストを有するウェーハをプリベーク。
5. ウェハマスクに連絡し、マスクアライナを使用して、80秒間UV源（17.4 MJ / cm ^2）とにさらす。
6. SU-8現像液中で4分間露光したウェハを開発する。
7. 測定表面形状を使用して、フォトレジストの厚さを開発しました。
8. エージェント（シリコーンエラストマーキット）を硬化するエラストマーの1の割合とPDMSレプリカを生成するために、鋳型に混合物を注ぐ。徹底10をミックス。 30分間の鋳造エラストマーを脱ガスし、2時間70℃のオーブン中で、脱気したエラストマーとの鋳型を硬化させる。
9. ピンバイスを使って入口、出口及び電極挿入用の金型とパンチ穴からマイクロ流路パターンを硬化したPDMSレプリカを剥離する。注：ピンバイスの通常の切刃径がしっかりと所定の位置にPEEKチューブ（1/32のOD」）とアルミニウム電極（0.029のOD」）を保持するための十分な0.76ミリメートル、である必要があります。
10. それぞれ、ガラス75 Wの高周波電力および酸素分圧で7秒間の酸素プラズマクリーナーで処理スライド500ミリトールにPDMSレプリカを接合することによって囲まれたマイクロ流体チャネルを作成する。

3フロー実験

1. インサートアルミニウム電極マイクロチャネル内のホールを介して指定の場所へ（0.029 "OD）と出口PEEKチューブ（1/32「OD）（ 図3Bを参照）。
2. アルミニウム電極への高電圧短方形波パルスを生成するための¹⁸責任の電気機器を接続PDMSモールド中の溶液を流すと接触している（ 図3C参照 ）。注：装置は、パルス発生器と、社内に構築高電圧アンプで構成する必要があります^18。
3. （ 図3A参照 ）は、4つの50ml遠心個別DPBSを含むチューブに、細胞および生体分子の溶液、および空気式流量制御システムに接続されたそれぞれのバイアルホルダーに各チューブを取り付けるを準備する^。18
4. マイクロ流体デバイス内の各入口穴にバイアルホルダーから入口PEEKチューブを接続します。
5. 電気FIEを有するために100 Vに、方形波パルス、Vの大きさを設定するldは強度は、E = V / Lの_電子 、電気室全体で0.7 kVの/ cmのと同等である。注：ここで、L _eは正および負の電極が流動する溶液と接触している2点間の距離である（ 図1を参照）。
6. 40 psiの圧力調整器を設定します。注：単一の手動調整可能な窒素源が均一にすべてのサンプルバイアルを加圧するために使用され、高速マニホールドが適時特注のLabVIEWソフトウェアを使用して、個別のソリューションポートを活性化するために利用される¹⁸
7. バルブ制御のために、 バルブランナーラベル特注のLabVIEWソフトウェアを開き、操 ​​作する権利を有するドロップダウンメニューから実行]をクリックします。
8. 各対応するバルブのアイコンをクリックすることで、バルブの電源をオンにします。注：それが活性化されると、バルブのアイコンが緑色に点灯します。アクティブなアイコンをクリックすると、非アクティブにし、バルブを閉じます。閉弁アイコンがグレーに変わります。
9. （DPBSリザーバー用のバルブを開けすなわち、1.5分間の安定な細胞トラップ渦発生に必要な主要な流速に洗浄液）。
10. 30秒（ すなわち 、細胞捕捉ステップ）のためのエレクトロポレーションチャンバー内のトラップ細胞に対する細胞溶液を洗浄溶液から活性溶液ポートを切り替えます。
11. ソリューション切り替えステップ中の破壊されていない流れを確保するために、細胞捕捉工程の前に10秒間、同時にデバイスを介して両方の洗浄および細胞のソリューションフロー。注：この簡潔な並行流ステップは、各ソリューション切り替えステップで繰り返されるべきである。
12. 洗浄ポートの電源を入れ、非捕捉された混入細胞を除去するために、20秒間のデバイスをフラッシュします。
13. デバイスに関心のある第一の分子（3,000 Daの中性及びアニオン性デキストラン分子の0.2 mg / mlの70,000 Daのニュートラルデキストラン分子の1.5 mg / mlの）を含有する溶液を注入する。
14. 速やかに注入した後5短パルス（Δtは2秒間隔で30ミリ秒=）を適用分子溶液およびオシロスコープを使用してリアルタイムに印加される電気パルスの大きさおよび持続時間を監視します。
15. 配信される追加の分子の数な回数だけ繰り返し手順3.10。各分子送達のために、余分な分子を除去するために100秒間洗浄溶液でデバイスをフラッシュし、その後、分子溶液に100秒間細胞をインキュベート。
16. 5 psiの下の運転圧力を低下させることにより、下流解析のために、96ウェルプレート内の細胞を解放します。注：100細胞を用いた溶液約100μlを各リリースから収集されます。
17. 実験的には、フローサイトメトリーのために十分な細胞を収集するために3.16三回を通じて3.9ステップ実行します。
18. 228×gで5分間処理された細胞を含む96ウェルプレートを遠心する。
19. 過剰な蛍光分子を含有する上清を取り除きます。
20. フローサイトメトリー分析のためにDPBSで細胞を再懸濁します。
21. 分子のuのためのフローサイトメーターでのロードセル効率分析をptake。

Results

開発された並列マイクロ流体エレクトロは、転移性乳癌細胞を生きたに多様なサイズと電荷を持つ高分子を送達した。成功した分子の送達は、定性的にその場で電気穿孔周回細胞の蛍光強度の変化を監視することによって決定し、フローサイトメトリー分析によって定量的測定によって確認した。 図4Aは、処理された細胞の90％が70,000 Daの中性デキストランを取り込むことを示している。統計分析のために、各フルオロフォアについての強度閾値は、未処理の生きた細胞の大部分（> 99％）が閾値以下にカウントされるように確立された（図4（c）参照 ）。効率は、正常に処理された細胞の総数に対する目的の分子を取り上げる細胞数の比として定義される。 図4Bは効率が実質的分子に依存して変化しないことを示して重量または電荷（P> 0.1）。すべての試験されたデキストラン分子は、70％よりも高い効率で細胞質ゾルに送達された。また、 図4Dは、シーケンシャルな分子の送達に成功し、同一の分子量（MW = 3000ダルトン...

Discussion

スループットおよび多分子送達の効率の新しい並列化エレクトロポレーションプラットフォーム、10倍の増強に以前に開発単室システムが提供する全ての利点に加えて、達成された^。18以前は利用可能なメリットは、（i）予備精製が含まれる生存能力増強のための均一なサイズ分布、（ii）の正確かつ個別分子の投薬管理、および（iii）低い運用電流を有する細胞を標的とする。これらは、分子量、共役フルオロフォアの種類、及び電荷の広い範囲で容易に利用可能であるため、蛍光標識デキストランは、目的の分子として選択した。彼らは生きている細胞のための不透過性の本質的に膜であり、細胞毒性を示さないので、これらのマクロ分子は、そのような研究のための良好な候補である^。24最適な蛍光デキストランの濃度、インキュベーション時間、および電気的パラメータは、従来トン、現在のシステムのために同定されたエレクトロポレーション実験O。最適化プロセスによるリアルタイムでの分子の取り込みプロセスを監視するためのプラットフォームの能力をかなり単純かつ効率的であった。少しツーなしエレクトロポレーションパラメータの知識を有する分子または細胞型が試験されている...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 がん細胞株	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-26
Leibovitz's L-15 Medium	Cellgro, メディアテック	10-045-CV
ウシ胎児血清 (FBS)	Gibco, Life Technologies	16000-044
ペニシリン-ストレプトマイシン	Sigma-Aldrich	P4333
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)	Cellgro, Mediatech, Inc.	21-030
Trypsin	Gibco, Life Technologies	25200-056
Flow Cytometer easyCyte HT	Millipore	0500-4008
酸素プラズマクリーナー	Technics Micro-RIE
Dektak 6M 表面プロファイラー	Veeco
KMPR 1050	Microchem
SYLGARD 184 シリコーンエラストマーKIT	ダウ コーニング
圧縮窒素ガス	エアガス	NI 300
高圧レギュレータ	McMaster-Carr	6162K22
ダウンストリームレギュレータ	McMaster-Carr	4000K563
高速 3/2way-8 バルブマニホールド	Festo
インラインチェックバルブ	Idex Health and Science	CV3320
5/32" OD x 3/32" ID ポリウレタンチューブ	Pneumadyne	PU-156F-0
1/4" OD X 0.17" ID ポリウレタンチューブ	Pneumadyne	PU-250PB-4
1/16" PEEK チューブ	Festo	P1533
1/32" PEEK チューブ	Idex Health and Science	P1569
PEEK チューブユニオン	Idex Health and Science	P881
パルス発生器	HP	8110A
アルミワイヤー	ボブマーティン	カンパニー6061ミョウバン
オシロスコープ	Agilent	DSO3062A
50ml遠心分離管VWR		21008-178
15ml遠心分離管	VWR	21008-216
T75培養フラスコ	VWR	82050-862
デキストラン、テトラメチルローダミン、3,000 MW、アニオン性	ギブコ、Life Technologies	D3307
デキストラン、テトラメチルローダミン、70,000 MW、中性	Gibco, Life Technologies	D1819
Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral	Gibco, Life Technologies	D3329