マイクロ流体渦補助エレクトロポレーション·プラットフォームは、正確かつ独立した投与量制御を備えた同一の細胞集団への複数の分子の順次配信のために開発されました。分子の送達効率および加工細胞の生存率を向上させるために支援エレクトロポレーションの前に、システムのサイズベースの標的細胞精製工程。
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この記事について
サマリー
要約
それは物理的に細胞内に非浸透性の外因性分子プローブを導入するための非常に強力な技術であるため、エレクトロポレーションは、過去数年間でますます注目を受けている。この作品は、精密な分子に依存するパラメータ制御で、哺乳動物細胞への複数の分子送達を行うことが可能なマイクロ流体電気穿孔プラットフォームを報告します。均一なサイズ分布を有する細胞を単離するシステムの能力は、与えられた電界強度あたりのエレクトロポレーション効率のより少ない変動を可能にする;したがって、サンプルの生存率を高めた。また、そのプロセスの可視化機能は、効率向上のために、その場で迅速な分子デリバリーパラメータ調整を可能にする、リアルタイムで蛍光分子の取り込み過程を観察することができます。報告されたプラットフォームの膨大な機能を表示するには、異なるサイズおよび電荷（3,000 70,000 DaでMWを有する、例えばデキストラン）を持つ巨大分子であったすべての試験した分子に対して高い送達効率（> 70％）で転移性乳癌細胞に送達する。開発プラットフォームは、オンチップエレクトロポレーション技術は有益である研究分野の拡大に使用するための可能性を証明した。
概要
近年では、細胞外分子のサイトゾル送達を容易にするために、電気パルスの使用は、哺乳動物細胞を操作する魅力的な手段となっている。1もエレクトロポレーションと呼ばれるこのプロセスは、可逆的にアクセスするために、本 質的に膜不透過性分子を可能にする、細胞膜を透過性に細胞の細胞内環境に。実質的に任意の分子がエレクトロポレーションを用いた細胞の任意のタイプの膜に一時的に作成細孔を介してサイトゾルに導入することができ、この技術はより再現性であると報告されており、普遍的に適用、およびウイルス媒介化学を含む他の方法よりも効率的であるため細胞が生存し、そのまま保ちながら光学的ア プローチ2-3この技術は、蛍光分子を導入する4医薬品5および核酸6-7利用されている。これらの利点を考えると、エレクトロポレーションは、一般的な労働力として採用されているDNAトランスフェクションのためのatory技術、 インビボ遺伝子治療8および細胞ワクチン接種の研究。成功したエレクトロポレーションに必要な電界強度が密接に細胞の直径と相関するので、従来のエレクトロポレーションシステムは、同時に、サイズが大きな不均一性を有するサンプルのための実用的な効率および生存率を達成することは依然としては困難である。さらに、これらのシステムは、複数の分子量の正確な制御は、バルク確率的分子送達プロセスへの依存に起因して配信されることは....
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プロトコル
1。細胞調製
- リーボビッツL-15培地中で組織培養用T75フラスコあたり10 mlの容量でプレート転移性乳癌細胞株MDA-MB-231 1×10 5細胞/ mlを、10％（v / v）のウシ胎児血清および1を補充％ペニシリン - ストレプトマイシン。
- 0％CO 2環境下で37℃の加湿インキュベーター中MDA-MB-231細胞をインキュベートします。
- 2分間0.25％トリプシン-EDTAで細胞を処理し、増殖培地を8mlを添加することによりトリプシンの酵素活性を不活性化することにより2日間播種後の実験のために細胞を回収する。
- 5×10 5細胞/ mlの最終濃度になるようにダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（のCa 2 +およびMgなしDPBS、1倍、2 +）で200×gで再懸濁し、5分間の遠心分離により細胞をペレット化。
2デバイスの設計と製作
注：マスク、マスタ金型捏造とプロセスを囲むマイクロチャネルは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ鋳造法は、通常の実験室ベンチトップ上で実行することができるが、クリーンルームの内部に行われるべきである。
- AutoCADのと、図1
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結果
開発された並列マイクロ流体エレクトロは、転移性乳癌細胞を生きたに多様なサイズと電荷を持つ高分子を送達した。成功した分子の送達は、定性的にその場で電気穿孔周回細胞の蛍光強度の変化を監視することによって決定し、フローサイトメトリー分析によって定量的測定によって確認した。 図4Aは、処理された細胞の90％が70,000 Daの中性デキストランを取り込むことを示している。統計分析のために、各フルオロフォアについての強度閾値は、未処理の生きた細胞の大部分（> 99％）が閾値以下にカウントされるように確立された（図4（c）参照 ）。効率は、正常に処理された細胞の総数に対する目的の分子を取り上げる細胞数の比として定義される。 図4Bは効率が実質的分子に依存して変化しないことを示して重量または電荷（P> 0.1）。すべての試験されたデキストラン分子は、70％よりも高い効率で細胞質ゾルに送達された。また、 図4Dは、シーケンシャルな分子の送達に成功し、同一の分子量（MW = 3000ダルトン.......
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ディスカッション
スループットおよび多分子送達の効率の新しい並列化エレクトロポレーションプラットフォーム、10倍の増強に以前に開発単室システムが提供する全ての利点に加えて、達成された。18以前は利用可能なメリットは、（i）予備精製が含まれる生存能力増強のための均一なサイズ分布、（ii）の正確かつ個別分子の投薬管理、および（iii）低い運用電流を有する細胞を標的とする。これらは、分子量、共役フルオロフォアの種類、及び電荷の広い範囲で容易に利用可能であるため、蛍光標識デキストランは、目的の分子として選択した。彼らは生きている細胞のための不透過性の本質的に膜であり、細胞毒性を示さないので、これらのマクロ分子は、そのような研究のための良好な候補である。24最適な蛍光デキストランの濃度、インキュベーション時間、および電気的パラメータは、従来トン、現在のシステムのために同定されたエレクトロポレーション実験O。最適化プロセスによるリアルタイムでの分子の取り込みプロセスを監視するためのプラットフォームの能力をかなり単純かつ効率的であった。少しツーなしエレクトロポレーションパラメータの知識を有する分子または細胞型が試験されている.......
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開示事項
著者らは、開示することは何もない。
謝辞
この作品は、ローランドジュニア·フェロー· プログラムによってサポートされています。クリス·ストークス特注の、コンピュータ支援圧力制御のセットアップ博士ダイアンSchaak、の開発に彼の助けのため：著者はハーバード大学ローランド研究所の科学者やスタッフに感謝の意を表したいと思います生体試料処理のための彼女の入力、電気セットアップを開発するためのウィンフィールド·ヒル、Alavaroサンチェス博士のための圧力のセットアップに必要な機械の配管部品を機械加工するためのフローサイトメーター、スコットBevis、ケニースペンサーとドンロジャースへのアクセスを許可する。マイクロ流体のマスターは、ハーバード大学のナノスケールシステムセンター（CNS）で作製した。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| MDA-MB-231 がん細胞株 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Cellgro, メディアテック | 10-045-CV | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| 酸素プラズマクリーナー | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M 表面プロファイラー | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 シリコーンエラストマーKIT | ダウ コーニング | ||
| 圧縮窒素ガス | エアガス | NI 300 | |
| 高圧レギュレータ | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| ダウンストリームレギュレータ | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| 高速 3/2way-8 バルブマニホールド | Festo | ||
| インラインチェックバルブ | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32" ID ポリウレタンチューブ | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID ポリウレタンチューブ | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK チューブ | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK チューブ | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK チューブユニオン | Idex Health and Science | P881 | |
| パルス発生器 | HP | 8110A | |
| アルミワイヤー | ボブマーティン | カンパニー6061ミョウバン | |
| オシロスコープ | Agilent | DSO3062A | |
| 50ml遠心分離管VWR | 21008-178 | ||
| 15ml遠心分離管 | VWR | 21008-216 | |
| T75培養フラスコ | VWR | 82050-862 | |
| デキストラン、テトラメチルローダミン、3,000 MW、アニオン性 | ギブコ、Life Technologies | D3307 | |
| デキストラン、テトラメチルローダミン、70,000 MW、中性 | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
参考文献
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W.
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再版と許可
