最適化された合成表面を使用した肝細胞表現型の安定化

Summary

この記事では、ヒト肝細胞を由来幹細胞の長期、安定的な培養のためにポリマーコーティングされた表面の開発に注力していきます。

Abstract

現在、細胞生物学における主要な制限の一つは、分化した細胞表現型を維持することです。生物学的マトリックスは、初代幹細胞および多能性幹細胞由来の肝細胞の培養と維持に一般的に使用されます。生物学的マトリックスは有用ですが、肝細胞の短期間の培養を可能にするため、広範な適用が制限されます。私たちは、合成ポリマーコーティングを使用して制限を克服することを試みました。ポリマーは、生体材料の中で最も広範なクラスの1つであり、幅広い機械的、物理的、化学的特性を備えており、目的に合わせて微調整できます。重要なことは、このような材料は、品質保証された基準に合わせてスケーリングし、バッチ間の一貫性を示すことができるということです。これは、医薬品検査業界での高スループットスクリーニングや細胞ベースの治療のために細胞を増殖させる場合に不可欠です。ポリウレタン(PU)は、細胞培養で有望視されている材料の1つのグループです。安定した表現型を示すヒト肝細胞の長期培養のためのポリウレタンコーティング表面の最適化における最近の進歩が紹介され、議論されています。

Introduction

生物学的材料は、広く、多能性幹細胞¹の維持および分化に使用されている。可能にしながら、これらの生物学的基質は、多くの場合、未定義の構成要素の無数が含まれています。マトリゲルは、幹細胞の培養および分化のための一般的に使用される基板である。残念ながら、その可変組成は、細胞の機能および表現型に影響を与える。代替、複数の定義された生物学的マトリックスの多様^2-7使用されてきたが、それらの動物由来または貧弱な拡張性は、彼らに工業的な製造には適さない候補にする。したがって、定義された組成と信頼できる性能を有する合成代替物の同定は、幹細胞研究の重要な目標である。

未定義の細胞培養基質の制限を克服する試みにおいて、化学と生物学との間の学際的コラボレーションは、細胞表現型をサポートする能力を有する合成材料を同定した。シンセエティックな基板は、スケーラブルであり、費用対効果、および複雑な3次元構造に製造することができ、 生体内環境を模倣する。によるこれらの特性に合成基質は、広く多くの細胞型^8-10の分化を支持し、駆動するために使用されてきた。

Advancedおよびハイスループットアッセイは、大規模なライブラリーから、合成材料の迅速なスクリーニングを容易にし、生物医学の研究開発^11-13の幅広いアプリケーションとの柔軟な特性を有する新規材料を提供してきました。高いスループットを利用して、高分子マイクロアレイスクリーニング技術は、急速にヒト幹細胞由来の肝細胞の維持に適した単純なポリウレタン（PU134）を同定した。このポリマーは、肝細胞の分化および機能^14-16に関して動物由来の基質よりも優れていることが判明した。私たちは、その後の効果をアクセスするための塗布条件、地形や滅菌プロセスを最適化した肝細胞機能と寿命を安定化するポリマーの性能に。これは、セルベースの​​モデリングと再生医療アプリケーションのための肝細胞生物学の基礎を理解することに関して重要な意味を持っている。

ここで説明する技術は、合成ポリマーの表面が細胞表現型を維持するために最適化することができる方法の例を示している。私たちは、効率的な無血清肝細胞分化プロトコルでこの技術の組み合わせは、 インビトロモデリングや再生医療で使用するための肝細胞のスケーラブルな生産を提供する可能性を持っていることを信じています。

Protocol

PHNGAD（ポリ[1,6-hexanodiol /ネオペンチルグリコール/ジ（エチレングリコール）-alt - アジピン酸]ジオール）の合成

スキーム1：PHNAGDの合成 PHNAGDの合成の模式図。。 PHNAGDは、1,6 - Hexanodiol、ジエチレングリコール、neoppentylグリコールとアジピン酸との反応により調製した。 PHNAGD、ポリ[1,6-hexanodiol /ネオペンチルグリコール/ジ（エチレングリコール）-alt - アジピン酸]ジオール。

1. 残留水を除去し、真空オーブン中で48時間40℃でのモノマー1,6 - ヘキサンジオール、ジ（エチレングリコール）及びネオペンチルグリコールに熱処理を適用する。真空下で室温まで寒さにできるようにします。
2. 二口丸底フラスコに攪拌棒を備えたディーン·スターク装置に接続する各モノマーの22ミリモルを加え、アジピン酸（55ミリモル）を加えた。
3. 真空下でアセンブリ全体を置き、静かにGLAを加熱フラスコ中の化学物質の添加中の任意の吸湿を避けるために、6時間40℃でssware。
4. 、一滴ずつ、シリンジを介して追加の触媒チタン（IV）ブトキシドの0.0055モル。
5. 24時間N ₂雰囲気下、180℃で反応混合物を撹拌し、そしてディーン-スタークトラップに残留水を集める。製品が室温まで冷却させる。

PU134の2の合成

スキーム2：PU134の合成 PU134は、4,4 ' -メチレンビス（フェニルイソシアネート）の2.0当量とPHNGADの1.0当量との反応により調製されたポリウレタン134の合成の略図、1.0を添加した。 1,4 - ブタンジオール連鎖延長剤の当量。

1. 4の2当量とポリオールPHNGAD 1当量の量（Mn〜1,800ダルトン、3.2ミリモル）を混ぜ無水N 4 ' -メチレンビス（フェニルイソシアネート）（6.4ミリモル）、Nジメチルホルムアミド（12 ml）を加えた。
2. N ₂雰囲気下、70℃で反応混合物を、攪拌する。
3. 触媒チタン（IV）ブトキシド（0.8％重量）を一滴ずつ、シリンジを介して追加します。
4. 1時間後、鎖延長剤1,4 - ブタンジオール（3.2ミリモル）の1当量を加える。 90℃に温度を上昇させ、N ₂雰囲気下で24時間撹拌した。
5. 反応後、沈殿が生じるまで反応溶液に滴下し（ヘキサンまたは水を使用することもできる）のジエチルエーテルを加えて沈殿させることによりポリウレタンを収集する。
6. 5分間5,300×gで解決策を遠心。
7. 上清を除去し、溶媒が蒸発するまで、真空オーブンで40℃で乾かす。
   注するために、反応の最終生成物は、分子量分布に関する適切なパラメータを有することを確実にするために、機能的grouポリマー、溶融およびガラス転移温度のpsが、さまざまな分析技術および方法は、ゲル浸透クロマトグラフィーまたはFITR分光法を用いることができる。

PU134ソリューションの調製

1. ガラス瓶にPU134を200mg秤量する。
2. クロロホルム、1クロロホルムとトルエンの組み合わせ：1の比率、テトラヒドロフラン、及び1テトラヒドロフラン及びdicloromethaneの組み合わせ：1の比の溶媒の数が2％の最終濃度にPU134を希釈する。
   注：右の溶媒の選挙は、使用するポリマーに応じて変化する。異なる溶媒は、ポリマーの可溶化に影響を与えることができる異なる沸点を有する。
3. 溶液が均一になり、沈殿物が観察されなくなるまで、200 MOT /分の速度でシェーカーを用いて室温で20分間溶液を激しく振る。

PU134とスライドガラスの4。塗装

1. ROUを配置スピンコーター上のND 15ミリメートル²カバースリップ。
2. ピペットを用いて各PU134溶液50μlを適用します。比に比例表面ボリュームを保つ必要なカバーガラスサイズに応じてPU134溶液の量を調整します。
3. 23 x gで7秒間、各カバースリップスピン。
4. 滅菌前に少なくとも24時間、室温で空気乾燥カバースリップ。

カバースリップの5。照射

1. 12分間実験室の照射装置を用いて10グレイの線量を適用することにより、ポリマーで被覆されたカバースリップをガンマ - 照射する。
2. UV-16分間、30 W、UV電球の各側面を用いてポリマーコーティングされたカバースリップを照射する。
3. スライドのサイズに応じて適切な組織培養プレートにポリマー被覆カバースリップを置きます。

6。走査型電子顕微鏡

1. 圧力5×10 ^-1ミリバールの雰囲気下で200秒間スパッタリングによる金コートポリマーカバースリップ。
2. マイクログラムをキャプチャ二次電子撮像モードで20kVの加速電圧での走査型電子顕微鏡を用いてポリマーコーティングされたカバースリップのraphs。

7。原子間力顕微鏡の観察

1. ポリマー表面の20×20μmの領域をスキャンします。
2. 1.32ヘルツから1.60 Hzのスキャンレートを設定します。
3. スキャンされた領域内の512×512ピクセルの解像度を設定します。
4. 平均画像データプレーンから採取した高さ偏差の平均値を用いて、コーティングの平方根（RMSまたはさRq）の平均平方根を計算し、のように表さ。
   
   Ziが現在のZ値であり、Nは、所定の領域内の点の数である。
5. 7.5偏差を計算し、または使用して、画像の表面粗さ（Ra）を意味し、
   
   Z（x）はtで記述する関数である。彼は、高さ（Z）と評価長さ "L"を超える試料の位置（x）に関して分析プロファイル表面。 Raは中心面に対する表面の平均値を表す。

8。細胞培養および分化

1. 文化·ヘイ¹⁷で説明したようにヒト胚性幹細胞株（ヒトES細胞）H9を区別。
2. 解離試薬を用いて細胞を外し、Szkolnicka ^18,19で説明するように、無血清培地の存在下で、分化過程の9日目でPU134被覆スライドにドラッグreplate。
   注：酵素的細胞解離の使用は物理的な細胞剥離に好適である。

9チトクロームP450機能アッセイ

1. 製造者の指示に従ってCYP3A活性を測定する。
2. 細胞なしのhESCに由来する13日目または19日目での肝細胞、およびメディアをインキュベート - ネガティブコントロールとして、適切なSUBSTRで37℃で5時間食べた。
3. 、細胞および培地からの上清を回収し、製造業者の指示に従ってアッセイを実施しています。
4. 表面積（cm ^2）でのCYP活性と正規化のレベルを測定する。

10免疫染色

1. PBSで洗浄するのhESC派生肝細胞は、1分間、2回繰り返す。
2. 10分間、-20℃での氷冷100％の細胞を固定するために、メタノール、場所を追加します。
3. 5分間のPBSで細胞を洗浄し、二回繰り返します。
4. RTで1時間PBS / T（0.1％トゥイーン）/ 10％BSAで細胞をインキュベートする。
5. PBST液を吸引し、PBS / T（0.1％トゥイーン）/ 1％BSA中に希釈した適切な一次抗体を追加し、穏やかに撹拌し、O / N、4℃でインキュベートする。
6. 5分間のPBS / T（0.1％トゥイーン）/ 1％BSAで細胞を洗浄し、三回繰り返して。
7. ％のBSA / 1×PBS / T（0.1％トゥイーン）中で適切な抗体を希釈し、細胞に追加し、穏やかに撹拌しながら室温で1時間、暗所でインキュベートする。。
8. 5分間のPBSで細胞を洗浄し、3回繰り返します。
9. 各ウェルに、気泡の数を減らすために穏やかにカバースリップを追加し（千DAPI 1を含む）MOWIOL 488を追加する。暗闇の中で4℃で保存固定した細胞。適切なフィルターと蛍光灯顕微鏡を用いて染色し観察します。最適化された一次および二次抗体は、 表1に記載されています。

Results

ポリマー溶媒は、ポリマーコーティングされた表面の形状に影響を与える

ポリウレタン134は、トルエンまたはテトラヒドロフランまたはジクロロメタンとの単独または組み合わせのいずれかで、クロロホルムに溶解し、ガラススライドは、異なる製剤でスピンコートした。走査電子顕微鏡（SEM）および原子間力顕微鏡（AFM）は、ポリマーコーティング（ 図1）の物性を特徴付けるために使用された。トルエンやクロロホルムを使用して得られたコーティングは、PU134沈殿（ 図1A）で塗布ムラを実証する、均質ではなかった。対照的に、テトラヒドロフラン、はるかに均一な表面のスピンコーティングが可能な適切な溶媒（ 図1A）であった。表面形状は、正方形（RMS）と、平均粗さ（Ra）が平均平方根を用いてAFMにより測定した。 PU134溶解テトラヒドロフラン目と比較して粗さの40％の減少を示したE他の溶媒（ 図1Bおよび1C）。

Discussion

幹細胞から肝細胞を生成するために使用される現在の方法の多くは、動物由来の未定義のマトリックスに依存している。これらの基板は、アプリケーションに重大な障壁を表す、細胞の機能および安定性に影響を与える、費用がかかり、非常に可変であることができる。そこで、幹細胞由来肝細胞の培養を支持する合成材料のためのスクリーンを行った。私たちは、同定した、堅牢な肝細胞分化アプローチと組み合わせてPHNGAD、MDIおよびエクステンダー、それを重合して形成された単純なポリウレタン（PU134）は、肝細胞の表現型を安定化し、マトリゲル¹⁵と比較して細胞の機能を改善する。

一般的に培養に使用される生体マトリクスを、既存およびビトロネクチン^22、ラミニン521 ²³またはマトリゲルのような幹細胞を分化の取扱いは、短期的なメンテナンスのために効果的である。対照的に、PU134コーティングされた表面は、hepatocy優れた基板を提供TE文化。また、表面形状及びポリマー殺菌の最適化は、電池性能、信頼できる性能とスケールでヒト肝臓モデルを提供する上で...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ポリマーPU134コーティングカバースリップの合成、調製、コーティング、および特性評価
	Shaker Edmun Bühler	KS-15
照射器	CIS Biointernational	IBL 637
スピンコーター	スペシャルティコーティングシステム	P-6708
走査型電子顕微鏡	フィリップス	XL30CPSEM
原子間力顕微鏡	DimensionV ナノスコープ、VEECO
p4-GLO CYP3A4	Promega	V8902
UV 電球	ESCO
NanoScope 分析ソフトウェア	VEECO		バージョン 1.20
蛍光顕微鏡	オリンパス	TH45200	Volocity 4 ソフトウェア
組織培養プレート	コーニング、英国	3527
スライド科学	研究所用品	MIC3308
ジエチレングリコール	シグマ–Aldrich	93171
1,6-ヘキサンジオール	シグマ–アルドリッチ	240117
ネオペンチルグリコール	シグマ–アルドリッチ	408255
アジピン酸	シグマ–Aldrich	9582
無水N,N-ジメチルホルムアミド	シグマ–アルドリッチ	227056
ジエチルエーテル	シグマ–アルドリッチ	676845
チタン(IV)ブトキシド	シグマ–アルドリッチ	244112
1,4-ブタンジオール	シグマ–Aldrich	493732
真空オーブン	Thermoscientific
4,4'-Methylenebis (フェニルイソシアネート)	Sigma –アルドリッチ	101688
テトラヒドロフラン	シグマ–Aldrich	401757
スパッタコーター	Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2)	Gibco	10010031	室温で保存
PBST, PBS 0.1% TWEEN 20	サイエンティフィック・ラボラトリー・サプライズ・リミテッド	EC607
メタノール	Scientific Laboratory Supplies Ltd	CHE5010
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich, UK	A7906
MOWIOL 488 DAPI	Calbiochem	475904	メーカーの指示に従ってトリスHClとグリセロールで構成
Cell culture and Functional assayCYP3A activity pGLO kit Promega V8902
ヘパトチーム	Gibco	17705021
TryLE express	Life Technologies	12604013