ゲノムコピー数変異体の検出のためのアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）

Summary

ゲノムコピー数変異の検出のためのアレイCGHは、Gバンド核型分析に取って代わった。本論文では、技術や診断サービスの研究室への応用について説明します。

Abstract

Array CGHは、Gバンド核型解析に取って代わりました。このホワイトペーパーでは、臨床診断サービスラボでのテクノロジーとその応用について説明します。患者のサンプル(血液、唾液、またはその他の組織タイプ)から抽出されたDNAは、蛍光色素(シアニン5またはシアニン3)で標識されます。参照DNAサンプルは、反対の蛍光色素で標識されます。その後、標識されたDNAを混合してハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁し、ゲノム全体の遺伝子座から~60,000のオリゴヌクレオチドプローブを含むアレイに適用する前に、取り込まれていないヌクレオチドを除去するクリーンアップステップが続き、臨床的に重要な領域でプローブ密度が高くなります。ハイブリダイゼーション後、アレイを洗浄し、スキャンして得られた画像を分析して、各プローブの赤と緑の蛍光を測定します。ソフトウェアは、各プローブ測定の品質を評価し、赤色と緑色の蛍光の比率を計算し、潜在的なコピー数バリアントを検出するために使用されます。

Introduction

これは、欠失または染色体セグメントの余分なコピーが知的障害、異形症とcongentical奇形を引き起こすことを長年にわたって知られており、いくつかのケースでは、遺伝的症候群^1を引き起こしてきた。しかし、これらの変化のゲノムワイド検出のため2000年代半ばまで、利用可能な唯一の技術は、不均衡の地域や性質に応じて、5-10Mb周りの解像度を持つG-バンド染色体分析、で、そのことはできません材料が同じバンドパターンと異なる染色体から地域によって置き換えられている異常な染色体を検出する。そのようなin situハイブリダイゼーションと多重ライゲーション特異的プローブ増幅における蛍光として補助的な細胞遺伝学的技術が疑われる特定の症候不均衡例では、特定の遺伝子座の尋問のために利用されてきたが、それは、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）の導入までではなかった日常の臨床診断の中にコピー数変異体（のCNV）のゲノムワイド検出が（通常は120キロバイト程度）を大幅に増加した解像度で可能になったervice ^2-5。一部の地域では正常な集団^6-7で普及しているための調査研究と並んで臨床サービス作業は、他のCNVながら、以前に検出できない、そのような自閉症やてんかん^8-11などneurodisabilitiesと関連している、のCNVことが示されている。

Protocol

1.標識反応

1. 96ウェルプレートおよび使用の準備-20℃で保存し、製造業者が推奨する濃度において、プレアリコートシアニン3及び5標識dUTPs、非標識ヌクレオチドおよびランダムプライマーを使用する前に。このプロトコルは、各ウェルにdUTPを10.5μlの未標識ヌクレオチドおよびランダムプライマーを標識し、適切のアリコート10.5μlのの目的のために。
2. 光から保護し、約1時間、4℃でヌクレオチドおよびプライマーのすぐに使用できる96ウェルプレートを解凍する。
3. 解凍後は、光から保護し、少なくとも30分間室温でこのプレートを平衡化する。
4. 少なくとも15分間、60℃でDNAサンプルを平衡化する。
5. 液体ハンドリングロボットを用いて、96ウェルプレートの各ウェルにヌクレアーゼフリー水を分配する。
   注記：水の体積は、各入力DNA試料の濃度に依存し、そして/μlの最終濃度50ngをもたらすのに十分であるべきである。
6. 液体漢の使い方dlingロボット、96ウェルプレートのウェルにピペット1μgのDNAは、（1.5を参照）20μlに全量を。
   注記：結果データの品質が損なわれる可能性があるが、DNAの小さい量を使用することができる（貴重なサンプルのために、400ngのまでインプットDNA量を使用することができる）。
7. 液体ハンドリングロボットを用いて、希釈したDNAのプレートの各ウェルに平衡化ヌクレオチ....

Results

ハイブリダイズしたアレイ上の各プローブは、赤と緑の蛍光色素の混合物として可視化される（ 図1参照）。各プローブのための緑色蛍光信号に赤の比率は、スキャナによっ​​て定量化され、関連するソフトウェアは、それらのゲノム位置に応じてLOG2比としてこれらをプロットし、プリセットの境界の外に落下する領域を特定します。結果の配列トレースは、ゲノムのアンバランスとして同定された領域の解釈を可能にする。例えば、ウィリアムズ症候群、染色体7の近位領域内の低コピー反復配列によって媒介される定期的な微小欠失症候群の子供からのトレースは、 図2に示されている。この不均衡は、ソフトウェアによって識別され、赤線で示した。

ゲノムの正常な領域に対して1：1の緑/赤の割合を示す、 図2に示すように、蛍光対数比は、0の周りに密接にクラスタ化する必要があり、プローブ。散在配列トレースはresulあり不正確な異常部位の通話、またはゲノム不均衡を同定するための失敗トン（ 図3参照）。こ.......

Discussion

アレイCGHは、三倍体としてバランスのとれた再構成または倍数性異常を検出しません。さらに、低レベルのモザイク不均衡が検出されないことがある。しかし、アレイCGHは、多くの細胞遺伝学研究室で置き換えたG-バンド染色体分析よりCNVを検出するためのより高い解像度を有する。したがって、ゲノムワイドなCNV検出のための現在のゴールドスタンダードです。これは、将来的には、次世代配列決定技術に置き換えることができるが、現在、それらのコストおよび技術的な複雑さは、これはまだ臨床使用に適していないことを意味するCNVの検出のために読み取る短い使用に関連する。

ここに記載されているプロトコルは、当社の臨床サービス実験室での日常的な使用である。 96サンプルずつの2ランは、液体処理ロボットや専用のシリカ膜スピンカラム処理ロボットを用いて毎週処理されます。自動化が非常に一貫性を改善し、品質を維持することをお勧めします。血液から抽出したDNA、唾液、出生前のサンプル（ 例えば、絨毛膜絨毛または羊水）または組織サンプルは、日常場合、このプロトコルで使用することができる。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGHマイクロアレイ 8 x 60K	Agilent	G4126
CGH洗浄バッファー	Agilent	5188-5226
アレイCGHハイブリダイゼーションバッファー	Agilent	5188-5380
Minelute精製キット	Qiagen	28006
アレイCGHラベリングキット	Enzo	ENZ-42672-0000