方法論記事

ギャップ結合審査のための機能アッセイ;インジウム - スズ酸化物に対する接着した細胞のエレクトロポレーション

DOI：

10.3791/51710

⸱

2014年10月18日

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1Department of Microbiology and Immunology and Department of Pathology, Queen's University, 2Ask Science Products Inc.

この記事について

サマリー

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このプレゼンテーションでは、接着性のある培養細胞のエレクトロポレーションを細胞間接合部のコミュニケーションの研究に使用し、細胞が導電性で透明な酸化インジウム-スズでコーティングされたスライド上で成長する方法を示します。

要約

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この技術では、透明で導電性のある材料であるインジウムスズ酸化物(ITO)で部分的にコーティングされたスライドガラス上で細胞を培養します。 ペプチドやオリゴヌクレオチドなどのさまざまな分子を、非外傷性の方法で細胞の基本的に100%に導入できます。ここでは、細胞間ギャップ結合コミュニケーションの研究にどのように使用できるかを説明します。 ルシファーイエローは、細胞が成長している導電性表面に電気パルスが印加され、細胞膜を介して細孔が形成されると、細胞内に浸透します。 これがエレクトロポレーションです。 エレクトロポレーション領域に隣接する非導電性ガラス表面で増殖する細胞は、エレクトロポレーションによってルシファーイエローを取り込まず、エレクトロポレーション細胞に結合するギャップ結合を介して蛍光色素を獲得します。細胞から細胞への色素の移動の結果は、蛍光照明下で顕微鏡で観察できます。 この技術により、ギャップ接合部通信の正確な定量が可能になります。 さらに、ペプチドまたは他の非透過性分子の導入に使用することができ、ギャップ結合を介して小さなエレクトロポレーションペプチドを移動させて隣接する非エレクトロポレーション細胞のシグナルを阻害することは、シグナル阻害の強力なデモンストレーションです。

概要

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セルへの電流の印加は、エレクトロポレーションと呼ばれるプロセスにより、細胞膜上の細孔の形成を引き起こす。細孔は膜を通してnonpermeant多様な分子の通過を可能にする。形成された細孔が非常に小さく、細胞生理に最小限の妨害で、急速に再閉鎖するように電場が、正確に制御することができる。興味深いことに、接着細胞は懸濁液中でエレクトロポレーションすることが切り離されることなく、それらが成長する表面上にある導電性および透明なインジウム-スズ酸化物（ITO）でコーティングし、 その場で電気穿孔し、スライドガラス上に成長させることができる。細胞は、この表面上に非常によく成長することができ、そしてそれらが結合拡張されると、詳細な顕微鏡観察が可能である。この技術を用いて、小nonpermeant分子は、コンプの活性化に関する研究のためのこの技術は特に適しており、瞬時に細胞の本質的に100％に導入することができる（1件）受容体のリガンド刺激後の経路のonents。

エレクトロポレーション（electrotransfectionも呼ばれる）DNAの導入のために主に使用されてきた。しかしながら、in situでエレクトロポレーションが転写因子の結合、またはsiRNA 3,5阻害するためにアンチセンスRNA、二本鎖DNAデコイオリゴヌクレオチドなどのようなペプチド2-4、オリゴヌクレオチド分子は、多種多様の導入のために有益であることができ、 6、放射性ヌクレオチド7-10、タンパク質11 12またはプロドラッグ13。エレクトロポレーション後、細胞を生化学的分析のために溶解または固定し、抗体で染色することができる。

細胞は、導電性コーティングの縁を横切って成長するように、細胞増殖は、2つの表面の高さの差によって乱されないように導電性ITOコーティングは、800-1,000Å非常に薄い。これは、非electrop利点を提供していますorated細胞を対照として使用するために、エレクトロポレーションのものと並行して成長させることができる。ビデオと同様のアプローチは、ギャップ結合細胞間コミュニケーション（GJIC）の検査のために使用することができる。

ギャップ結合は、隣接するセル14の内部を接続するチャネルである。そのようなsrcと癌遺伝子がGJIC 15,16を抑制しながら、ギャップ結合は、細胞間の通信は、腫瘍形成および転移に重要な役割を果たしている。 GJICを調べるために、イエロールシファー（LY）のような蛍光色素は、多くの場合、マイクロインジェクションを介して培養細胞に導入したりこすっロード17と隣接するセルへの色素の拡散を顕微鏡、蛍光照明下で観察されている。これらの技術は、しかしながら、常に、細胞損傷を引き起こす。現在、細胞が部分的にITO 18で被覆されたガラススライド上で増殖させる技術が記載されている。電気パルスは、CA LY（または他の色素）の存在下で適用した隣接する、非エレクトロポレーションした細胞への染料の移動を顕微鏡、蛍光照明で観察しながら、スライドの導電部に増殖している細胞への浸透を使用して。単層から剥離する傾向が妨害感受性細胞を避けるために、電極を必要としない設計されたアセンブリは、電流19を印加するセルの上に配置される。このアプローチは、多数のセルにGJICを定量する能力を提供し、細胞代謝に検出可能な妨害なしに、血清刺激12を次のG1期の長さに対する効果の欠如によって示されるように、fosのレベルの増加癌原遺伝子タンパク質（ラプティス、未発表）、または細胞ストレス、p38の豚やJNK / SAPKキナーゼ1に関連付けられた2つのキナーゼ。このアプローチは、癌遺伝子発現、形質転換及びGJのレベルの間のリンクの検査を可能にしたIC 18と同様に、肺腫瘍標本20〜23から新たに培養した細胞を含む多様な細胞型におけるGJICの際にはSrcおよびStat3の効果。また、基板への細胞付着はその段階19,24で減少しているが、成功した脂肪細胞分化の際にギャップ結合閉鎖のデモンストレーションのために使用されている上部電極を欠いて説明した設定と、その場でのエレクトロポレーション。

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プロトコル

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1エレクトロポレーションチャンバー内の細胞をプレーティング

  1. 層流フード中で、いつものように、滅菌技術を用いて細胞をトリプシン処理。
    注：これらは、したがって、ガラス上の細胞のアドヘレンとギャップ結合の形成を妨げる可能性が広がるので、それは、遠心分離によってトリプシンの痕跡をすべて排除することは非常に重要である。
  2. 37°Cの CO 2インキュベータ内で、その場でエレクトロ（ 図1）、および場所を提供無菌エレクトロポレーションチャンバー中の細胞懸濁液のピペット1ミリリットル。
    注：細胞接着は、フィブロネクチン、コラーゲン、ポリリジン、ま​​たは細胞および組織接着剤（材料表を参照）上にプレーティングすることによって改善することができる。
  3. 細胞がコンフルエント層を形成しているとき、彼らはGJIC試験の準備ができている。

2エレクトロポレーション手順

GJIC検査用エレクトロポレーションは、層流フードの外側に行うことができるそれはほんの数分かかりますので、。より長いインキュベーション時間は、特定の実験に必要とされる場合、それは層流フード内で完全に実施することができる。全ての場合において、細胞が増殖されるチャンバは無菌でなければならない。

  1. 5 mg / mlのルシファー黄色の溶液を準備します。2ミリリットルカルシウムを含まない増殖培地中で（エレクトロ付属）10mgのLY粉末を溶かす。より長いインキュベーション時間を必要とする実験のために、4℃。で溶液とストアをフィルター滅菌
  2. 増殖培地を吸引し、単層を傷つけたり、細胞を乾燥しないように注意して、カルシウムを含まない培地で細胞を洗浄。細胞が乾燥している場合は、彼らは通常より暗い核を持っているし、エレクトロポレーションすることなく、LYを拾う。効果はより多くの空気ドラフト（ 図4F）にさらされているスライドの途中でより顕著である。
  3. チャンバーの端にある細胞（全体のチャンバのための400μlの）へのエッペンドルフピペット、ピペット色素溶液において、a、bとの細胞層に触れないように注意しeing。
  4. エレクトロ付属のホルダーに室を置き、適度な強度（考察を参照）のパルスを適用します。
  5. 慎重にLY液の一部を吸引。これは、それほど重要での実験のために二度目に再使用することができる。
  6. 10％透析血清を含むカルシウムを含まないDMEMを追加します。
  7. ギャップ結合を介して色素転写を可能にするためにインキュベーター内で3〜5分間、細胞をインキュベートします。
    注：この時点での透析血清を含むことは、気孔の閉鎖を支援します。
  8. 生細胞観察用のカルシウムを含まないDMEMで取り込まれていない色素を洗ってください。あるいは、細胞をPBS（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、その後、ウェルに4％ホルムアルデヒドの添加によって、この段階で固定することができる。すべての場合において、洗浄はすべてのバックグラウンドを削除する必要があります。
    注：電圧が低すぎる場合に最適な条件を決定するための予備実験では、それは細胞がincubatoに回復させることが可能である数分間rとスライドのコスト節約するために、同じスライドをもう一度エレクトロポ。

3顕微鏡検査

  1. 使用されている染料のための適切なフィルターを装備した倒立顕微鏡を用いて、蛍光照明下で細胞を観察します。黄色ルシファーのために、励起が423nm、放射555nmの、ニコンIX70顕微鏡用WBVフィルタです。
  2. 位相コントラスト下の細胞形態を調べるために、液体でトップにそれを充填した後、穴プラスチックの上にガラスカバースリップを配置することによって、メニスカス効果を排除します。より良い写真のために、ウェルをスライドから取り外すことができ、カバースリップは、フレーム上に置いた。生きた細胞については、増殖培地で充填されなければならないが、固定した細胞については、ウェルは、顕微鏡観察のためにグリセロールを充填することができる。
    注：細胞が色素（上記のステップ2.7）の転送以下のホルムアルデヒドで固定している場合は洗浄して撮影が容易になります。細胞がある場合はありませんtは固定、蛍光はLYの細胞タイプ、電圧、および量に応じて約60分以内に細胞から除去される固定された細胞に蛍光を数時間保持している間に導入した。しかし、蛍光が消えたり、固定した細胞では、O / Nインキュベートした後に消散する。このため、写真は、エレクトロポレーション（ 図2）の後にすぐに注意する必要があります。

細胞間コミュニケーションの4。定量

  1. 蛍光および位相差（ 図3）の下で20倍を目的とした細胞を撮影。
  2. 非電気穿孔面積（ 図2、矢印、エレクトロポレーションエッジ）との国境でのエレクトロポレーションした細胞を同定し、スターとマークします。
  3. 染料はギャップ結合を介して転送されている非電気穿孔側、上の蛍光細胞を特定し、ドットマーク（ 図3Aおよび3B）。
  4. の合計数で割り縁部（ 図3Aおよび図3B）に沿ってエレクトロポレーションした細胞の数で非エレクトロポレーション領域上の細胞を蛍光を発する。
    注：少なくとも200個の連続電気穿孔境界セルからの転送を各実験について計算される。得られた数は、GJIC値です。

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結果

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図2は、固定および洗浄後、ラット肝臓上皮T51Bセル22、LYで電気穿孔し、蛍光（パネルAおよびB）下で撮影、または位相差（C）は、照明を示している。パネルAには、エレクトロポレーション領域のエッジは赤でマークされています。赤線の右側にある蛍光の勾配はギャップ結合を介して転送を示している。染料が転送された細胞は、ドットでマークしながら、エレクトロポレーション領域の端にある細胞は、星で識別し、マークした。図3Aと図3Bは、ギャップ結合コミュニケーションの定量を示している。比率は、染料がエレクトロポレーション境界セルあたりに移した細胞の平均数を示しています。この例では57ドットと10つ、 すなわち 、GJIC = 5.7があります。

CおよびD、転写-3のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター（Stat3の）にT51B細胞tの中でダウンレギュレートされているレンチウイルスベクターによる安定したsiRNA発現hrough、及びトランスフ...

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ディスカッション

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プロトコルの重要なステップ

電気穿孔材料
エレクトロポレーションされる材料の純度が非常に重要である。細胞は非常に平坦である場合には、追跡用色素のより高い濃度が使用されなければならない（LYための最大20 mg / ml）をそのような場合には、純度がより重要より球形1細胞よりなる。 LY以外に他の染料またはnonpermeant分子の多種多様なそのような異なるコネキシン25からなるチャネルのためのプローブとして使用するためのAlexa色素シリーズとして、使用されてきた。核は（ 図4D）色素転写の定量がより難しくなる、非常に強く蛍光を発するようにしたが、臭化エチジウムまたはヨウ化プロピジウムなどの染料は、DNAにインターカレートされている。カルシウム流入が接合通信を中断、ならびにセルを低減することができるので、トラッキング色素が調製されなければならず、洗浄は、カルシウムを含まない増殖培地中で実施lの生存率。すべての溶液は、細孔の閉鎖及び生存率1を...

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開示事項

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責任著者は、Cell Projects Inc.にライセンス供与されているクイーンズ大学が保有する特許の発明者です。 会社や大学は論文の内容に影響を与えませんでした。

謝辞

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専門家のビデオ撮影の支援を提供してくださったLowell Cochranに感謝します。 カナダ衛生研究所(CIHR)、カナダ乳がん財団(CBCF、オンタリオ支部)、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)、カナダ乳がん研究同盟、オンタリオセンターオブエクセレンス、乳がんアクションキングストン、クレアネルソン遺贈基金からのLRへの助成金を通じた財政支援に感謝します。 SGはNSERCの学生資格の受領者でした。 MGは、米国陸軍乳がんプログラム、オンタリオ州研究イノベーション省、クイーンズ大学の諮問研究委員会からのポスドクフェローシップによって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEMCellgro http://www.cellgro.com/50-013-PB
カルシウムを含まないDMEM(Thermo scientific:http://www.thermoscientific.com)SH30319-01
ドナー子牛血清 PAA: http://www.paa.com/Cat.# B15-008
ウシ胎児血清PAA: http://www.paa.com/Cat.# A15-751
エレクトロポレーション装置Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ACE-100
ChambersCell Projects LtdUK ACE-04-CC4-wells
ChambersCell Projects Ltd UKACE-08-CC8-wells
Lucifer Yellow CellProjects Ltd UKACE-25-LY高純度
CelTakBD Biosciences354240細胞および組織接着剤
フィブロネクチンSigma AldrichF1141
コラーゲンBD Biosciences354236
Poly-LysineSigma AldrichP8920
ハイクロン

参考文献

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